蛋白质序列

蛋白质序列（精选十篇）

蛋白质序列 篇1

蛋白质是一种由20种L-型α-氨基酸通过α-碳原子上的取代基间形成的酰胺键连成的具有特定空间构象和生物功能的肽链构成的生物大分子。氨基酸是带有氨基的有机酸, 它由一个氨基、一个羧基、一个氢原子和一个氨基团组成。在蛋白质合成时, 一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基连接起来形成肽键。

蛋白质一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置, 靠共价键维持多肽链的连接, 而不涉及空间排列, 是一个无空间概念的一维结构。测定蛋白质的一级结构具有重要意义, 蛋白质中氨基酸的序列分析时判断蛋白质三维结构的前提。许多遗传性疾病也都是由于蛋白质中个别氨基酸的突变造成的, 所以氨基酸序列分析对疾病的诊断和治疗有重要意义。

通过比较蛋白质的一级结构, 也就是将新测定的蛋白质一级结构与已知的蛋白质氨基酸序列进行比较, 可以预测蛋白质的功能, 并对分析研究这些蛋白质以及它们存在的生物体之间的进化关系有非常重要的关系。

2. 蛋白质双序列比对方法

2.1 序列比对实例

先观察两段蛋白质序列, 上为待检序列, 下位目标序列:

如果两序列中的两个氨基酸残基比对成功则计为1分, 则上面比对为6分。接着向右移动待检序列将移动后的序列与目标序列比对, 直至移动到最后一个位置。然后同理移动目标序列, 直至所有情况都比对完。

对于两个长度为n的序列, 按如上方法共有

这是一个指数级复杂度的计算问题。

我们再仔细观察以上比对, 发现如果在目标序列的第7位插入一空位, 那么则除了一位不匹配以外, 其他完全匹配, 其计分为9。

空位的引入有其生物学的依据, 它意味着两条序列有残基的插入或缺失。当然如果引入的空位的数目不加以限制, 即使联配得分再高那也可能没有生物学意义。因此必须对空位进行罚分, 罚分包括起始空位罚分和延伸空位罚分, 通常起始空位罚分较大, 而延伸空位罚分较小。通常采用线形或仿射罚分函数, 即r (g) =-gd或r (g) =-d- (g-1) e, 其中d为初始罚分, e为延伸罚分, g为引入空位数目。

2.2 计分矩阵

2.2.1 PAM计分矩阵

当双序列比对时, 我们将匹配的残基对计为1, 不匹配的计为0, 这种计分方式我们把它称为一致计分矩阵。这种计分矩阵非常简单, 但是它忽略了蛋白质的进化和结构信息。

Dayhoff等人对进化过程中氨基酸彼此间的替换做了详细的频率研究, 于是产生了一个在短的进化过程中氨基酸彼此间替换的相对频率表, 称为单点可接受突变 (point accepted mutation, PAM) 计分矩阵。它取1个蛋白质序列中的氨基酸突变1%作为进化距离的单位, 称之为一次PAM。Dayhoff等人手工比较了当时数目有限的同源蛋白质序列, 并用统计方法得到对应1次PAM矩阵的数据。

将1次PAM矩阵自乘多次, 可以得到进化距离较远的矩阵, 低号的PAM矩阵可用于进化进化距离较近的亲缘关系, 而亲缘关系较远的可以用更高号码的矩阵。常用的PAM250计分矩阵, 相当于两条序列仍然有20%的相同残基。

2.2.2 BLOSUM计分矩阵

不少情况下PAM计分矩阵可能失效, 因为其进化距离较远的矩阵是推算出来的而不是直接计算得到的, 其准确率受到一定限制, 这就需要使用新的计分矩阵。BLOSUM矩阵是由Henikoff首先提出的另一种氨基酸替换矩阵, PAM矩阵是从蛋白质序列的全局比对结果推导而来的, 而BLOSUM是从蛋白质序列块 (短序列) 比对而推导出来的。然而BLOSUM矩阵号数的意义与PAM相反, 低号BLOSUM矩阵适合用来比较亲缘关系较远的序列, 而高号BLOSUM用来比较亲缘关系较近的序列。常见的BLOSUM62矩阵可用来比较大约有62%相似度的序列。

2.3 Needleman-Wunsch算法

Needleman-Wunsch算法是基于动态规划的全局比对算法。对于长度分别为m和n的两个序列S和T, 构造矩阵, 构造mn矩阵, 假设序列S放在上面, 序列T放在矩阵左边, 并使用BLO-SUM50计分矩阵, 空位罚分取d=8的线形罚分函数r (g) =-gd。σ (i, j) 表示矩阵中的第i行, 第j列元素的最优匹配得分, 其中σ (00) =0, σ (i, 0) =-id, σ (0, j) =-jd。

用动态规划的方法建立计算σ (i, j) 的公式 (1) 如下:

公式 (1) 中的s (i, j) 这里代表两个氨基酸残基的比对得分, 可从BLOSUM50表中获取。由公式 (1) 得出表11的最优联配得分矩阵。 (如表1)

σ (m, n) =1是这两条氨基酸序列的总得分。接下来我们要做的就是从最右下角的单元回溯, 找到最优联配结果。通过得分矩阵进行动态规划回溯法获得相似性比较的算法如下:

其中insert (a, b, c) 函数表示在一个序列b的第c个位置插入一个字符a, 符号'-'代表空位。

最终的联配结果如下:

3. Smith-Waterman算法

Smith-Waterman算法是基于局部联配的动态规划方法, Needleman-Wunsch适用于整体水平上相似度较高的两个序列。如果两个序列的亲缘关系较远, 它们在整体上可能不具有相似性, 但在一些较小的区域上却可能存在局部相似性。Smith-Waterman算法是序列局部比对算法的基础。它的思想与Needleman-Wunsch基本相似, 区别有以下几点:

1) 不需设置负分, 因为两个零长字符串即为得分为0的局部比对, 这一事实表明在构建局部比对时, 不需要使用负分, 所以σ (0, 0) =0, σ (i, 0) =0, σ (0, j) =0。那么求解σ (i, j) 的动态规划算法的公式改为如下

2) 矩阵中每个单元均可以是比对结果序列片段的终点, 于是回溯的时候应该从得分最大的元素开始回溯。

最终的联配得分矩阵如表22所示

根据表2我们得到最优局部联配为

4. 算法改进--寻找所有最优比对

Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法在寻找最优比对的时候未考虑存在多种最优联配的情况。例如在回溯过程中有可能M[i][j]==M[i-1][j-1]+s (i, j) 同时M[i][j]==M[i-1][j]+d, 但算法中只取一种匹配情况。

为了遍历所有路径, 本节中提出了使用链队列结构的方法, 具体思路如下:

1) 从单元 (i, j) 出发开始回溯, 将单元 (i, j) 作为树的根结点

2) 判断单元 (i, j) 结点可以由 (i-1, j-1) , (i-1, j) , (i, j-1) 单元中的哪些生成, 如果只有一个单元可以到达 (i, j) , 那么将其作为 (i, j) 的孩子, 然后对 (i, j) 的孩子重复第二步;否则则将所有可以到达的单元 (i, j) 都作为 (i, j) 的孩子, 并将所有孩子入队列, 然后对队列中的单元依次重复步骤2) 。

当遍历完成后, 所有路径都已存储在树中。

5. 基于Needleman-Wunch算法或Smith-Waterman算法的双路并行算法

Needleman-Wunch算法和Smith-Waterman算法的大部分时间花销在于构造联配得分矩阵, 本节中提出了一种双路并行的算法可以将此算法提高一倍。

观察初始得分矩阵可知, 当单元 (i, i) 计算出来后, 那么它所在的一行, 一列可以同时计算出来, 于是我们可以设计两个并行块, 一块专门计算行, 一块专门计算列, 并利用多处理器或者多核处理器实现并行计算。

6. 结束语

蛋白质双序列比对的算法很多都基于基于NeedlemanWunch算法或Smith-Waterman算法所做的改进, 本文在执行效率和遍历方法上对算法进行了些改进。

摘要：Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法是蛋白质序列比对的两种重要方法, 根据实际需要选择不同的计分矩阵和算法可以达到较好的比对结果。但这两种算法有其缺陷, 本文在此两种算法的基础上提出以链队列的形式遍历所有最优匹配的算法, 并优化了得分矩阵的计算方法, 提出双路并行计算得分矩阵的方法。

关键词：PAM250,Needleman-Wunsch算法,Smith-Waterman算法,双路并行

参考文献

[1]蔡禄著.生物信息学教程[M].北京:化学工业出版社, 2007

蛋白质序列 篇2

蛋白质序列中的关联规则发现及其应用

随着蛋白质序列-结构分析中使用的`机器学习算法越来越复杂,其结果的解释和发现过程也随之复杂化,因此有必要寻找简单且理论上可靠的方法.通过引入原理简单、理论可靠、结果具有很强实际意义的关联规则发现算法,找到了蛋白质序列中数以万计的模式.结合实例演示了如何将这些模式应用于蛋白质序列分析中,如保守区域发现、二级结构预测等.同时根据这些结果构建了一个二级结构规则库和一种简单的二级结构预测算法,实验结果表明,约81%的二级结构可以由至少一条关联规则预测得到.

