载脂蛋白E基因

载脂蛋白E基因（精选六篇）

载脂蛋白E基因 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取山西医科大学第一医院2009年5月—2009年11月新入院的脑梗死病人240例为脑梗死组, 其中男139例, 女101例, 年龄 (67.65±7.86) 岁。诊断符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准[3], 并经头颅CT/磁共振成像 (MRI) 确诊;排除栓塞性、感染性因素及其他非血管因素所致卒中, 另外除外意识障碍、失语及有精神障碍不能配合认知功能检查的病例。并同期收集山西医科大学第一医院门诊体检中心健康体检者150名作为对照组。其中男92名, 女58名, 年龄 (65.38±7.36) 岁。两组年龄、性别差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采集空腹静脉血2 mL, 用EDTA-Na2抗凝, 用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计

参照文献[4]方法, 用等位基因特异性多重聚合酶链反应 (ARMS-PCR ) 方法检测ApoE 基因多态性。设计上游引物序列 (由宝生物工程大连有限公司合成) :P1, 5′-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3′, P2, 5′-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3′, 分别检测 ApoE112 位的半胱氨酸 ( Cys) 和精氨酸 (Arg) ;P3, 5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′, P4, 5′ -ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3′, 分别检测 ApoE158 位的Cys 和 Arg;设 计 公 共 下 游 引 物 为 P5, 5′ -GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′; 引物 P1 与 P5、 P2 与 P5 扩增出的片段为 588 bp, P3 与 P5、 P4 与 P5 扩增出的片段为 451 bp。另按照 Newton 等[5]方法, 设计一对引物扩增 α -抗胰蛋白酶 (AAT) 基因外显子 3片段 ( 360 bp) , 作 为内参照。序列:P6, 5′ -CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCATGGg-3′, P7, 5′-GGGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGG-3′。

1.2.3 PCR 反应体系

总反应体系为 25 μL, 每个样本设计 1、 2、 3、 4 四管。各管均加入10 ×PCR Buffer (含18 mmol/L Mg2+) 2.5 μL, 5 mmol/L dNTP 2 μL, Taq DNA 聚合酶4 U, DNA模板3 μL, 二甲基亚砜 (DMSO) 2 μL , 公共引物P5 1 μL, P6和P7各1 μL, 每管分别加入对应的P1、P2、P3、P4 1.5 μL, 最后加灭菌三蒸水11 μL。

1.2.4 PCR反应条件

95 ℃预变性 5 min, 然后按 95 ℃变性 45 s、 62 ℃退火 45 s、 72 ℃延伸 45 s, 循环 35 次, 最后 72 ℃延伸 5 min。取 10 μL PCR产物和6*buffer 2 μL混合后, 用浓度为 2%的琼脂糖凝胶 (已加入goldview) 进行电泳后、凝胶成像系统进行图像分析, 确定ApoE 基因型。电泳条件:0.5× TBE 电泳缓冲液恒压100 V电泳30 min。

1.2.5 结果判定方法

每个样本分别设计 1、2、3、4四管, 均加入公共下游引物 P5, 并分别加入上游引物 P1、 P2、 P3、 P4。P1 与 P5 扩增出588 bp 片段, 决定ApoE 112 的Cys;P2 与 P5 扩增出 588bp 片段, 决定112位Arg;P3与P5 扩增出451 bp片段, 决定158位Cys;P4与P5 扩增出451 bp片段, 决定158位 Arg。E2/2 型第112、158位均为Cys, 故 1、 3管扩增阳性, 而2、4管除扩增出360bp内参AAT片段外, 无目的片段扩增出;E3/3型第112位是Cys、第158位是Arg, 故1、4管扩增阳性, 而2、3管只扩增出360 bp 内参片段;E4/4型第112、158位均是Arg, 故2、4管扩增阳性, 1、3管只扩增出360 bp内参片段;E2/3型 1、3、4管扩增阳性, 2管只扩增出360 bp内参片段;E3/4型1、2、4管扩增阳性, 第3只扩增出360 bp内参片段;E2/4型1、2、3、4管均扩增阳性。

1.2.6 认知功能测评

所有脑梗死病人病情稳定后均进行MMSE及MOCA量表测评。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行分析, 基因频率采用基因计数法, 基因型及等位基因频率比较用χ2检验。3 个基因亚型间评分的比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 ApoE基因各基因型及等位基因分布

ACI组ApoE3/4基因型频率较对照组显著增高 (P<0.05) 。ACI 组和对照组间等位基因频率有统计学意义 (P<0.05) , 脑梗死组ε4频率高于对照组 (P<0.05) 。详见表1。

例 (%)

2.2 脑梗死组不同ApoE

基因亚型MMSE、MOCA评分的比较 (见表2)

3 讨 论

Apo E是载脂蛋白家族中重要的成员之一, 它参与人体脂代谢调节, 与动脉粥样硬化甚至高血压的发生有关。而高脂血症、动脉粥样硬化、高血压病等又是脑血管病的危险因素[6,7]。ApoE在脂蛋白的代谢中起着重要作用, ε4等位基因与高含量的血总胆固醇 (TC) 、高浓度的低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 以及高水平的载脂蛋白B显著相关, 促进动脉粥样硬化。本实验Apo E4基因在脑梗死组比在对照组有较高的表达率, 与大多研究相一致。脑梗死组中ε4频率明显高于对照组, 推断ε4等位基因可能是脑梗死的遗传标记之一。

血管性认知障碍 (VCI) 是指由血管因素引起的不同程度的认知障碍[8]。目前已知ApoE4 基因型是阿尔茨海默氏病 (AD) 发病的易感和危险因素之一 [9]。本研究显示ApoEε4 基因携带者认知功能 (MMSE及MOCA评分) 明显低于ε2、ε3携带者。与我国流行病学调查显示携带ApoEε4 基因的健康老年人随着年龄的增加更易出现认知功能的障碍相一致。因此, 可以推测ApoEε4 基因为VCI 的危险因素, 但其导致认知功能下降的机制可能不单纯是增加血管性风险, 还有其他机制, 如对神经元损伤后修复的影响。

ApoE 是神经系统中髓鞘磷脂代谢重要因子, 而髓鞘磷脂代谢与神经元损伤后的修复过程密切相关。 缺血性及创伤性所致的神经变性和再生时, 星形细胞或临近巨噬细胞释放ApoE 量增加 , 促进胆固醇酯化从而为轴突膜的生长提供脂质, 利于神经元的生长及神经树突重建。而这一作用被证实是E3单体特异性的, 而E4却无此特异作用[10]。E4 可能会加重神经变性或血管性原因造成的脑损伤修复困难, 从而在认知障碍的发生中起消极作用。ApoE4基因可能为VCI的危险致病因子, 但具体作用机理尚待进一步研究。

