芯片—基因组杂交技术

芯片—基因组杂交技术（精选九篇）

芯片—基因组杂交技术 篇1

1材料与方法

1.1标本来源、采集、保存

676例标本取自2008年7月—2009年1月本院疑似HPV感染的慢性宫颈炎患者,年龄21～59岁。利用采样器采集宫颈口脱落细胞的样本,将采集刷置于标本保存液中,4℃冰箱保存待用。

1.2试剂及仪器

HPV DNA抽提试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),HPV基因分型检测试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检测21种HPV亚型,包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内对照点(用于监测PCR反应)和Biotin对照点(用于监测显色系统);扩增仪(PE 9700,美国ABI公司);医用核酸分子快速杂分仪(中国凯普公司)。

1.3方法

分泌物中细胞的DNA提取、PCR扩增、快速杂交和观察结果等过程严格按照说明书操作。

2结果

2.1 HPV阳性的检出率及各型的构成

676例样本中HPV阳性者共175例,检出率为25.9%,在检出的175例阳性者中,各型构成分别为:单一低危型占16.0%,单一高危型占74.9%,中国人常见型占9.1%,另有27例为混合感染者,占15.4%。共检出18种HPV型别。见表1。

2.2 HPV感染的年龄分布

将本实验HPV阳性按照4个年龄段来分析,即<21岁、21～35岁、36～45岁、≥46岁,各组HPV感染率见表2。

注:常见型中有13例为高危型,3例为低危型。

注:混合型为高、低危型混合感染者。

3 讨论

HPV属乳多空病毒科乳头瘤病毒属,为环状双链DNA病毒,也是一种严格嗜上皮病毒。一般认为,各种鳞状上皮(包括皮肤角质层、无角化黏膜)都易于感染HPV,在鼻黏膜、喉黏膜和子宫颈黏膜及在愈合伤口边缘区的柱状上皮和鳞状上皮移行区带处,带有病毒DNA的上皮细胞也可以不出现任何临床表现而呈潜伏状态。宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,临床证明95.0%～99.7%宫颈癌和高危型HPV感染有关[2,2,2,2]。而且不同亚型HPV对子宫颈癌致癌性有不同影响,因此,准确诊断HPV感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及治疗效果监测有着重大意义。当机体感染HPV时,病毒基因可整合到宫颈细胞,机体免疫系统可识别感染细胞并加以消除。若感染细胞继续存活并增生,可发展为癌前病变或宫颈癌。有文献报道高危亚型的HPV的持续性或反复感染已被确定为宫颈癌的主要原因,由于不同亚型的HPV其编码外壳蛋白的基因变异很大,不同的亚型HPV之间基本上没有交叉保护抗体,容易造成不同高危型HPV感染或多次感染[3]。而Lee等[4]进一步研究多重感染与宫颈癌的关系,结果显示单一的HPV感染使患病风险增加19.9倍,而多重感染HPV使患病风险增加到31.8倍。

本文通过对676例妇科门诊及住院慢性宫颈炎的患者进行研究,检测出了21型HPV-DNA中的18型,高危未发现HPV-39型、HPV-51型、HPV-56型,低危型未发现HPV-42型、HPV-44型。表1结果显示,676例样本中检出HPV阳性175例,检出率25.9%,高危占74.9%,低危占16.0%,中国人常见型占9.1%。高危型患者其亚型感染率由高到低依次为HPV-16、18、52、33、58、68、31、35、39、45,低危型依次为HPV-6、11、43,中国人常见型依次HPV-53、CP8304、66,高危型基因型以HPV-16、18型为主,其次HPV-52、33型,高危型感染达131例,占总体的74.9%.可见高危型感染的严重性。HPV分布有地理性,有文献[5]指出全世界高危型HPV主要是HPV-16、18型,其次是45、31、33型。而本文显示高危型分布有所不同,HPV-52型为仅次于HPV-16、18型的第三常见亚型。黄光孙等[6]人报道了HPV-58型为仅次于HPV-16、18型的第三常见亚型,这可能与地理的分布的差异有关。表2结果显示,本地区HPV感染高峰为<46岁年龄组,其阳性率为30.3%,与Burk等[7]报道HPV感染高峰为青年组的观点一致,且中青年组多为短暂的感染。而对于大于46岁的感染者,可能存在持续感染的危险,特别是高危型感染,应定期进行HPV分型检测和TCT(液基细胞学检查),以便对宫颈癌进行早期诊断。