作 者：作者单位：刊 名：生物物理学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA BIOPHYSICA SINICA年，卷(期)：22(3)分类号：Q5关键词：蛋白质序列 关联规则 二级结构预测 模式发现

蛋白质序列 篇3

关键词：猪源偶发分枝杆菌；katGI基因；克隆；序列分析

中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0093-2

上个世纪中期以前，非结核分枝杆菌被认为是不致病的，没有引起人们的关注。但随着艾滋病（AIDS）的出现以及临床滥用抗生素和免疫抑制剂等药物，造成患者免疫力下降和强耐药性菌株的不断出现，偶发分枝杆菌（M.fortuitum）等非结核分枝杆菌感染病例的报道日渐增多[1]。研究表明，M.fortuitum与抗生素的滥用有关，且具有极强的适应性，具有变异的可能性，因此，一般检测方法不能检出，普通抗菌药物也不能有效治疗，这给人类的健康造成了严重的困扰。本研究对长春地区正常屠宰的猪体内分离出的M.fortuitum核酸修复蛋白基因（recA）基因进行了克隆并分析其序列，旨在为M.fortuitum的药物开发研究和感染后治疗提供基础分子生物学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

猪偶发分枝杆菌菌种来源于吉林农业大学动物科技学院实验室保存菌种；扩增菌种用培养基为自行配置的改良罗氏培养基；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Buffer为天津天根生化科技（北京）有限公司产品；pGM-T载体、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligation Buffer、2×T4 DNA Ligation Buffer、TOP10感受态细胞、核酸分子量标准D2000及DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒等为天津天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取 将猪源偶发分枝杆菌接种于改良罗氏培养基中培养，一周后刮取适量菌体在TE中混匀后用玻璃棒法提取染色体DNA，测OD值和电泳确定所得核酸质量符合实验要求。

1.2.2 引物的设计与合成 由于实验室保存的M. fortuitum菌株没有全基因序列信息，引物设计时考虑使用GeneBank中的标准菌株基因序列。查《伯杰细菌鉴定手册第九版》得M.fortuitum标准菌株为ATCC6841，查GeneBank得ATCC6841的recA基因序列登录号为AY458087.1。据此设计非特异性引物如下：recA-F：CCCGAGTACGCCAAGAAGC；recA-R：CCGTCACGACAGCACCGATA。此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 基因的扩增 以猪源M. fortuitum染色体DNA为模版，以recA-F和recA-R为引物进行基因的扩增。PCR反应体系（总体积20μl）包含灭菌双蒸水14.4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 1.6μl，模版DNA 1μl，上下游引物（10mmol/μl）各0.5μl, Taq DNA Polymerase（5U/μl）0.2μl。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。反应结束后，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 扩增产物的纯化 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳切胶后用天津天根生化科技（北京）有限公司DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作方法按产品说明书进行。

1.2.5 基因的连接与转化 按照pGM-T连接试剂盒说明书要求将纯化的扩增产物与载体在连接酶的作用下16℃连接过夜，再取连接产物与TOP10感受态细胞按1：10转化，并将转化后菌液用无抗LB培养基复苏后涂布到用IPTG(50mg/ml)和X—gal(20mg/ml)处理过的Amp+(0.1mg/ml) LB平板上，干燥后37℃倒置培养过夜。

1.2.6 重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种于Amp+ LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，保存菌种后进行PCR菌检、提取质粒PCR检测和双酶切鉴定插入片段是否正确。

1.2.7 重组质粒的序列分析 取鉴定为阳性的菌液送北京华大六合基因科技股份有限公司进行测序，并对测序结果用BLAST进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 基因的扩增

以猪源M. fortuitum染色体DNA为模板recA-F和recA-R为引物对recA基因进行PCR扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000bp长度的条带，与目的片段长度相近。约1500bp和约600bp处出现的为杂带，此为引物设计特异性不高所致，同时有少量引物二聚体出现（见图1）。

图1 M.fortuitum recA基因扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳

2.2 重组质粒的鉴定

圖2：M.fortuitum recA基因重组质粒鉴定电泳（1%琼脂糖凝胶）

经过纯化的katG I基因扩增产物与pGM-T载体连接，构建重组质粒pGM-T-recA，通过蓝白班筛选、PCR菌检以及序列分析等方法鉴定重组质粒。其中通过PCR鉴定，可见到约1000bp的单一条带（见图2）。

2.3 基因的序列分析

将鉴定为阳性的重组质粒送北京华大六合基因科技股份有限公司进行测序，测序结果表明，所克隆的目的基因大小为1167bp，利用BLAST分析发现，所得基因与GeneBank中偶发分枝杆菌的recA基因AAS16318.1、AAP49236.1的序列相似度均为100%，由此确认此次扩增并克隆的产物为偶发分枝杆菌recA基因序列。

同时，根据BLAST结果还显示该序列与AAS16329.1（M.porcinum）、AAP49244.1（M.porcinum）、CAM07029.1（M.sp.MHSD11）同源性亦达100%，与M.album, M.aubagnense, M. aurum, M.avium, M.avium sp. avium ATCC 25291, M.avium sp. paratuberculosis K-10, M.chelonae, M.gadium, M.goodii, M.gordonae, M.houstonense, M.immunogenum, M.intracellulare ATCC 13950, M.jacuzzii, M.kansasii ATCC 12478, M.mageritense, M.marinum, M. mucogenicum, M.neworleansense, M.peregrinum, M.phlei, M.porcinum, M.scrofulaceum, M.septicum, M.simiae, M.smegmatis, M.sp.ATCC 35788, M.sp.MCS, M.szulgai, M.ulcerans Agy99, M.wolinskyi的同源性均在92%以上，可见该基因在分枝杆菌属内是十分保守性的。

3 讨论

M. fortuitum为条件致病菌，本菌广泛分布于各种水体、尘埃、土壤和动物体内。在分类学上隶属于裂殖菌纲（Schizomycetes）、放线菌目（Actinomycetales）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）、分枝杆菌属（Mycobacterium）。在Bergey细菌系统手册(1986)中，偶发分枝杆菌分为两个亚种，即偶发亚种（M.fortuitum sp fortuitum)和外来亚种（M.fortuitum sp peregrinum)。在前人的研究中，由于代谢特征和临床特征的原因，偶发分枝杆菌与龟分枝杆菌（M.chelonae）的两个亚种龟亚种和脓肿亚种难以区分，故统称为龟-偶发复合分枝杆菌（M.chelonae-M.fortuitum complex）。但后来的研究发现两者分子生物学和物理化学特性完全不同[2]。

M.fortuitum隶属于非结核分枝杆菌，过去曾被认为属于非致病性分枝杆菌，但是后来的事实表明，在人类或动物体的免疫力下降时，很多过去认为的非致病菌变成了致病菌。同时人们还发现，在大量使用抗菌药物后，部分细菌发生了变异，由非致病菌变成了致病菌。研究表明，M.fortuitum就具有极强的变异性。近年来就不断有M.fortuitum的病例出现。福建省南平市杨建等报道了39例患者因该市某基层诊所消毒不严格引起M.fortuitum感染[3]，北京协和医院王澎等从1例外科手术导致心内膜炎患者的血液和骨髓中分离出M.fortuitum[4]。蔡林等曾报道一例因长期饲养猪，疑似由外伤引起的M. fortuitum感染的病例[5]。

RecA蛋白是recA基因座的产物，在ATP存在的情况下，可沿着5’-3’方向结合在单链DNA上形成一种延长的右手螺旋DNA-蛋白质的复合物，来保护DNA不被核酸酶降解。该蛋白还可寻找和催化具有同源序列的DNA进行同源配对和修复。同时，RecA蛋白还能激活蛋白酶活性来控制SOS反应。

本研究以猪源M.fortuitum染色体DNA为模板，以引物recA-F和recA-R扩增recA基因．选用pGM-T载体成功克隆了猪源M.fortuitum RecA基因，经序列分析发现该基因在分枝杆菌属内部是十分保守的，这为进一步研究猪源M.fortuitum recA基因进行检验检疫和药物开发及预防治疗研究奠定了分子生物学基础。

参考文献

[11] 付素兰,任天红,刘景武,等.腹腔镜术后偶发分枝杆菌感染1例[J].河北医科大学学报,2008,29(4):622-623.