但是, ApoEε4 在对血管性认知障碍的作用机制至今尚不完全明确, 可能与下列因素有关: ①引起血脂代谢紊乱, 促进动脉粥样硬化;② 刺激巨噬细胞及泡沫细胞的形成, 作用于脂蛋白的结构蛋白能直接参与动脉粥样硬化的形成;③ε4抗氧化能力弱于ε3, ε4 对缺血性神经元损伤的保护性作用较差;ε4基因携带者神经细胞缺血性损伤的程度较重;④ε4可阻止神经细胞损伤后神经功能的恢复。

ApoEε4 等位基因对认知功能产生有害影响, 因此, 通过检测ApoE 基因型能够早期发现发现VCI的高危人群, 为早期干预VCI创造条件, 从而减轻VCI对家庭和社会的危害。

参考文献

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载脂蛋白E基因 篇2

本课题对259例海南百岁老人和529例健康人APOE基因和TOMM40基因rs2075650多态性进行基因连锁研究,探讨其与长寿的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

百岁老人组259例。男性71例,女性188例;平均年龄(103.32±2.15)岁。纳入标准:严格按照长寿老人年龄界定五步法确定长寿老人[2],取年龄≧100岁的长寿老人作为研究对象。对照组529例。男性145例,女性384例;平均年龄(49.78±6.52)岁。纳入标准:海南地区同一民族没有血缘关系,无长寿家族史,家族中至少2代无90岁的健康人群,所有对象经调查组逐一核实筛选,验证确切无误者确定为研究对象。根据中华人民共和国国务院《医疗机构管理条例》规定[3],本研究经本院伦理委员会伦理审核通过,在实验前将实验方案和风险告知受试者及家属,所有受试者或亲属签署了知情同意书。

1.2 材料与试剂

DNA MarkerⅠ、DNA MarkerⅡ、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate,d NTP)、Taq酶、琼脂糖、DNA提取试剂盒等购自Tiangen公司,引物合成由上海生物技术有限公司完成。

1.3 仪器与设备

电泳仪(JY600C,上海京工实业有限公司),微量移液器(德国Eppendorf公司),高速台式离心机(H1650-W,湖南平凡仪器仪表有限公司),分析天平(上海升隆电子科技有限公司),超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop 2000/2000C,美国Thermo公司),聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(德国Biometra公司),凝胶成像分析系统(Gel Doc2000,美国Bio-Rad公司),微波炉(MM721AAU-PW,中国美的公司),水浴箱(HH-W420,上海双旭电子有限公司),通风橱(北京欧世佳实验室家具有限公司),摇匀器(WH-986,上海双旭电子有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 DNA的提取

所有入组者取5 ml静脉血,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,置入-80℃冰箱冷冻保存,标本收集完成后,用改良酚-氯仿法[4]提取DNA,低温下备用。

1.4.2 PCR扩增APOE基因片段

APOE基因引物一参照文献[5],N1:5'-ATGCCGATGACCTGCAGA ATT-3';N2:5'-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3;N3:5'-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3';N4:5'-CG CGGACATGGAGGACGTTC-3';N5:5'-GTTCAGTGA TTGTCGCTGGGCA-3'。反应体系:总体积25μl,10×PCR Buffer 2.5μl,10 mmol d NTP 2.5μl,N1/N21μl,N3/N4 1μl,N5 1μl,模板DNA 5μl,Taq DNA聚合酶1μl,dd H2O 11μl。分A、B管进行PCR扩增,A管引物为N1、N3、N5,B管为N2、N4、N5。94℃预变性7 min,94℃变性55 s,59℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循环30次,72℃再延伸7 min。取5μl PCR反应产物与1μl的6×加样缓冲液混匀后,加样于0.5×Tris-硼酸缓冲液(以下简称TBE缓冲液)配制的含嗅化乙锭1.7%的琼脂糖凝胶中,在0.5×TBE缓冲液以90 V电压电泳约30 min,紫外灯下观察扩增结果并照相。见图1。

采用Oligo 6.0软件设计APOE基因引物:P1为5'-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCG-3';P2:5'-CC CGGCCTGGTACACTGCCAGG-3'。取100份标本用P1/P2引物扩增APOE基因目的条带。反应体系10×PCR Buffer 2.5μl,10 mmol d NTP 2.5μl,P1/P2各1μl,模版DNA 1μl,Taq聚合酶1μl,双蒸水16μl,总体积25μl。PCR反应条件:94℃预变性7min,94℃变性55 s,59℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循环30次,72℃再延伸10 min。PCR产物经琼脂糖电泳证实为特异性条带,经超微量核酸蛋白测定仪检测质量在60 ng/μl以上,OD260/280在(1.91±0.06)之间。每份标本各取80μl由北京TIANGEN公司测序,基因型与多重PCR所得出的结果吻合,提示多重PCR结果可靠,可以作为本次实验APOE分型使用。见图2。

1.4.3 PCR扩增TOMM40基因片段

采用Oligo6.0软件设计TOMM40基因引物:R1为5'-GAGAAG AGAAACGCTGTCACACTCCACT-3;R2:5'-GAGAAG AGAAACGCTGTCACACTCCACC-3';R3:5'-GCACA TTCGAGGAGTGCCACCGGAAGT-3'。反应体系:10×PCR Buffer 10μl,10 mmol d NTP 2.5μl,Primer R1/R2 1μl,Primer R3 1μl,模板DNA 1μl,Taq DNA酶1μl,dd H2O 17.5μl,总体积25μl。PCR反应条件:94℃预变性7 min,94℃变性55 s,59℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循环30次,72℃再延伸10min。A、B管进行PCR扩增,A管引物R1/R3,B管引物R2/R3取5μ1 PCR反应产物与1μl的6×加样缓冲液混匀后,加样于0.5×TBE缓冲液配制的含嗅化乙锭1.7%的琼脂糖凝胶中,在0.5×TBE缓冲液以90 V电压电泳约30 min,紫外灯下观察扩增结果并照相。PCR扩增结果按5%比例进行复检,要求复检和初检的符合率达到100%。见图3。