[2]黄梁浒,王德春,朱忠勇.偶发分枝杆菌的感染与实验研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(3):

148-149.

[3] 杨健,卢林琪,杨顺泰.偶发分枝杆菌医院感染39例报告[J].中华医院感染学杂志,2000,10(6):427.

[4]王澎,徐英春,张小江.心脏外科手术继发偶发分枝杆菌心内膜炎一例[J].中华检验医学杂志2005,28(3):336.

[5] 蔡林,宋英,张建中.龟分枝杆菌和偶發分枝杆菌皮肤感染[J].临床皮肤科杂志,2006,35(8):519-520.

作者简介：赵雪峰（1979-），男，江苏淮安人，吉林农业大学生物化学与分子生物学专业在读硕士研究生，研究方向：免疫分子生物学。

蛋白质序列 篇4

外膜蛋白与布鲁氏菌的胞内生存有关,涉及侵袭、胞内迁移、复制等很多方面,对维持细胞结构稳定、抵御宿主细胞免疫杀伤有重要作用。外膜蛋白Omp25 是布鲁氏菌入侵宿主细胞初期在酸性介质环境中释放的一种蛋白,是布鲁氏菌的重要毒力因子[4]。该蛋白可以引发孕畜流产[5],缺失Omp25 基因的布鲁氏菌致病力下降,且能够保护宿主免受布鲁氏菌的感染[6]。Omp25 蛋白具有良好的抗原性,能够诱导小鼠产生免疫反应,使其对布鲁氏菌具有抵抗作用[7,8]。试验对9 株黑龙江省布鲁氏菌分离株的Omp25 基因进行了扩增和测序,与参考毒株进行了序列比对,比较其同源性和亲缘关系,并分析了Omp25 基因编码蛋白的结构特点,为进一步的流行病学调查和蛋白功能研究提供参考。

1 材料

1. 1 试验所用细菌

9 株布鲁氏菌HLJ - 1、HLJ - 2、HLJ - 3、HLJ - 4、HLJ - 5、HLJ - 6、HLJ - 7、HLJ - 8 和HLJ - 9 是从流产牛羊胎儿内脏和血清学检测阳性牛的乳汁中分离培养得到。

1. 2 试剂

Taq DNA聚合酶、d NTPs、10 × PCR Buffer、DL -2 000 Marker,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司;琼脂糖凝胶及胶回收小量提取试剂盒,购自Promega公司; 细菌基因组DNA提取试剂盒,购自天根生化科技有限公司。

1. 3 参考菌株及登录号

参考菌株及Gen Bank登录号如下: 牛种布鲁氏菌B. abortus ( 登录号为CP007682、CP009098、X79284) ,羊种布鲁氏菌B. melitensis ( 登录号为JF918759、KJ720201、KJ720202、NC _017246 ) ,猪种布鲁氏菌B. suis( 登录号为BSU39397、CP007717) ,犬种布鲁氏菌B. canis( 登录号为BCU39358) ,沙林鼠种布鲁氏菌B. neotomae( 登录号为BNU39359) 。

2 方法

2. 1 引物的设计与合成

根据Gen Bank中登录的Omp25 基因序列,在其编码区两侧,用Primer Premier 5. 0 设计上、下游引物,预计扩增片段长度大约为680 bp。序列为: 上游引物P1 5' - aatttgtgtaaggagaatgcc - 3',下游引物P25' - ccgtgtccaattatgctataa - 3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2. 2 菌株的培养与DNA样品的制备

将菌株接种于布鲁氏菌培养用胰蛋白胨液体培养基中,培养24 ~ 48 h后,取1m L培养物于1. 5 m L Eppendorf管中,80 ℃ 水浴15min灭活,按天根细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明提取DNA,再用TE缓冲液洗脱,将产物置于- 20 ℃保存,备用。

2. 3 PCR扩增

用提取的DNA做模板,以P1 和P2 为引物进行PCR扩增,反应体系如下: 10 × PCR Buffer 5 μL,d NTPs( 2. 5 mmol / L) 4 μL,Taq DNA聚合酶0. 5 μL,DNA模板4 μL,P1 和P2 ( 25 μmol / L) 各1 μL,用灭菌双蒸水补足50 μL。PCR反应参数为: 95 ℃预变性4 min; 94 ℃ 变性40 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸45 s,共35 个循环; 72 ℃ 延伸10 min。

2. 4 琼脂糖凝胶电泳、纯化与测序

取5 μL PCR产物加入1. 0% 琼脂糖凝胶中,150 V电泳15 min,在紫外凝胶成像系统下观察结果。用Promega胶回收小量提取试剂盒对阳性产物进行纯化,将纯化产物送宝生物工程( 大连) 有限公司进行测序。

2. 5 序列分析

应用DNAStar、DNAMAN、Signal4. 1、TMHMM等软件和工具对Omp25 基因核苷酸序列及推导氨基酸序列进行同源性比较、进化树绘制和蛋白结构分析。

3 结果

3. 1 PCR扩增结果

参照已发表的Omp25 基因序列设计扩增该基因的特异性引物,对分离株DNA样品进行PCR鉴定,结果在约680 bp处呈现单一条带( 见图1) ,扩增片段大小与预期相符。

M.DL-2 000 Marker;1~9.Omp25基因扩增片段;10.水对照。

3. 2 Omp25 基因序列同源性和进化树分析

通过序列测定获得的Omp25 基因的核苷酸序列长度为642 bp,编码213 个氨基酸。经计算机软件分析,结果表明: 9 个菌株之间的OMP25 基因核苷酸序列同源性在98. 4% ~ 100% 之间( 见图2) ,其中HLJ- 5 株与其他8 个菌株之间的核苷酸同源性为98. 4% ~ 98. 6% ,其他8 株之间的核苷酸同源性为99. 5% ~ 100% 。9 个菌株与参考毒株之间的核苷酸同源性在98. 4% ~ 99. 8% 之间。与其他种的参考毒株相比,HLJ - 5 株与羊种布鲁氏菌参考毒株核苷酸同源性最高( 99. 5% ~ 99. 8% ) ,除HLJ - 5 以外的8株与牛种布鲁氏菌参考毒株核苷酸同源性最高( 99. 4% ~ 99. 8% ) 。

从推导的氨基酸序列同源性来看,9 个菌株之间的同源性在98. 6% ~ 100% 之间( 见图3) ,其中HLJ - 5 株与其他8 株之间的同源性为98. 6% ~99. 1% ,其他8 株之间的同源性为99. 5% ~ 100% 。9 个菌株与参考毒株之间的同源性在97. 7% ~ 100%之间,其中HLJ - 5 株与羊种布鲁氏菌参考毒株同源性最高( 100% ) ,其他8 株与牛种布鲁氏菌参考毒株同源性达99. 1% ~ 100% 。

同时从系统进化树上分析,布鲁氏菌分离株与参考菌株之间的亲缘关系较近,其中HLJ - 5 与羊种布鲁氏菌处于一个分支上,其他8 株与牛种布鲁氏菌处于一个分支上。

3. 3 Omp25 基因编码蛋白的生物信息学分析

信号肽位点预测结果表明,Omp25 蛋白有1 个信号肽识别位点,位于第14 ~ 35 位氨基酸,其剪切位点在第23 位与第24 位氨基酸之间( 见286 页彩图4) 。跨膜区预测结果表明,Omp25 蛋白具有1 个跨膜区,位于第6 ~ 23 位氨基酸( 见286 页彩图5) 。糖基化位点分析结果表明,未分析到潜在的N - 联糖基化位点,说明Omp25 蛋白是1 个非糖基化蛋白( 见286 页彩图6) 。

4 讨论

布鲁氏菌病是目前世界范围内流行最广和危害最大的人畜共患病之一,由布鲁氏菌引起,在我国的流行区域很广泛,尤其是畜牧业生产发达地区。自20 世纪90 年代起,该病在我国的发病率呈上升趋势,每年布鲁氏菌病患者可达数万人次,牛、羊、猪则有百万头之多,造成十几亿元的经济损失,严重危害人类健康和畜牧业发展[1,3,9]。

外膜蛋白Omp25 是布鲁氏菌重要的毒力因子,具有很好的免疫原性[10],编码该蛋白的Omp25 基因变异较小,绵羊附睾种布鲁氏菌Omp25 基因开放阅读框( ORF) 长606 bp,编码201 个氨基酸; 其他种布鲁氏菌的Omp25 基因ORF长642 bp,编码213 个氨基酸[11]。本试验中的分离株与参考毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性比较分析结果表明,Omp25 是一个较为保守的基因,在布鲁氏菌所有种之间的同源性高达98. 4% 以上,提示该基因可作为研发布鲁氏菌诊断试剂的靶基因。9 个分离株之间的同源性很高,其中HLJ - 5 株与羊种布鲁氏菌参考毒株同源性最高,其他8 株之间与牛种布鲁氏菌参考毒株同源性最高; 进化树分析也表明,HLJ - 5 株与羊种布鲁氏菌参考毒株亲缘关系较近,其他8 株与牛种布鲁氏菌参考毒株亲缘关系较近。初步推断HLJ - 5 株为羊种布鲁氏菌,其他8 株为牛种布鲁氏菌。

为了解Omp25 基因编码蛋白的特性,本研究还对其信号肽、跨膜区和糖基化位点等进行了分析,结果表明: 该蛋白第14 ~ 35 位氨基酸构成信号肽,其剪切位点在第23 位与第24 位氨基酸之间; 存在一个跨膜区,位于第6 ~ 23 位氨基酸; 没有潜在的N - 糖基化位点,推测不是糖基化蛋白。

本研究对布鲁氏菌外膜蛋白Omp25 基因进行了序列分析和蛋白结构分析,这对于探究黑龙江省布鲁氏菌流行情况具有重要意义,为进一步的流行病学调查和蛋白功能研究提供参考,为研发布鲁氏菌病的诊断试剂和疫苗奠定基础。

参考文献

[1]MEMISH Z A,BALKHY H H.Brucellosis and international travel[J].J Travel Med,2004,11(1):49-55.

[2]尚德秋.布氏菌病研究进展[J].中国地方病防治杂志,2004,19(4):204-212.

[3]金宁一,胡仲明,冯书章.新编人兽共患病学[M].北京:科学出版社,2007.

[4]CLOECKAERT A,VERGER J M,GRAYON M,et al.Molecular and immunological characterization of the major outer membrane proteins of Brucella[J].FEMS Microbiol Lett,1996,145(1):1-8.

[5]EDMONDS M D,CLOECKAERT A,HAGIUS S D,et al.Pathogenicity and protective activity in pregnant goats of a Brucella melitensis Delta omp25 deletion mutant[J].Res Vet Sci,2002,72(3):235-239.

[6]EDMONDS M D,CLOECKAERT A,ELZER P H.Brucella species lacking the major outer membrane protein Omp25 are attenuated in mice and protect against Brucella melitensis and Brucella ovis[J].Vet Microbiol,2002,88(3):205-221.

[7]BOWDEN R A,CLOECKAERT A,ZYGMUNT M S,et al.Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB/c mice of the 25-k Da major outer-membrane protein of Brucella melitensis(Omp25)expressed in Escherichia coli[J].J Med Microbiol,1998,47(1):39-48.

[8]GOEL D,RAJENDRAN V,GHOSH P C,et al.Cell mediated immune response after challenge in Omp25 liposome immunized mice contributes to protection against virulent Brucella abortus 544[J].Vaccine,2013,31(8):1231-1237.

[9]RUBACH M P,HALLIDAY J E,CLEAVELAND S,et al.Brucellosis in low-income and middle-income countries[J].Curr Opin Infect Dis,2013,26(5):404-412.

[10]CLOECKAERT A,VIZCAINO N,PAQUET J Y,et al.Major outer membrane proteins of Brucella spp.:past,present,and future[J].Vet Microbiol,2002,90(1/2/3/4):229-247.

蛋白质序列 篇5

人类RING型锌指蛋白DTX2的全长cDNA克隆与序列分析

鉴定了一个人类WWE与RING型锌指基因DTX2,位于人染色体7q11.23.通过RACE获得的全长cDNA显示,DTX2编码包含两个WWE区域与一个RING锌指区域的`蛋白.

作 者：作者单位：刊 名：华东师范大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF EAST CHINA NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：2006“”(4)分类号：Q785关键词：DTX2 WWE区域 Ring-锌指蛋白 cDNA 序列分析

蛋白质序列 篇6

2005年, 日本科学家Inoue在研究小鼠精卵融合的过程中, 发现了一种新的精子特异性膜蛋白, 它属于免疫球蛋白超家族, 并发现这种精子特异性膜蛋白在精卵融合过程中起关键作用。科学家以日本人祈求婚姻幸福的出云神社为这种蛋白质命名, 将其叫做“出云 (Izumo) ”蛋白质。Izumo蛋白质是精子独有的一种蛋白质, 而且存在于细胞体外, 因此还能够成为非激素类避孕药的标靶蛋白质。敲除精子上Izumo基因的雄性小鼠完全不育, 经过进一步的研究证实, 这些不育小鼠的精子虽然外观与正常精子相同, 而且也能够结合和穿过卵透明带, 但却完全丧失了与卵膜融合的能力[10]。这是科学家首次发现“Izumo”蛋白质, 其重要性相当于雄性配子的发现。目前, 已经在人、大鼠、小鼠的睾丸组织中成功地克隆出了Izumo的全长cDNA序列, 并且通过计算机基因预测系统在猩猩、猴、狗、牛等物种的基因组中也发现了编码Izumo蛋白的基因[11,12]。据此可知Izumo是广泛存在于哺乳动物精子表面的精卵融合关键蛋白。但在绒山羊上尚未见研究报道。本研究在绒山羊睾丸组织中克隆出了Izumo的部分序列, 为今后研究其蛋白功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及组织

4只成年雄性白绒山羊屠宰后, 立即采集睾丸组织, 使用液氮速冻后保存于-80℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂与工具酶

DNA Marker DL2000、DNA Marker III、TaKaRa LA Taq、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase Hˉ) 、限制性内切酶Hind III和Sac I、dNTP、oligo d (T) 18、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、pMD 19-T Vector购于宝生物工程 (大连) 有限公司, DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒购于Axygen公司, DEPC购自Sigma公司。

1.3 PCR引物的设计

根据GenBank中已公布的牛 Izumo mRNA序列, 利用软件Primer Premier 5.0设计一对PCR特异性引物。其引物序列为:上游引物5'- TTCGTGAAGGAGATGTTATGGATGT -3', 下游引物:3'-TGTCATAACGGGTTTTCTTAGGTCC -5', 引物由大连宝生物公司合成。

1.4 合成cDNA

1.4.1 睾丸组织总RNA的提取:

按照Trizol试剂提供的方法, 抽提公山羊睾丸组织的总RNA, 并检验其浓度和质量。

1.4.2 RT法合成cDNA第一条链:

以上述获得的公山羊睾丸组织总RNA为模板, 根据反转录酶Reverse Transcriptase M-MLV (RNase Hˉ) 的操作说明, 合成cDNA第一条链。

1.5 PCR扩增

以cDNA为模板, 使用自行设计的Izumo上下游特异性引物和TaKaRa LA Taq进行PCR反应, 预期扩增片段为484 bp。PCR反应条件为94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共30个循环。 阴性对照中不加反转录Reverse Transcriptase M-MLV ( RNase Hˉ) 酶, 其余步骤与实验组相同。PCR扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶进行电泳后, 在紫外凝胶成像系统中观察结果并照相。

1.6 克隆和鉴定

将经过凝胶回收试剂盒回收的PCR扩增产物, 按使用说明连接到pMD 19-T载体上。然后将连接产物转化TOP10感受态菌, 转化后涂于含Amp的固体LB培养板上, 37℃倒置培养16 h后观察转化菌的生长情况。在超净工作台中用接种环挑取转化菌板上的大小适中、白色单菌落接种于5 mL含有Amp的LB液体培养基, 置于37℃气浴摇床上摇菌12 h, 然后用Axygen公司的质粒小量制备试剂盒提取质粒DNA。

用限制性内切酶Hind III和Sac I来酶切鉴定阳性质粒DNA。酶切产物置于1%琼脂糖凝胶经电泳检测。根据电泳图片显示的结果, 初步认定目的片段已插入载体, 将重组质粒寄送宝生物工程 (大连) 有限公司进行测序鉴定, 验证连接片段的正确性。

2 结果

2.1 睾丸组织总RNA的检测

经用Trizol提取的睾丸总RNA在1%琼脂糖凝胶电泳结果 (见图1) , 显示的3条带分别为28S、18S和5S, 泳道内的3条带完整且无拖带, 表明抽提的质量较好。经紫外-可见光分光光度计测其浓度, 在260 nm的吸收值与280 nm的吸收值比值为1.87, 在1.8～2.0之间, 表明无蛋白和其他杂物污染。2.2 PCR扩增结果

以公山羊睾丸组织总RNA为模板, 依据GenBank中发表的牛 Izumo序列设计的一对引物, 进行RT- PCR扩增。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳时, 出现一条特异性区带, 位于相对分子量 (Mr) 标准500 bp附近, 与预期大小 (484 bp) 相符, 阴性对照无扩增产物出现 (图2) 。