ε3ε3有重复。A管引物:N1、N3和N5;B管:N2、N4和N5

A:112位氨基酸的TT变成TC;B:158位氨基酸的CC不变

A管:引物R1/R3;B管:引物R2/R3;1和5为GA基因型;2和7为AA基因型;3、4和6为GG基因型

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析,HardyWeinberg平衡用拟合优度χ2检验。基因型与等位基因频率均以百分率(%)表示,组间比较用χ2检验和Fisher检验,同时计算比值比(odds ratio,OR)和95%可信区间(confidence interval,CI),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APOE基因多态性

2.1.1 经吻合度检验

对照组APOE基因型符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2<3.84,P>0.05)。见表1。

2.1.2 APOE基因各基因型及等位基因分布

经吻合度检验,百岁老人组、对照组APOE基因型符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.84,P=0.062),百岁老人组和对照组的基因型分布频率经χ2检验(χ2=5.867,P=0.042),差异有统计学意义,等位基因分布频率差异有统计学意义(χ2=20.512,P=0.003)。见表2。

2.1.3 百岁老人组、对照组APOE基因与长寿的关联性

百岁老人组、对照组ε2ε2、ε4ε4、ε3ε4基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05),而对照组ε2ε3、ε2ε4基因型频率高于百岁老人组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.2 TOMM40基因多态性

2.2.1 TOMM40基因多态性Hardy-Weinberg平衡

例(%)

对照组基因型符合Hardy-Weinberg平衡,能够代表群体的基因分布。见表4。

2.2.2 TOMM40基因各基因型及等位基因分布频率

TOMM40基因各基因型及等位基因分布中,百岁老人组和对照组的基因型分布频率差异有统计学意义(χ2=12.027,P=0.002),等位基因分布频率差异无统计学意义(χ2=2.798,P=0.094)。见表5。

2.2.3 TOMM40基因型、等位基因频率与长寿的相关性

按是否携带APOEε4等位基因将百岁老人组和对照组分为携带ε4组与非携带ε4组,对TOMM40基因型、等位基因频率与长寿的相关性进行分析。结果表明,非携带APOEε4等位基因TOMM40基因型在百岁老人组和对照组间比较,差异有统计学意义(χ2=249.658,P=0.000)。百岁老人组GG型的频率为53.9%,GA型的频率为33.3%,对照组GG型的频率为63.0%,GA型的频率为29.6%,两组间比较差异有统计学意义(^OR=0.172,95%CI:0.165,0.180,χ2=2.028,P=0.028),百岁老人组GG型的频率低于对照组,GA型的频率高于对照组。百岁老人组AA型的频率为12.8%,对照组为7.4%,两组比较差异有统计学意义(^OR=0.018,95%CI:0.015,0.020,χ2=5.884,P=0.000),百岁老人组高于对照组。百岁老人组等位基因G的频率为70.5%,等位基因A为29.5%,对照组等位基因G的频率为77.8%,等位基因A为22.2%,两组间比较差异有统计学意义(^OR=0.007,95%CI:0.005,0.008,χ2=7.494,P=0.000)。百岁老人组等位基因G型的频率低于对照组,等位基因A高于对照组。见表6。

例(%)

例(%)

例(%)

携带APOEε4等位基因TOMM40基因型频率百岁老人组与对照组比较,差异有统计学意义(χ2=12.343,P=0.002)。GA型与GG型比较差异无统计学意义(P=0.010);AA型与GG型比较,差异有统计学意义(P=0.007)。等位基因A与G比较差异有统计学意义(P=0.027)。见表7。

例(%)

例(%)

例(%)

3 讨论

人类基因组计划的研究结果表明,不同个体对疾病和环境有害因素的易感性是由细微的基因差异造成的[5]。细微的基因差异主要表现在基因多态性上,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与疾病及其他生命现象的相关性成为分子生物学及遗传学研究的热点之一。除外显子外,内含子多态性与基因功能的关系也越来越受到人们的关注,其内藏的可读框架可以表达为成熟酶、逆转录酶和核酸内切酶,对基因的表达和调控产生影响[6]。表观遗传学最新研究表明,核外分子构成一个功能强大的信息缓冲区,内含子被剪切后是该信息缓冲区中的分子来源之一。随着研究的深入,内含子基因多态性与长寿的关系将会得到进一步明确。

APOE基因位于人类第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上,包含3个内含子,4个外显子。基因的最终产物299个氨基酸残基组成成熟蛋白[7]。其中外显子4编码112位半胱氨酸和158位精氨酸的DNA序列存在多态性,根据这2个位点的多态性,可将APOE分为3种等位基因,即ε2、ε3和ε4。这3种等位基因又可构成6种不同的基因型,即3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和3种杂合型(ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4)。

早期研究发现,载脂蛋白E与特异的脂蛋白受体作用而改变血循环中胆固醇的水平[8]。进一步研究发现,APOE基因与影响人类健康长寿的多种疾病有关,其中与LOAD的研究是近几年较多。有研究[9]发现,APOEε4是患阿尔茨海默病和心血管疾病的高危因素。全基因组相关性研究发现,众多阿尔茨海默病易感基因和等位基因,证实APOE基因和阿尔茨海默病易感性有关[10,11]。APOEε4等位基因携带者阿尔茨海默病发病较早且存在更为广泛的弥漫性老年斑,这与APOEε4等位基因数目有关。APOEε2等位基因则导致阿尔茨海默病发病风险下降和病理严重程度的减轻。SERIPA等[12]对意大利86例诊断为痴呆渐进性失语的患者和99例健康人作比较分析,发现APOEε3ε4、ε4ε4基因型与痴呆,尤其原发性失语显著相关(P<0.01)。糖尿病合并外周动脉粥样硬化的患者如果携带ε4等位基因更易出现认知上的障碍[13]。胡才友等[14]研究表明,广西巴马地区老人APOE基因多态性与其认知功能改变相关,认为APOEε4等位基因是长寿老人认知功能障碍发病的危险因子。

JACOBSEN等[15]对丹麦百岁老人进行分析,认为APOEε4等位基因与百岁老人的生存期有很大联系。携带ε4等位基因者心血管疾病发生率高,寿命明显缩短,非携带ε4等位基因者,生存期延长。MATERA[16]对2 124例老人进行APOE基因分析和5年的生命质量追踪随访,发现女性ε2ε2基因型差异明显(P<0.01),女性老人ε2ε2基因型频率明显增多。APOEε4等位基因与其中观察的671例老人死亡有关。相反,APOEε2等位基因降低总死亡率。MCKAY等[17]通过对10 623例欧洲老年性黄斑变性患者和对照组10年的观察,得出结论———APOEε4等位基因对寿命是不利的尤其是APOEε4ε4基因型。随着年龄增加,检测APOE基因显示ε4ε4基因型明显减少,各个基因型无性别差异,这与MATERA[16]的研究结论不同。我国广西巴马地区、新疆长寿老人APOE基因多态性与长寿现象的关联研究发现,APOE基因多态性与长寿相关联[18,19],长寿相关基因为APOEε2/ε2、ε3/ε3基因型。