M:DNA Marker DL2000;1:总RNA

M:DNA Marker DL2000;1:PCR产物;2:阴性对照

M:DNA Marker III;1:重组质粒;2:Hind III单酶切

2.3 重组质粒的克隆及鉴定

按文献[13]的方法, 扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳后, 切胶并使用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒回收扩增产物, 然后与pMD 19-T载体连接后获得阳性克隆, 用Axygen公司的质粒小量制备试剂盒提取其质粒DNA, 用限制性内切酶Hind III进行酶切后出现与目的片段和载体pMD 19-T Vector (2692 bp) 大小相符的条带 (图3) 。初步证实目的DNA片段已插入到T载体上。

2.4 重组质粒测序及序列分析

经酶切鉴定正确的重组质粒送往宝生物工程 (大连) 有限公司进行DNA序列测定, 结果发现送去的3个阳性克隆测序结果完全相同, 大小为484 bp (图4) 。应用BLAST软件与GenBank中发表的牛Izumo核苷酸序列进行同源性比较, 结果同源性可达98%。

3 讨论

精子与卵子质膜黏附并发生融合是哺乳动物完成受精过程所必需的步骤。近些年, 学者们以现代分子生物学理论为基础, 对参与精卵质膜黏附、融合过程的分子进行了研究, 特别是精子特异性膜蛋白Izumo, 它在精卵融合过程中起关键作用。

编码Izumo的基因目前已经在人、大鼠、小鼠的睾丸组织中被发现, GenBank中也公布了猩猩、猴、狗、牛等物种的编码Izumo蛋白基因的电子序列, 据此可以推断Izumo基因很有可能是一种广泛存在于哺乳动物中的一个保留基因。

蛋白质序列 篇7

关键词：RT-PCR,马铃薯Y病毒,序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是马铃薯病毒病发生并导致马铃薯严重退化的最主要病毒之一,它广泛存在于马铃薯种植区,其寄主有茄科、菊科以及豆科植物等,在马铃薯上可以引起严重花叶或坏死斑点和条纹,会导致马铃薯种薯质量下降,影响马铃薯产量,严重时可使马铃薯减产80%以上, 给马铃薯生产造成了巨大损失[1],同时也在全世界范围内造成了严重的经济损失。

PVY病毒是马铃薯Y病毒科(Potyviridae) 马铃薯Y病毒属(Potyvirius)的成员,其病毒粒子呈线状、弯杆形,大小730nm×11nm,呈螺旋对称,螺距34nm,颗粒含有 大约5% 的核酸和95%的蛋白质,血清学反应较明显。PVY病毒粒体含有约10kb的单链正义RNA基因组,通过对PVY全核苷酸序列进行分析得知,基因所编码的蛋白自5′端至3′端分别是辅助蛋白(HC)、胞质内含体蛋白(CI)、基因组连接蛋白、两个核内含体蛋白即蛋白酶和复制酶及位于3′非翻译区上游的外壳蛋白(CP),其中,CP蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,保守性也最高[2,3,4]。

对于CP基因而言,我国不同地理来源的分离物存在着很大的差别,为了明确不同地区分离物的分子差异以及进化关系,对其进行血清学检测方面的 研究,本研究利 用基于分 子生物学 的RT-PCR技术对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行扩 增,并对扩增 片段进行 序列测定 后与GenBank上其它地区分离的PVY病毒CP基因进行氨基酸序列比对分析,确定了PVY病毒黑龙江分离株CP基因与其它地区PVY病毒分离株CP基因的高度保守性,为下一步单克隆抗体的制备奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为感染PVA、PVS、PVY病毒的阳性样品,由农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨)提供。含有PVY病毒黑龙江分离株(HLJY1)的马铃薯样品,采自黑龙江马铃薯主产区。脱毒试管苗,由黑龙江省脱毒马铃薯工程中心提供[5]。试验所用仪器为ND-1000型紫外分光光度计、PCR仪和离心机等。PCR扩增引物由上海生物工程公司合成。其中,上游引物PVAF:5′- CAACTCCAGATGGAACAATTG3′;下游引物PVAR:5′- CAGGAAAAGCCAAAATACTTACTGC-3′,其扩增PVY病毒片段长度为1 451bp。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录称取100mg样品叶片,在液氮中 迅速研磨 成粉末[6],然后加入1.0mL TRIZOL研磨成匀浆组织。按TRIZOL植物总RNA提取方法提取RNA,利用无RNase的灭菌双蒸水溶解所提取的RNA分装备用,于 -70℃冻存。

向EP管中首先加入1μL 20mmol·L-1的下游引物,2μL模板RNA(浓度为1μg·μL-1),于95℃5 min,4℃10 min处理后,分别加入4μL 25mmol·L-1的MgCl2,4μL 5×反转录Buffer, 2μL dNTP(浓度为10mmol·L-1),1μL反转录酶,0.5μL RNA酶抑制剂(40U),利用无RNase灭菌双蒸水将总体积调至20μL,瞬时离心混匀。反应程 序为:42℃60 min,95℃5 min,4℃10min[7]。

1.2.2 PCR扩增及基 因克隆PCR体系为25μL,在EP管中加入2μL cDNA,0.5μL的上游引物(20mmol·L-1),0.5μL的下游引 物(20mmol·L-1),2μL dNTP (10 mmol·L-1), 2.5μL 10×PCR Buffer,2.0μL MgCl2(浓度为25 mmol·L-1),0.5μL rTaq DNA聚合酶(5U·μL-1),15μL灭菌双蒸水。PCR反应程序:92℃2min;92℃30s,62℃30s,72℃45s, 4个循环;92℃30s,60℃30s,72℃45s,5个循环;92℃30s,58℃30s,72℃45s,9个循环; 92℃30s,55℃30s,72℃45s,9个循环;72℃10min,4℃10min[8,9,10]。

分别测定所提取RNA在230、260和280nm的OD值,计算A260/A230、A260/A280及RNA的浓度,数据统计由ND-1000型紫外分光光度计自动生成。

取RT-PCR产物10μL在1% 琼脂糖凝胶上电泳,EB染色后,在凝胶成 像仪下拍 照,与DNA Marker比较,分析产物大小。

1.2.3 TA克隆及重组质粒的构建回收RTPCR产物,与pMD18-T载体连接,转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α中构建重组质粒。待LB培养基中形成单 菌落,选取若干,并提取质 粒,经PCR鉴定后用于测序。

1.2.4序列测定及分析鉴定后的阳性重组质粒送往上海生物工程公司测序。利用分子生物学软件DNAstar进行核苷 酸序列同 源性分析 及比较。

2 结果与分析

2.1 RNA浓度及纯度分析

研究结果表明,A260/A230值介于2.0~2.4, 说明盐类小分 子的污染 较少;A260/A280值介于1.8~2.0,说明所提取的总RNA中没有蛋白质及其它有机溶剂的污染。本试验所提取的RNA样品A260/A230值为2.00~2.08,其纯度较高、完整性较好,可用于下一步RT-PCR。

2.2 RT-PCR结果分析

由图1可见,通过引物PVYF和PVYR的PCR扩增,从感染HLJY1毒株的马铃薯样品和PVY阳性样品中均扩增出一条1 451bp的特异性片段,而脱毒试管样品和感染PVA、PVS病毒的阳性样品中未扩增出任何片段,与试验预期结果一致。

2.3 CP基因氨基酸序列分析

由图2可见,应用DNAstar软件的Clustal W方法,将HLJY1毒株的CP基因与GenBank上发表的40个不同区域PVY毒株CP基因进行序列比对分析。结果表明,HLJY1毒株的CP基因由267个氨基酸组成,与其它毒株氨基酸同源性在92.1%~97.4%。同时,各PVY毒株CP基因之间的氨 基酸同源 性高达90% 以上。说明PVY病毒黑龙 江分离株CP基因与其 它地区PVY病毒分离株CP基因的高度保守性,同时也表明CP基因可以用作制备检测PVY病毒单克隆抗体的首选基因。

3 结论与讨论

目前,传统生物学手段鉴定马铃薯病毒方法仍在使用,其中观察指示植物在接种病毒后的症状表现是鉴别病毒种类的主要标准之一,此方法稳定但时间长。目前普遍应用的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法由于受各种不确定因素影响易出现假阳性,而影响了检测结果的准确性。国际上通用的马铃薯病毒病的鉴定方法是以免疫血清学单克隆抗体为基础的ELISA[11,12]。自Kohler和Milstein于1975年创立单克隆抗体技术以来[13], 其日臻成熟,无论是抗原制备、免疫方法,还是从融合的过程直至单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选方法,都已积累了十分丰富的经验。利用单克隆抗体建立的ELISA方法,有利于对病毒的检测及遗传背景进行分析,从而对抗病育种的研究提供充分而又准确的数据,同时,可利用其开发出稳定可靠的ELISA检测产品,且具有很大的应用价值。此外,马铃薯Y病毒主要危害马铃薯及烟草等作物,可能造成作物严重的经济损失,因此,马铃薯Y病毒的克隆对于选育抗PVY感染的作物品种对于该病毒的控制也具有重要的意义。