笔者在该实验研究中发现,海南百岁老人组显示ε3ε3基因型与百岁老人长寿有关联,但与ε2/ε2基因型不相关。

TOMM40是一种在线粒体外膜控制各种酶进入线粒体发挥作用的关键通道,对线粒体发挥正常作用有直接影响。其由核基因表达。TOMM40基因位于染色体上位于19号染色体45312338~45422606区域,包含10个外显子和9个内含子。在第2内含子基因位点45395619(rs2075650)存在G/A多态性。

DEELEN等[20]通过对欧洲多个研究中心的荟萃分析发现,rs2075650与长寿有关,主要表现在:与APOE连锁分析时,发现TOMM40的AA基因型与APOE的ε4相关。MARUSZAK等[21]通过对414例LOAD患者、173位百岁老人、305位其他神经系统疾病的患者的TOMM40和APOE基因进行关联性分析认为,TOMM40AA基因型在迟发型阿尔茨海默病中更有意义。POTKIN等[22]在对381例临床诊断阿尔茨海默病患者进行全基因关联性分析发现,TOMM40基因的rs2075650多态性位点检测率高出正常对照组2倍,认为其能用来预测AD的发生。ELCOROARISTIZABAL等[23]对90岁以上老人SNP位点进行分析,认为AD与TOMM40基因和APOE基因多态性有关联性。TOMM40基因与阿尔茨海默病易感性之间的联系可能由于该基因与APOE连锁失衡所致[24,25,26]。

载脂蛋白E基因 篇3

为进一步观察艾烟对阿兹海默病模型小鼠学习记忆功能以及脑中β淀粉样蛋白( Aβ) 沉淀形成的影响。本实验以载脂蛋白E基因敲除 ( apolipoprotein E-deficient,ApoE-/ -) 小鼠为模型,通过对比观察艾烟暴露与香烟暴露两种不同干预方式对其学习记忆功能影响及脑组织海马中Aβ沉淀改变,探讨艾烟对脑组织衰老的干预作用,以期为探索艾灸疗法延缓衰老机制提供依据。

1 材料与方法

1. 1 实验动物及分组

选用清洁级8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除小鼠( ApoE-/ -) 27只,C57BL/6小鼠13只,体质量30 g,2013年3月22日购自北京大学动物医学中心[许可证: SCXK( 京) 2011-0012]。Apo E-/ -小鼠采用高脂饲料喂养,C57BL/6小鼠采用标准饲料喂养,自由进水; 饲养环境温度( 22±2) ℃,相对湿度50%~ 60% ,保持12小时光照 ( 8∶00 ~ 20∶00 ) 和黑暗( 20∶00 ~ 次日8∶00) 交替循环。

小鼠购进后,适应性饲养1周,干预12周。按随机数字表法将Apo E-/ -小鼠随机分为ApoE-/ -模型组、艾烟组、香烟组三组 ( 每组9只) ,并将13只C57BL /6小鼠作为空白对照组进行对照。

1. 2 主要实验材料、仪器及试剂

自制细艾条: ( 直径0. 5 cm×长20 cm,河南南阳汉医艾绒有限公司) ; 香烟( 中南海牌,焦油含量10 mg / 支) ; 自制带孔玻璃缸1 m×1 m×1 m,顶层玻璃正中设一直径5 mm圆孔) ; 光散射式数字粉尘测试仪( 北京宾达绿创科技有限公司) ; 小鼠跳台试验仪; 刚果红染液( 南京建成生物工程研究所) ;中性树胶封片剂; 多聚甲醛,中性树胶及其它生物试剂( Sigma公司) 。

1. 3 实验步骤

空白暴露: 将空白对照组与ApoE-/ -模型组小鼠分别暴露于玻璃缸中20分钟。

艾烟干预: 将调试好的粉尘测试仪置于玻璃缸中间,将艾烟组小鼠自由暴露在玻璃缸中,点燃自制细艾条,从玻璃缸上方的圆孔将点燃的一端插入,令艾烟充满玻璃缸。根据前期实验结论[10],控制艾烟浓度为5 ~ 15 mg /m3。用粉尘测试仪测试其浓度达到预定范围后( 此过程艾条燃烧约15秒) ,将艾条取出,迅速封闭圆孔。此后每隔3分钟记录一次浓度数值,使浓度稳定在10 mg /m3左右。若数值高于15 mg /m3,可将上方玻璃盖稍微移动,令艾烟散去部 分后迅速 将盖子移 回; 若数值低 于5 mg / m3,可再将点燃的艾条由圆孔插入,以补充艾烟。20分钟后,取出小鼠,每周干预6天,共干预12周。

香烟干预: 除将艾条换成香烟,香烟浓度及干预方式与艾烟组相同。在进行香烟干预时要保证与其他组别严格隔离,避免其他组别嗅到香烟。

于第13周进行跳台试验。将小鼠置于被动回避反应箱( 20 cm×20 cm×10 cm) ,适应3分钟,然后底部铜栅通电( AC,40V) ,通电时间5分钟。小鼠遭受电击后,会跳上绝缘垫躲避电击; 当从安全台上跳下触及电栅遭受电击即为错误反应,记录小鼠首次跳上绝缘垫所需时间即反应时间,5分钟内跳下圆台次数( 错误次数) ,作为学习成绩。24小时后重复上述测试,记录小鼠首次从安全台跳至铜栅所需时间即潜伏时间、5分钟内跳下圆台次数( 错误次数) ,作为记忆成绩。

1. 4 取材方法与标本制备

随机选取6只,用10% 水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠,以4% 多聚甲醛颈动脉灌注法固定脑组织,静置30分钟后开颅取脑,置4% 多聚甲醛中固定过夜,流水冲洗30分钟,用各级乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,常规包块。转化切片机切片,制备脑冠状面切片,片厚约6μm。取等间隔的组织切片采用刚果红染色[11]: 切片脱腊脱水,甲醇刚果红染液浸染10 ~ 20分钟,用碱性乙醇分化液分化10秒,蒸馏水洗3分钟,95% 乙醇冲30秒; 无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。光镜下( ×400) 选取细胞数较为恒定的CA3区拍片,比较不同组小鼠的Aβ斑变化。

1. 5 统计学方法

所有数据应用SPSS 19. 0统计软件进行分析。跳台试验中学习潜伏期、学习错误次数、记忆潜伏期与淀粉样蛋白阳性面积各数据呈现正态分布以均数±标准差( ±s) 表示,符合方差齐性,采用单因素方差分析( one-way ANOVA) 进行各组之间比较,LSD、SNK进行两两比较,记忆错误次数不符合正态分布以中位数( 四分位距) 表示,以非参数检验经行各组之间比较,检验水准α = 0. 05。

2 结果

2. 1 各组小鼠学习成绩与记忆成绩对比

学习潜伏期中空白组反应时间最短,模型组反应时间最长,各组之间比较具有统计学差异( F =10. 574,P = 0. 000 < 0. 01 ) 。与模型组相比,空白组( P = 0. 000 < 0. 01) 、艾烟组( P = 0. 000 < 0. 01) 、香烟组( P = 0. 006 < 0. 01) 反应时间较短,均有统计学差异。艾烟组与香烟组无差别。学习错误次数各组之间无统计学差别。

记忆潜伏期中艾烟组记忆时间最长,模型组记忆时间最短。各 组间比较 有统计学 差异 ( F =16. 227,P = 0. 000 < 0. 01 ) 。与模型组相比,空白组( P = 0. 000 < 0. 05) 、艾烟组( P = 0. 000 < 0. 01) 、香烟组( P = 0. 011 < 0. 05) 反应时间显著延长,有统计学差异。艾烟组与香烟组无差别。记忆错误次数以模型组最多,空白组与艾烟香烟组中位数均为0低于模型组,并具有统计学差异( P < 0. 05) 。说明艾烟与艾灸可降低ApoE-/ -小鼠学习记忆能力减低程度,见表1。

注: 与模型组比较aP < 0. 05,bP < 0. 01。

2. 2 各组小鼠海马 Aβ 沉淀

经刚果红染色的ApoE-/ -小鼠海马CA3区在高倍光学显微镜下观察( 图1) ,模型组小鼠在视野范围内有明显的粉红色弥散样Aβ沉淀( 如图1中箭头所示) ,而空白组小鼠切片在同样部位未显现出淀粉样变,Aβ面积以模型组最高,空白组最低。空白组明显低于模型组( P = 0. 00 < 0. 05) ( 见表2) ,说明造模成功。ApoE-/ -小鼠经过12周艾烟与香烟治疗后,艾烟组与香烟组在相同海马区域CA3中Aβ沉淀均有不同程度的减少,艾烟组中Aβ沉淀较模型组显著降低( P = 0. 004 < 0. 05) ,较香烟组亦有减少 ( P = 0. 022 < 0. 05 ) 。说明艾烟 可以减少ApoE-/ -小鼠海马Aβ沉淀。

注: 与模型组比较aP < 0. 01,与香烟组比较bP < 0. 01。

3 讨论

现代研究证明Apo E基因与动脉粥样硬化( atherosclerosis,AS ) 、阿兹海默病 ( Alzheimer's disease,AD) 等血管疾患及中枢神经系统 ( central nervous system,CNS ) 功能障碍 有关。在心 血管系统 中,Apo E基因缺失可导致高脂血症并逐步演化为AS;在CNS内,Apo E由星形胶质细胞合成并分泌,参与维护胆固醇、磷脂的动态平衡,调节神经膜重塑时胆固醇与磷脂的动员与再分布,从而参与调节突触可塑性的维护以及神经细胞受损时的修复[12]。因此,载脂蛋白E基因敲除( ApoE-/ -) 小鼠除了应用在动脉粥样硬化症的研究中,还作为一种新型动物模型应用于认知障碍发生机制的研究中[13]。

在ApoE基因的三个亚型中Apo E4被证明与阿兹海默病有着最为密切的关系,它主要通过影响脑血管系统导致诸如Aβ沉淀等神经毒素的累积[14]。1991年,Namba等人发现,在Aβ沉积和神经原纤维中,可以检测到Apo E蛋白成分,进一步研究证实ApoE蛋白能够和Aβ形成前沉积样颗粒[15]。本实验结果表明,模型组较空白组学习记忆能力差,其海马Aβ沉淀面积显著高于空白组,证实了ApoE-/-小鼠可以产生类似阿茨海默病的脑部病理表现,说明此小鼠模型应用于认知功能障碍的研究是切实可行的。产生这种病理改变的原因很可能是由于ApoE基因的缺失,使得淀粉前体蛋白的分裂增加,导致Aβ沉积异常增多[14,15,16]。

艾烟与香烟虽然都是常见的可吸入烟雾,但其安全性却相去甚远。香烟烟雾成分复杂,其中很多化合物具有致畸、致突变的作用[17]。流行病学调查发现,吸烟会导致呼吸系统、心血管系统发病率的提高。不同于香烟烟雾,本课题组在前期对艾烟安全性研究中发现临床浓度下的艾烟烟雾不会对呼吸、心血管等系统脏器产生毒性影响,且不会引起全身过敏反应[18],初步证实了艾烟的安全性。

艾烟作为艾灸过程中的燃烧生成物,其主要成分与生物活性都影响着艾灸疗效的发挥。在课题组前期利用气相色谱—质谱技术对艾燃烧生成物进行分析[19],结果共得到85种不同的化学成分,其中大部分为芳烃、萜类和一些长链脂肪烃,而其挥发油成分则鉴定出26种[20]。艾烟作为具有独特气味的烟气,其作用途径很可能通过嗅觉。艾烟中多种气味化合物与特异受体结合激活气味受体细胞并产生电信号,通过特异性的嗅觉通路将嗅觉信息投射到下丘脑、边缘系统、海马等部位,直接参与情绪与学习记忆等行为的调控[21,22]。在艾烟生物活性研究中,发现艾烟不仅可以降低wistar大鼠血清中氧化修饰低密度脂蛋白( oxidized low density lipoprotein,ox-LDL) 和血管性假血友病因子水平,升高低密度脂蛋白受体( low density lipoprotein receptor,LDL-r) ,从而对脂质代谢产生良性调整作用[23]; 还可通过提高快速老化小鼠系8 ( senescence-accelerated mouse prone 8,SAM-P8) 小鼠脑中抗氧化酶( superoxide dismutase,SOD) 活性,调节Th1 / Th2细胞因子平衡[10],起到调节免疫和抗氧化的作用。吸烟可以引起肺癌与呼吸道损伤,但其主要毒性物质尼古丁却被报道其具有改善AD小鼠学习记忆行为的作用[24]。本次实验结果显示,艾烟与香烟均能不同程度的改善ApoE-/ -小鼠的学习记忆功能,艾烟组海马中Aβ沉淀显著低于模型组与香烟组,说明艾烟可减少ApoE-/ -小鼠脑中Aβ沉淀,其作用途径可能是通过艾烟本身的活性成分经黏膜吸收与干预嗅觉系统的神经递质,影响嗅觉传导的信号改变,调节脂质代谢,改善脑内Aβ沉积与清除之间的失衡,进而抑制Aβ沉淀的累积。