蛋白质序列 篇8

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1重组质粒

p16-promoter-luc-pGL2-Basic质粒,英国皇家癌症研究基金会Peters教授惠赠,郑州大学基础医学院组胚教研室保存。

1.2

大肠杆菌JM109菌株,郑州大学基础医学院组胚教研室保存。

1.3标本

1.3.1

12例患者均为郑州大学第一附属医院门诊首次就诊而未经治疗的急性白血病患者。诊断全部符合1998年全国血液病诊断标准[2],分类按FAB分类法,12例患者中,急性粒细胞白血病部分分化型(M2)5例,急性早幼粒细胞白血病(M3)1例,急性淋巴细胞白血病(ALL)6例。每例患者在诊断后即抽取骨髓20mL,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,PBS液洗3次。

1.3.2正常对照骨髓细胞

取自郑州大学第一附属医院门诊非肿瘤、未经化疗及放疗的发热待查患者骨髓细胞,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,PBS液洗3次。

2实验方法

2.1 DNA探针的制备

2.1.1

质粒转化并碱裂解法小量提取。

2.1.2

质粒DNA经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定。

2.1.3目的DNA片段回收及鉴定

经小量提取验证后,大量培养转化菌,碱裂解法提取质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切并电泳后,应用DNA凝胶回收试剂盒回收890bp片段。

2.1.4 DNA探针标记

电泳回收890bp片段,地高辛随机引物标记试剂盒进行标记。

2.1.5探针灵敏度的检测

地高辛标记的DNA探针灵敏度达1pg/µL。

2.2核基质蛋白的提取及浓度测定

依Smith[3]的方法进行。

2.3 SDS-PAGE及转膜

SDS-PAGE采用5%积层胶恒压100V,15%分离胶恒压200V,转膜恒压25V转移10h。

2.4 DNA-蛋白质杂交

依照Burnette[4]的方法进行。

2.5统计学处理

所有统计数据均用(χ—±s)表示,用SPSS10.0统计软件进行统计学分析,组间比较采用独立样本t检验,多样本均数采用单因素方差分析,取α=0.05为显著性检验水准。

3结果

核基质蛋白经SDS-PAGE后,电转移至硝酸纤维素膜上,然后将标记探针与之杂交。结果显示,核基质蛋白对照组杂交主带位于40KD、50KD、60KD处;急性白血病组杂交主带位于60KD、70KD处,杂交条带数目明显少于对照组。应用Genetools软件定量分析并进行统计学处理发现,40KD、60KD杂交条带在急性白血病组明显较对照组变浅,差异有统计学意义(表1)。在ANLL、ALL及HL-60细胞间比较无显著差异(表2)。

☆组间比较采用独立样本t检验分析,P<0.05

☆多个样本均数比较采用单因素方差分析,P>0.05

4讨论

在高等生物中,细胞周期分别由不同的细胞周期蛋白(cyclins,CYC)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)在G1/S和G2/M两转折点进行自控性调节。p16基因编码的16KD的蛋白质是一种CDK4抑制因子,与CYC-D交互抑制CDK4的活性,维持细胞正常的增殖和分化。以往的研究多集中于基因组的不稳定性导致p16基因突变、缺失进而促进肿瘤的发生,关于基因表达场所即核基质的改变对p16基因在白血病中表达的影响目前尚未见相关研究报道。核基质是不含染色质的以核蛋白为主要成分的网络状精细结构。广泛参与细胞内的多种功能,如DNA复制、RNA转录、染色体组装、细胞癌变等。核基质蛋白作为建筑学上的转录因子,通过调整启动子的超螺旋及弯曲程度,以及与其他反式作用因子的相互作用,调节基因表达[5]。核基质与基因表达的研究,又使人们认识到了一种新的结构-核基质结合元件(matrix attached regions,MARs)。MARs是真核生物染色质中可以与核基质结合的一段特异的DNA序列,通常位于转录单位两侧或增强子附近,能够保护转录单位不受非相关反式作用因子的干扰,并参与染色体的重塑和去甲基化,以利于转录因子进入染色质[6]。活跃表达的基因通过MARs与核基质紧密结合,不表达的基因则不与核基质结合。本实验采用p16基因外显子1α上游-869bp片段,研究此段中是否存在MARs序列。核基质蛋白与此段标记的DNA片段进行Southwestern blot,发现正常骨髓细胞中杂交主带位于40KD、50KD、60KD处,急性白血病细胞中杂交主带位于60KD、70KD处。如前所述,DNA环以MARs与核基质结合,由此表明p16基因外显子1α上游-869bp片段上存在MAR,调节基因转录。活跃表达的基因通过MARs与核基质紧密结合,不表达的基因与核基质不结合,在正常组织中,p16基因表达正常,而在癌组织中p16基因表达受到抑制,Southwestern blot结果显示正常骨髓细胞和白血病骨髓细胞比较差别较大,在正常骨髓细胞中主带位于40KD、50KD、60KD,白血病骨髓细胞中主带位于60KD、70KD,正常骨髓细胞的结合蛋白量多于白血病骨髓细胞,提示核基质蛋白的改变可能影响与p16基因MAR的相互作用,与急性白血病的发生有关。正常骨髓细胞中40KD核基质蛋白表达量高于白血病骨髓细胞,且在Southwestern blot中,探针与正常骨髓细胞的该蛋白结合,但与白血病骨髓细胞的40KD蛋白结合较少,差异有显著性,推断此蛋白与MAR结合可能促进p16基因表达活性。60KD蛋白在白血病骨髓细胞中表达量高于正常骨髓细胞,但在与探针杂交时,此蛋白结合DNA的能力低于正常骨髓细胞,差异有显著性,表明此蛋白在白血病细胞中丧失了结合MAR的能力,很可能抑制了基因的表达。在不同类型急性白血病细胞中,探针结合蛋白差异不明显。通过我们研究表明,核基质蛋白的改变可能影响与MAR的结合,阻滞抑癌基因p16的表达,促进白血病的发生、发展。这为探讨抑癌基因失活机制开辟了新的途径,为研究白血病的发病机制找到了新的突破点。

摘要：目的探讨p16基因上游序列-869bp中是否含有核基质结合元件,并分析p16基因上游序列在急性白血病细胞组与对照组内与核基质蛋白结合的情况。方法DNA-蛋白质杂交(Southwestern blot)技术。结果p16基因上游序列与核基质蛋白的结合在急性白血病组与对照组间存在差异。结论p16基因外显子1α上游–869bp片段可以与核基质蛋白结合,表明该片段存在MAR序列,对p16基因表达调控具有重要意义,急性白血病细胞核基质蛋白成分的改变影响其与p16基因外显子1α上游–869bp片段MAR序列的结合,提示核基质蛋白成分的改变可能抑制p16基因的表达,促进急性白血病的发生。

关键词：急性白血病,核基质,核基质结合元件,p16基因

参考文献

[1]Zini N,Santi S,Ognibene A,et al.Discrete localization of different DNA topoisomerases in HeLa and K562cell nuclei and subnuclear fractions[J].Exp Cell Res,1994,210(2):336-348.

[2]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].2版,北京:科学出版社,1998:168-186.

[3]Smith HC,Puvion E,Buchholtz LA,et al.Spatial distribution of DNA loop attachment and replicational sites in the nuclear matrix[J].J Cell Biol,1984,99(5):1794-1802.

[4]Burnette WN."Western blotting":electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J].Anal Biochem,1981,112(2):195-203.

[5]Razin SV,Rynditch A,Borunova V,et al.The33kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix[J].J Cell Biochem,2004,92(3):445-457.

蛋白质序列 篇9

BQCV是单股正链RNA病毒,为双顺反子病毒科( Dicistroviridae) 蟋蟀麻痹病毒属( Cripavirus) 。病毒粒子直径为30 nm,可编码蛋白分子质量为34,32,29 ku和6 ku的4 个衣壳蛋白［2］。基因组中5'端的小基因连接蛋白( VPg) 和3'端连接的Poly( A) 尾具有维持基因组稳定和防护RNA降解的功能,见图1。在南非分离的BQCV有8 550 个核苷酸基因组( Gen-Bank序列号AF183905 ) ,不包含Poly ( A) 尾［3］。经核苷酸序列分析可知其含有2 个大的开放阅读框架( ORF) 。5'端的ORF( ORF 1) 较大,而3'端的ORF( ORF 2) 较小。基因组近5'端和近3'端的2 个ORFs之间的非翻译区被称为间隔区( IGR) ,5'端和3'端各有1 个非翻译区( UTR)［4］。BQCV 5'端UTR和IGR内各有1 个内部核糖体进入位点( IRES) ,可以启动基因组翻译［5］。笔者对分离得到的BQCV病料进行全基因组序列分析,全基因组序列分为10 段设计引物,本研究对第7 段( 命名为BQCV - JL1 - 7,位置5 416 ~ 6 539 nt) 采用RT - PCR方法扩增并克隆该段序列,并对该序列中VP基因进行分析。

1 材料

1. 1 毒株

采自吉林省内某蜂场中疑似BQCV感染的蜜蜂病料,分离得到毒株后由吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心动植物检疫实验室保存。

1. 2 试剂

Ex Taq DNA聚合酶、d NTP Mixture、10 × Ex TaqBuffer缓冲液、6 × Loading Buffer缓冲液、DL - 2 000Ladder Marker、p MD18 - T载体、大肠埃希菌DH5α、Prime SciptTMⅡ 1st strand c DNA Sythesis Kit,均为宝生物工程( 大连) 有限公司产品; PCR引物,由生工生物工程( 上海) 有限公司合成; Omega Biotek琼脂糖凝胶回收试剂盒、Omega Biotek质粒小量提取试剂盒Ⅰ型,购自广州飞扬生物工程有限公司; 胰蛋白胨、酵母浸出物,为OXOID公司产品; 氨苄西林,购自华美生物工程有限公司; X - gal、琼脂糖、IPTG,Sigma公司产品。

2 方法

2. 1 总RNA的提取

TRIZol法提取总RNA: 将疑似BQCV蜜蜂病料加入适量的PBS缓冲液充分研磨后,取其上清液250 μL加入DEPC处理的1. 5 m L EP管,再添加750 μL氯仿,剧烈摇晃20 s后室温静止10 min; 4 ℃ 、12 000 r / min离心10 min; 吸取600 μL上清液转移至另一支新的DEPC处理过的1. 5 m L离心管,加入事先预冷过的异丙醇溶液300 μL,- 20 ℃放置30 min;4 ℃ 、12 000 r / min离心10 min; 弃掉全部上清液,加入1m L 75% 的冰乙醇溶液并吹打混匀; 4 ℃、7 500 r / min离心5 min; 弃掉全部上清液,室温下倒置干燥5 min; 最后加入20 μL DEPC水溶解沉淀,即得到RNA。

2. 2 引物的设计与合成

获得的病毒RNA用RTase c DNA Sythesis Kit合成c DNA,具体步骤参照说明书,合成c DNA后进行测序,并利用Primer Premier 5. 0 引物设计软件设计特异性引物( 由上海生工生物工程有限公司合成) ,序列为: 5' - CTTTCTGGCTATGAGTAATTTTCTT - 3',5' - TAGGTCCTATGATTTCATCTGCA - 3'。

2. 3 RT - PCR反应

以c DNA为模板进行PCR扩增,反应体系: 10 ×Ex Taq PCR Buffer 2. 5 μL,d NTP Mixture 2. 0 μL,上、下游引物各1. 0 μL,Ex Taq酶0. 5 μL,c DNA2. 0 μL,RNase free Water 16 μL。扩增条件为: 95 ℃5 min; 95℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。其PCR产物经1 g /L琼脂糖凝胶电泳检测。

2. 4 RT - PCR扩增产物的克隆及鉴定

用Omega Biotek琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增产物,操作按试剂盒说明书进行。将回收产物连接到p MD18 - T载体后转入大肠埃希菌DH5α,加入无抗生素的LB液体培养基至终体积为1 m L后37 ℃、150 r / min培养1 h; 取培养后的180 μL菌液涂布在具有氨苄抗性LB培养板上,37 ℃ 倒置过夜培养; 挑取适宜的单个白色菌落,放入装有3 m L氨苄抗性的LB培养液的试管中,经37 ℃ 、150 r / min培养13 ~15 h; 待培养液混浊后采用Omega Biotek质粒小量提取试剂盒Ⅰ型提取质粒,质粒命名为p MD18 - T -BQCV - JL1 - 7,将经XbaⅠ和SalⅠ双酶切鉴定为阳性克隆的质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序,将测序结果与NCBI中报道的VP基因序列进行BLAST对比,绘制系统遗传进化树并分析同源性。

3 结果

3. 1 RT - PCR扩增结果

利用RT - PCR方法扩增了1 段长度约为1 100 bp的片段( 见图2) ,片段大小与理论扩增片段大小一致。

M.DL-2 000 Marker;1.BQCV的RT-PCR产物;2.阴性对照。

3. 2 克隆质粒酶切鉴定结果

为确定所扩增的片段为蜜蜂黑蜂王台病毒的核苷酸序列,首先将胶回收产物与p MD18 - T载体连接,然后转化至大肠埃希菌DH5α 中,蓝白斑筛选后进行质粒双酶切鉴定,结果见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.经XbaⅠ和SalⅠ双酶切的产物;2.质粒;3.RT-PCR产物。

由图3 可见,在1 100 bp左右的位置出现1 条亮带,与之前PCR扩增的片段大小一致。对重组克隆进行测序,测序结果表明,扩增的片段序列全长为1 124 bp。

3. 3 BQCV VP基因进化树的构建结果

将上述测序结果与NCBI上报道的BQCV VP基因序列进行BLAST对比,再通过MEGA 5. 0 软件截取得到BQCV - JL1 VP基因序列,见图4。

将中国BQCV - JL1 VP基因序列与来自南非、韩国、日本、匈牙利、波兰的17 个毒株序列进行比较,17 个毒株Gen Bank序列号分别为EF517520、EF517521、 JX149531、 AF183905、 AB638414、AB638415、 AB638416、 AB638411、 AB638412、AB638413、 AB605357、 AB605358、 AB605359、AB605360、AB605361、AB605362、EF517515。 通过MEGA 5. 0 软件Neighbor Joining法绘制系统遗传进化树,见图5。

由图5 可以看出,中国分离株BQCV - JL1 株VP基因核苷酸序列与日本分离株4( AB605360) 、日本分离株3( AB605359) 、日本分离株2( AB605358) 及日本分离株Ac1 ( AB638414 ) 、日本分离株Am3( AB638413) 、日本分离株Am2( AB6384142) 的同源性最高( 99% ) ,而与南非分离株( AF183905) 同源性最低( 89% ) ,这可能与地域差异有关。

4 讨论

BQCV感染作为一种传播广泛的蜜蜂疾病已在欧洲、北美、南非和澳大利亚被发现,它是美国常见的蜜蜂疾病,在澳洲也引起大量蜜蜂幼虫死亡。该病的全球性迅速蔓延严重威胁着养蜂业及相关产业。BQCV作为最普遍的蜜蜂病毒之一,主要的侵染对象是发展中国家蜂群中蜂王幼虫和蛹。一般的蜂厂全年对病毒呈现阳性,而工蜂和雄蜂感染BQCV这种现象却不常被看到［6 － 7］。另据报道,BQCV的感染与微孢子虫存在一定联系［8 － 9］。目前的研究认为,粪便作为污染源还是存在粪- 口传播途径传播到蜂群都是不确定的,还需要进一步研究［10］。

通过BQCV VP基因进化树分析不难发现: BQCV在日本变异较快,具有较多类型的分离株; 经过NCBI中的BLAST比对发现,中国BQCV - JL1 株VP基因与日本分离株4 ( AB605360 ) 、日本分离株3( AB605359) 、日本分离株2( AB605358) 及日本分离株AC1( AB638414) 、日本分离株AB13( AB638413) 、日本离分株Am2( AB6384142) 的VP基因具有较高的同源性,最高可达99% ; 与其他日本分离株的VP基因同源性在91% ~ 96% 之间; 与韩国株( JX149531) 的同源性达98% 。中国、日本、韩国同处亚洲,而吉林地区毗邻朝鲜和韩国,从地缘传播来看序列相似有一定依据,日本、韩国报道BQCV较早,推测中国BQCV - JL1 株由日本、韩国传播的可能性极大。将中国BQCV - JL1 株VP基因同非亚洲株对比发现,其与匈牙利分离株( EF517515) 同源性达95% ,与波兰分离株5 ( EF517520 ) 和波兰分离株6( EF517521) 同源性均为91% ,而与最早发现的南非分离株( AF183905) 同源性最低( 为89% ) 。尽管南非分离株报道较早,但相比来看,南非分离株VP基因区域与中国BQCV - JL1 株VP基因区域同源性不高,而与除南非分离株之外的各大洲分离株似乎具有一定比例的同源性,同处于一个大洲的各株同源性较高,这也符合地理起源。从全球来看,中国、日本、韩国已成为亚洲的主要传播地,BQCV已不局限于传播单一大洲,同样也可以跨洋传播,大有在各洲之间蔓延传播的迹象。