实验结果再次证明了ApoE-/ -小鼠可以作为阿茨海默病的动物模型。并说明艾烟的确可以降低ApoE-/ -小鼠的脑内淀粉蛋白沉淀,改善学习记忆功能进而起到延缓脑组织衰老的作用。

摘要：目的 观察艾烟与香烟对载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient,Apo E-/-)小鼠学习记忆能力与海马β淀粉样蛋白(β-Amyloid)沉淀的影响。方法 将13只8周龄C57BL/6小鼠作为空白对照组,27只同龄Apo E-/-小鼠随机分为Apo E-/-模型组、艾烟组、香烟组。香烟与艾烟组小鼠分别暴露于5~15 mg/m3的香烟与艾烟环境。各组小鼠每天干预20分钟,每周6天,共干预12周。于第13周进行行为学测试,之后处死动物、取材,对其脑组织海马中Aβ沉淀进行刚果红染色。结果 与模型组对比,空白对照组、艾烟组、香烟组小鼠均表现出学习潜伏期缩短,记忆潜伏期增长,记忆错误次数减少,差别有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠在视野范围内有明显的粉红色弥散样Aβ沉淀,空白对照组明显少于模型组(P<0.05)。艾烟组与香烟组在相同海马区域CA3中淀粉样蛋白沉淀均有不同程度的减少,艾烟组中Aβ沉淀较模型组显著降低(P<0.05),较香烟组亦有减少(P<0.05)。结论 艾烟能够发挥Apo E-/-小鼠的海马CA3区保护作用,减少Aβ沉淀进而改善Apo E-/-小鼠学习记忆能力。

载脂蛋白E基因 篇4

1 材料与方法

1.1 药品

莱菔子水溶性生物碱。生莱菔子采用水提醇沉方法提取而成。由吉林省中医中药研究院新药中心制备 (实验专用) 。

1.2 动物

雄性Apo E-/-小鼠30只, 雄性C57BL/6J小鼠6只, 13周龄, 体重 (22±2) g, 清洁级, 北京维通利华公司提供。

1.3 主要实验仪器及试剂

电子记重秤AWH (SI) -2.5 kg:国产;BD/BC-518-20℃冰箱:国产;4℃冰箱:国产;Q/IF-GM018-2000低温高速离心机:德国;HH·W21·600电热恒温水浴箱;小型台式离心机, 上海医疗器械厂;PERLONG;pus-2018半自动生化分析仪:北京普朗新技术有限公司。

1.4 基础饲料

玉米粉26.0%, 面粉29.0%, 豆粕28.0%, 磷酸氢钙1.4%, 石粉1.6%, 鱼粉5.0%, 骨粉5.0%, 盐1.0%, 多种维生素1.5%, 多种微量元素1.5%。

肥甘饲料:参见文献[1]。

1.5 分组及给药

将Apo E-/-小鼠 (高脂饮食) 随机分为5组, 每组6只。C57BL/6J (同种同系) :每日灌服饮用水;莱菔子水溶性生物碱高剂量组:90 mg/ (kg·d) , 溶于1 ml蒸馏水, 灌胃。中剂量组:60 mg/ (kg·d) , 溶于1 ml蒸馏水, 灌胃。低剂量组:30 mg/ (kg·d) , 溶于1 ml蒸馏水, 灌胃。血脂康组:0.2 g/ (kg·d) , 溶于1 ml蒸馏水, 灌胃。模型组给以等体积蒸馏水灌胃。给药时间为8周。

1.6 标本

每组取6只小鼠, 小鼠经摘除眼球采血后, 立即拉椎处死, 快速切取主动脉弓组织1 cm, 将其迅速放置4%多聚甲醛固定液中固定。每只小鼠的主动脉弓切片在400倍镜下选取3个不同的视野。

1.7 统计学处理

实验数据均采用均数±标准差 (±s) 来表示, 运用SPSS 13.0软件进行计算, 组间比较采用方差分析。

2 结果

实验结果表明, 莱菔子水溶性生物碱各给药组均能抑制小鼠胸主动脉核因子-кB (nuclear factor-кB, NF-кB) 蛋白表达, 并且随着剂量的增加, 抑制的作用增强;均能提高小鼠胸主动脉内皮型一氧化氮合酶 (endothlial nitric oxide synthase, e NOS) 蛋白表达, 并且随着剂量的增加, 作用增强。并且莱菔子水溶性生物碱高剂量组的作用与血脂康组相比无统计学意义。见表1。

3 讨论

1999年Ross在总结“内皮损伤反应学说[2,3]”的基础上提出了炎症学说。其提出动脉粥样硬化是一种炎症反应性疾病, 因为动脉粥样硬化有同慢性炎症反应一样的基本特征, 即:变质、渗出、增生[4]。

目前中药研究抗动脉粥样硬化作用的研究主要集中在降血脂、抗过氧化、血管内皮保护、抑制平滑肌细胞增殖迁移等方面。经过文献检索发现中药抗动脉粥样硬化研究从炎症细胞浸润、细胞因子表达方面入手的较少。此外, 进行试验所选药物大多为复方且以个人经验方为主, 对于单味药、单体有效成分的研究较少。

注:与模型组比较, aP﹤0.01;与C57BL/6J比较, bP﹤0.01, cP﹤0.05;与血脂康组比较, dP﹤0.01, eP﹤0.05;n代表视野。

综上, 课题组在对莱菔子单味药有效成分提取的基础上进行试验, 从保护血管内皮, 抗炎的机制方面进行研究。本试验结果表明莱菔子水溶性生物碱能够提高Apo E-/-小鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶的表达, 抑制核因子-кB的表达。由于在动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 的进程中, NF-кB是多种炎症因子的启动因子, 在AS的发展过程中发挥着关键作用。而NO有抗炎作用。已有研究证实, 由于NO能够作用于NF-кB的抑制因子, 减少各种致炎症因素刺激内皮细胞达到抗AS的作用[5]。可见, 莱菔子水溶性生物碱通过增加NO的合成, 发挥NO的生理作用, 进而达到抗AS的目的。由于, 本实验选用的动物模型为基因缺陷小鼠, 课题组发现中医学先天禀赋因素在AS的发病中有重大作用, 并且, 莱菔子水溶性生物碱具有干预作用。