蛋白质序列 篇10

CSBV属于小RNA病毒科。 病毒结构分为三层: 最里面为病毒核酸,中间为无定型层,最外面是由衣壳蛋白vp1、vp2、vp3 和vp4 组成的衣壳［3 － 4］。目前,已有来自辽宁、重庆、北京和广东等地区CSBV的相关研究报道［4 － 7］; 而江西地区还未见关于CSBV的研究报道。鉴于此,本试验对编码CSBV衣壳蛋白的vp1 基因进行克隆,并分析其核酸及氨基酸序列特征,旨在明确来自不同地区及蜜蜂种类的CSBV之间的序列差异,为CSBV的检测奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 样本

患中华蜜蜂囊状幼虫病的中华蜜蜂幼虫,采自江西省铜鼓县的养蜂场。

1. 2 主要试剂

TRIzol试剂盒、p EASY - T3 载体、Trans - DH5 感受态细胞、5 - 溴- 4 - 氯- 3 - 吲哚- β - D - 半乳糖苷( X - gal) 、异丙基硫代半乳糖苷( IPTG) 、RNA酶抑制剂,购自北京全式金生物技术有限公司; DL -2 000 Marker、M - MLV反转录酶,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; d NTP、LA - Taq DNA聚合酶及DNA凝胶回收试剂盒,购自北京博凯思维科技有限公司。

1. 3 引物的设计及合成

以NCBI的Gen Bank数据库下载的CSBV广东株的核酸序列( 登录号为AF469603. 1) 作为参考序列,用Primer 5. 0 软件设计1 对PCR引物扩增CSBV江西株vp1 基因完整的编码区。引物序列: 上游引物5' - AATAACCAAGATAAACCGAAGGA - 3',下游引物5' - CATCTTCATCTTCTTTAGCTCCA - 3',引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1. 4 蜜蜂总RNA的提取及反转录

从染病的中华蜜蜂蜂群中随机取2 只感染CSBV的幼虫作为一个样品。经液氮研磨后参照TRIzol试剂盒说明书提取RNA,用紫外- 可见分光光度计检测RNA质量。将提取的总RNA反转录合成c DNA,反应条件: RNA 8 μL,Buffer 10 μL,d NTP 8 μL,M -MLV反转录酶1. 5 μL,反转录引物3 μL,RNA酶抑制剂1 μL,DEPC水18. 5 μL。反应条件: 42 ℃60 min; 75 ℃ 5 min; - 80 ℃ 保存,备用。

1. 5 目的基因的PCR扩增及DNA的回收

以1. 4 中合成的c DNA为模板,采用vp1 基因的引物进行PCR扩增。PCR反应体系: c DNA 4 μL,d NTP 2 μL,10 × PCR Buffer 2. 5 μL,上、下游引物各1 μL,LA - Taq DNA聚合酶0. 3 μL及dd H2O14. 2 μL。PCR反应程序: 94 ℃ 预变性3 min; 94 ℃ 变性30 s,61 ℃退火45 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环; 72 ℃再延伸10 min; 4 ℃保存,备用。用1% 琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳,严格参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。

1. 6 目的基因的克隆及序列测定

将回收的目的片段与p EASY - T3 载体连接,连接产物转化至Trans - DH5α 感受态细胞,随后均匀涂布在含X - gal( 100 μg /m L) 、Amp( 100 mg /m L) 及IPTG( 1 mmol / m L) 的固体培养基上,37 ℃ 倒置培养12 h; 经蓝白斑筛选,挑选8 个白斑至含Amp的液体培养基中振荡培养8 h; 提取质粒,通过PCR扩增鉴定阳性克隆,将含重组子的阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。

1. 7 序列分析

去掉单个克隆正反向序列中的载体序列,用DNAstar软件中的Seqman程序进行序列组装,将组装后获得的一致序列在NCBI网站通过对NR数据库进行BLASTN比对来确认是否为目的序列。从NCBI的Gen Bank数据库中下载来自其他囊状幼虫病病毒( SBV) 毒株的vp1 基因核酸及氨基酸序列。用Bioedit软件分别计算本研究所克隆的vp1 基因与其他SBV毒株vp1 基因序列的一致性、相似性。 应用Mega 4. 0 软件采用最小进化法( Minimum Evolution)构建基于vp1 基因核酸序列的系统进化树。用DNAsp软件计算vp1 基因的编码区与其他SBV毒株vp1 基因编码区的同义替换率( Ks) 和非同义替换率( Ka) 。参与序列比对分析和构建系统进化树的SBV毒株见表1。

2 结果与分析

2. 1 vp1 基因的克隆

以CSBV江西株RNA反转录合成的c DNA为模板对vp1 基因进行PCR扩增,用1% 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,得到1 条特异性条带,该扩增片段与预期大小相近,见图1。该片段经回收、克隆测序后发现,CSBV江西株vp1 基因核酸序列大小为973 bp( Gen Bank登录号为KM232611) ,编码324 个氨基酸,蛋白分子质量为36. 58 ku,见图2。

1.vp1基因PCR扩增产物;M.DL-2 000 Marker。

2. 2vp1 基因核酸和氨基酸序列分析( 结果见表2 ~ 3)

核酸序列分析结果表明: CSBV江西株vp1 基因核酸序列与重庆分离株CSBV - CQ的一致性最高,为97. 23% ; 与英格兰分离株Rothamstead的一致性最低,为85. 21 % 。氨基酸序列分析结果表明: CSBV江西株vp1 基因氨基酸序列与重庆分离株CSBV -CQ的一致性和相似性均为99. 07 % ,属于最高; 与北京分离株CSBV - BJ的相似性最低,为91. 20 % 。

替换率分析结果显示,CSBV江西株vp1 基因与重庆分离株CSBV - CQ vp1 基因的Ka、Ks值均最低,说明CSBV江西株与重庆分离株CSBV - CQ之间的遗传分化最小。同时CSBV江西株vp1 基因与其他SBV毒株vp1 基因的Ka与Ks的比值均远远小于1,说明vp1 基因受到纯化选择。

%

2. 3 系统进化树分析

利用CSBV江西株vp1 基因与其他SBV毒株vp1 基因的核酸序列构建系统进化树,结果表明,CSBV江西株与重庆分离株CSBV - CQ聚为一支,说明两者之间的亲缘关系最近,见图3。

系统进化分析结果还表明,所有的SBV毒株在进化树上按照蜂种来源形成两大支,其中来自亚洲地区的东方蜜蜂的CSBV毒株聚为一支,而来自西方蜜蜂的SBV毒株聚为另一支。

3 讨论

由系统进化树可以看出,来自东方蜜蜂的SBV毒株聚在一起,而来自西方蜜蜂的SBV毒株则聚成另一支,这说明SBV可按照宿主的不同分为东方蜜蜂型和西方蜜蜂型两种类型。这与参考文献[8 - 9]的研究结果一致。有学者通过对中国北方7 个CSBV毒株vp1 基因序列分析发现,当2 个SBV毒株的vp1基因序列间的相似性达到90. 00% 以上时,它们就属于同一个基因类型,即东方蜜蜂型或西方蜜蜂型［8］。但本研究发现,CSBV江西株与多个来自东方蜜蜂的病毒株之间的vp1 基因核酸序列相似性均小于90. 00% ,这可能是因为参考文献[8]中用于分析的序列是来自于地里相隔很近的辽宁、吉林、河北三省的病毒株,它们之间的遗传分化不大,而我们使用的序列是来自于相互间遗传分化较大的病毒株。这一结果说明简单地将90. 00% 的相似性作为判断2 个SBV毒株是否为同一基因型是不正确的。

E. Grabensteiner等［10］和罗文华等［5］通过研究认为,可将SBV按照地理来源不同划分为欧洲型、远东型( 亚洲型) 和南非型3 个基因型。本研究构建的系统进化树也显示: 来自亚洲地区的东方蜜蜂SBV毒株聚为一大支,为亚洲型; 而来自英格兰、巴布亚新几内亚等的SBV毒株聚为另一大支,为欧洲型。本研究结果充分说明,蜜蜂SBV也可以分成亚洲型、欧洲型等不同的地理类型。

摘要：为了克隆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)江西株衣壳蛋白vp1基因,并分析其序列特征,试验采用PCR扩增、克隆、测序及序列分析的方法对其进行了研究。结果表明:CSBV江西株vp1基因核酸序列大小为973 bp,编码324个氨基酸,蛋白分子质量为36.58 ku;序列分析显示,CSBV江西株vp1基因与CSBV重庆株vp1基因相似性最高,两者核酸序列的一致性为97.23%,氨基酸序列一致性和相似性均为99.07%;系统进化树分析显示,CSBV江西株与CSBV重庆株聚为一支。说明CSBV江西株与CSBV重庆株亲缘关系最近。