参考文献

载脂蛋白E基因 篇5

1 对象与方法

1.1 对象

正常人100名, 年龄20~65岁, 男53、女47, 均为内蒙古通辽地区体检后的健康人。按年龄分为3组, <39岁组30名、≥39岁且<50岁组30名、≥50岁组40名。

1.2 方法

1.2.1 血液标本采集

取空腹静脉血5 m L, 采血后1 h内采用离心机4 000转/min离心10 min, 分离血清, 分装入Appendoff管, 存入-80℃冰箱保存。标本采集后, 统一检测血清Aβ40、Aβ42、Apo E的含量。

1.2.2 检测方法

应用双抗体夹心酶联免疫吸附法 (doubleantibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 测定, 严格按说明书操作。

1.3 试剂与仪器

MR-96A酶标仪、MW-12A洗板机均购置深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。人Aβ40、Aβ42、Apo E的检测采用美国invitrogen公司的人Aβ40、Aβ42和Apo E酶联免疫检测试剂盒。

1.4 统计学方法

实验数据均以±s表示, 运用Graph Prism·5统计软件数据进行方差分析, 组间数据比较用单因素方差分析, 以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

通辽市各年龄段健康人群血清Aβ40和Aβ42水平在<39岁组最低, ≥39岁且<50岁组最高, ≥50岁组低于≥39岁且<50岁组;Apo E水平在≥39岁且<50岁组最低, <39岁组最高。见表1。

3 讨论

Aβ是血小板β淀粉样前蛋白 (amyloid protein precursor, APP) 在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下分解而成, Aβ主要有Aβ40和Aβ42两种形式, 在正常情况下, 脑内持续产生Aβ, 但小胶质细胞可清除淀粉样沉积物, 以此减少和防止老年斑 (senile plaques, SP) 形成。正常人血小板内含有丰富的APP, 并且含有与APP代谢有关的分泌酶, 且其活性与年龄有关。在AD患者中, 血清Aβ含量明显异常[3]。人类Apo E是Apo E基因编码由299个氨基酸组成的多态性蛋白, 可在多个器官中合成, 其中肝脏合成最多, 神经元细胞在特定条件下也可产生少量Apo E。Apo E是脂蛋白复合物的主要成分, 具有调节脂质代谢、维持胆固醇平衡、参与中枢神经系统的生长发育与损伤修复的作用, 但Apo E也有加速Aβ的沉积、促进神经元纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs) 的形成、参与神经炎症反应并导致行为缺陷的作用, 其完全而确切的机制尚待进一步研究阐明[4]。

美国心脏协会2013科学年会公布了丹麦的一项研究, 该项研究指出, 无论Apo Eε4基因型存在与否, 血浆Apo E水平降低均与AD升高具有相关性。该项研究结果提示, 血浆Apo E水平可能是AD的临床前血浆标志物, 同时也是预测未来AD的首个血浆标志物[5]。

为此, 我们检测了不同年龄段健康正常人的血清Apo E和Aβ40、Aβ42含量, 结果显示, 不同年龄阶段的血清Apo E和Aβ40、Aβ42含量不同, 其中≥39岁且<50岁组血清Aβ40、Aβ42最高、而Apo E最低, 提示在此年龄阶段, APP分解为Aβ40和Aβ42增加, Apo E合成减少, 患阿尔茨海默病风险升高, 而<39岁组血清Aβ40和Aβ42水平最低、Apo E最高, ≥50岁组居二者之中。以上结果, 考虑是否与≥39岁且<50岁年龄阶段机体代谢有特殊性有关, 有待于进一步深入研究和探讨。

摘要：目的:探讨正常人血清β-淀粉样肽及载脂蛋白E水平与年龄的相关性。方法:应用双抗体夹心酶联免疫吸附法 (double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 测定正常中青年人血清Aβ40、Aβ42和及载脂蛋白E (apolipoprotein E, Apo E) 水平含量。结果:血清β-淀粉样肽40 (β-amyloid peptide 40, Aβ40) 和Aβ42水平在<39岁组最低, ≥39岁且<50岁组最高, ≥50岁组低于≥39岁且<50岁组;Apo E水平在≥39岁且<50岁组最低, <39岁组最高。结论:≥39岁且<50岁组血清Apo E水平降低而Aβ40和Aβ42水平升高。

关键词：正常人,β-淀粉样肽,清载脂蛋白E,年龄

参考文献

[1]马英, 曹云鹏.阿尔茨海默病的神经免疫炎症发病机制及其治疗研究进展[J].中国老年学杂志, 2010:21 (30) :3200-3203.

[2]张耀栋, 徐勇, 聂宏伟, 等, 中国人群阿尔茨海默病载脂蛋白E基因多态性的Meta分析[J].中国循证医学杂志, 2011:11 (4) :433-436.

[3]曲艳, 刘萍, 李晓红.阿尔茨海默病生物学标志物研究进展[J].医学与哲学, 2013, 23 (108) :55-58.

[4]刘倩, 吴为辉, 李人望, 等, 载脂蛋自E与阿尔兹海默病的相关研究进展关[J].化学进展, 2007, 19 (12) :2007-2010.

载脂蛋白E基因 篇6

1 材料与方法

1.1 研究对象

经医院医学伦理委员会批准后, 所有患者签订知情同意书后, 收集2010年7月~2012年7月期间, 广州市区三所医院, 包括中山大学附属肿瘤医院、广州医学院附属肿瘤医院和广东药学院附属医院, 新诊断的原发性NSCLC病例423例。收集个体基本特征, 包括性别、年龄, 肺癌相关因素, 包括吸烟、饮酒和肿瘤家族史。病例相关资料包括临床分期、病理组织类型。所有病例均经组织病理学检查确诊为原发性NSCLC, 且尚未开始接受化疗或放疗;病例病理组织类型不明或T/N/M分期不清的被排除研究。

1.2 基因分型

1.2.1 DNA提取

采用TIANGEN公司提供的全血基因组DNA提取试剂盒, 从5 m L外周血中提取基因组DNA。所有DNA样本浓度均超过50 ng/μL, OD260/OD280在1.8~2.0之间。

1.2.2 SNP选择

参考Hapmap数据库 (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en) , 查询位于CDH1基因DNA序列功能区, 包括基因上游3 000 bp启动子区, 5'-非翻译区 (5'-UTR) , 外显子区和3'-UTR上的, 在中国人群 (CHB人群) 低发等位基因频率 (minor allele frequency, MAF) >5%的常见SNPs位点。附图显示, 共发现3个满足上述条件的SNPs, 分别为位于该基因启动子区的rs16260C>A, 3'-UTR区的rs13689T>C和rs8049282C>T。

1.2.3 基因型检测

采用Taqman基因分型技术进行基因型检测。利用ABI公司提供的primer express oligo design V2.0软件进行引物和探针设计, 并委托南京骥骜生物科技有限公司合成。检测3个SNPs所用的引物和探针序列如附图所示。Taqman基因分型PCR体系为16μL, 内含样本DNA 2μL, ABI Master mix 7μL, 上下游引物与探针混合物0.1μL, dd H2O 7μL。在ABI 7500上进行PCR扩增并分型, 扩增反应条件为95℃预热10 min, 95℃变性15 s, 60℃退火延伸60 s, 共40个循环。附图所示为各SNPs的基因分型图及所用引物和探针序列。

1.3 统计分析

应用SAS 9.3软件进行统计分析。采用χ2检验分析不同临床分期的病例组在性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤家族史和病理组织类型中的差异;采用Spearman等级相关分析探讨各SNP与NSCLC临床分期的关系;利用多因素非条件Logistic回归模型, 以性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤家族史和病理组织类型为协变量, 分析CDH1基因的遗传变异与NSCLC进展包括临床分期、肿瘤大小以及在肺内和临近器官的扩散程度 (T) 、区域淋巴转移状态 (N) 、有无远处转移 (M) 的关联。采用比值比 (odds ratio, OR) 及其95%可信区间 (confidence intervals, CI) 表示关联的强度。所有检验均为双侧检验, 检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 不同分期病例组间人口学特征分布

本研究共收集NSCLC423例, 其中I期病人51例 (占12.1%) , II期36例 (占8.5%) , III期120例 (占28.4%) , IV期216例 (占51.0%) 。如表1所示, 不同分期的NSCLC组, 在年龄、性别、吸烟史、饮酒史和肿瘤家族史的频率分布上, 差异均无显著性 (所有P>0.05) 。然而, 病理组织类型在各组间差异有显著性 (P=0.002) 。在后续多因素Logistic回归模型中校正了这些因素, 以获得所研究SNP位点的真实效应。见表1。

2.2 CDH1基因的SNPs与NSCLC进展的关系

CDH1基因各SNPs在不同临床分期的NSCLC组间的频率分布如表2所示, rs16260C>A、rs13689T>C和rs8049282C>T三位点在四个分期组间皆差异无显著性 (P>0.05) 。Pearson相关分析进一步显示, rs16260C>A变异位点与NSCLC临床分期有显著关联 (Spearman相关系数=0.120, P=0.012) , 但rs13689T>C和rs8049282C>T与NSCLC临床分期无显著关联 (rs13689T>C:Spearman相关系数=-0.022, P=0.652;rs8049282C>T:Spearman相关系数=-0.002, P=0.967) 。因此, 我们进一步分析了rs16260C>A位点与NSCLC分期与转移 (T、N和M) 的关联。如表3所示, 相较CC基因型携带者, A变异基因型 (AC+AA) 携带者初次诊断时是Ⅲ期和IV期的概率显著上升了145%和206% (Ⅲ期:OR=2.45, 95%CI=1.10~5.49, P=0.029;Ⅳ期:OR=3.06, 95%CI=[1.42-6.59], P=0.004) , 后者为Ⅱ期的概率亦有所上升, 但效应差异无显著性。此外, rs16260C>A位点变异还可能促进NSCLC的远端转移。A变异基因型携带者在初次确证为NSCLC时发生远端转移的概率是CC基因型携带者的1.50倍 (OR=1.50, 95%CI=1.00~2.25, P=0.049) 。然而, rs16260C>A位点变异对NSCLC肿瘤大小以及在肺内和临近器官的扩散程度T及淋巴转移N无显著效应。

注:P值是双侧的χ2检验

例 (%)

注:1) P值是双侧的χ2检验;2) P值Spearman等级相关分析

注:a多因素非条件Logistic回归模型, 校正年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史和肿瘤病理组织类型

3 讨论

细胞黏附在癌细胞的侵袭转移过程中有至关重要的作用, E-cadherin蛋白在肿瘤细胞中的表达缺失可导致癌细胞间黏附力降低, 使其可从原发位置脱落, 从而可促进转移的发生。大量的研究已证实, E-cadherin的表达与恶性肿瘤的分化程度、侵袭力、转移呈负相关而与预后正相关。近年来, 多个研究报道了E-cadherin编码基因CDH1上的多个SNPs与人群肿瘤发病有显著关联, 但与肿瘤进展相关的报道却较少。rs16260C>A (又名-160C>A) 位点变异位于CDH1基因启动子区, 被报道与膀胱癌[8]、前列腺癌[13]、胃癌[14]的发病相关。该SNP还被报道与胃癌的侵袭和淋巴结转移密切相关[12]。本研究也发现该位点变异与NSCLC进展有显著关联, 与这些研究结论一致。然而, 亦有研究报道rs16260C>A与肿瘤发病无关, 如:ZHANG[7]发现其与我国人群食管癌发病和转移皆无显著关联、CUI等[6]通过含有14个研究的meta分析, 认为该SNP与胃癌发病无关, 这可能与人群遗传背景和肿瘤之间的异质性有关。由此可见, 本研究结论仍需在其他种族人群中进行进一步验证。

进一步分析rs16260C>A与NSCLC进展的关系发现, rs16260A变异基因型NSCLC患者在初次诊断时即为晚期肺癌 (III期或IV期) 的概率要显著高于rs16260CC正常野生基因型患者。前者发生远端转移的概率同样显著高于后者。然而, 本研究未发现该SNP对肺癌肿瘤大小和淋巴结转移有显著影响。rs16260A等位基因可提高CDH1基因的转录活性, 而促进E-cadherin的表达[15]。生物信息学分析也显示当rs16260C变为A时, 可导致肿瘤抑制蛋白BRCA不能识别并结合到CDH1基因启动子区。证据显示BRCA可调控CDH1基因的表达, 因此, 该SNP可能通过抑制BRCA的结合而导致E-cadherin的表达增加[16], 从而促进肿瘤的侵袭转移, 这与被研究的结论是一致的。