HPV分型检测研究一直受到国内外学者的高度重视[8]。目前,对HPV感染的分型诊断主要方法有斑点杂交、Southern印迹及实时荧光PCR等。传统的斑点杂交、Southern印迹由于杂交过程操作复杂,耗时长(杂交需十几个小时甚至1d),检测低拷贝基因的敏感性不足,可能需要使用同位素等.实时荧光PCR检测HPV DNA已经应用于临床,其灵敏度和可靠性已得到认可,但目前能检测的HPV亚型十分有限,主要包括常见的HPV 6,11,16,18 4种亚型,易漏诊其他HPV亚型的感染,不利于流行病学和病因学的进一步深入研究。基因芯片是近年来发展起来的可对病原体核酸进行高通量快速检测的技术。HybrMax法是导流杂交技术结合低密度基因芯片技术,利用PCR扩增提高检测的灵敏度,分子杂交特异性高,是HPV基因型分型检测比较好的方法。

本文通过DNA杂交技术这一高通量基因检测技术,仅一次扩增,既可检验21种高、低、中国人常见型。该方法具有通量高、灵敏度高、特异性好、可检测多重感染等优点,可用于宫颈癌等疾病的早期预警和诊断,有利于防治宫颈癌的发生并了解HPV感染的转归,也可以用于大规模的临床筛查及为HPV疫苗的研究提供了可靠的资料。

摘要：目的 探讨导流杂交基因芯片技术作为临床检测人乳头瘤病毒(HPV)常规方法的实用性,及在宫颈癌筛查中的临床应用价值。方法 采用导流杂交基因芯片技术对676例疑似HPV感染的标本进行基因诊断和分型,检测了13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。结果 676例样本中检出HPV阳性175例,检出率25.9%,高危占74.9%、低危占16.0%、中国人常见亚型占9.0%、2种或2种以上亚型混合感染占15.4%。结论 导流杂交基因芯片技术适合于临床筛查HPV感染,能更好的检出HPV感染的基因型,为临床提供较有价值的实验资料,对宫颈癌的筛查有较大的帮助。

芯片—基因组杂交技术 篇2

摘要：抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术，它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。

关键词：基因克隆;抑制性差减杂交;应用

生物体的生命过程伴有异常复杂的生物生化变化，是生物体内相关基因的有序表达和调控的结果。对相关差异性表达基因进行深入研究，能够更加深入地了解生物体的生命活动规律。目前，分离差异性表达基因的主要技术为杂交技术(subtractive hybridization)和差示筛选技术(differential scre-ening)，但这些技术存在重复性差、敏感度低等缺点。随着现代 PCR 技术的发展，一系列基于 PCR 技术的分离差异性基因表达的新技术被开发出来。SSH技术就是一种利用抑制性 PCR 和以差减杂交技术为基础的一种简单、快速地分离差异性表达基因的方法，该技术在研究基因克隆、基因表达及基因功能等方面有明显的优势[1].笔者对使用 SSH 技术进行研究的应用现状及其未来前景进行了简单介绍，旨在使 SSH 技术的应用得到更加深入的认识。

1SSH技术的过程及其优缺点

1.1SSH技术的过程

SSH 研究应用的材料可以是基因组 DNA,也可以是 c DNA,用于分离克隆 2 个样品中特异基因或者是差异性表达的基因。基本过程是：抽提 2 种不同生物体的 DNA 或 c DNA;将经限制性内切酶消化后的 Tester DNA 分为 2 个部分，分别与 2 种接头连接;再将这 2 个部分序列于过量酶切的 Driver DNA杂交，当这 2 个部分 DNA 被最终混合杂交后，就允许了同源性的单链 DNA 分子杂交;通过 PCR 扩增、克隆即可分析所差减的序列。

1.2SSH技术具有的优点[2]

高效高速。在一次 SSH 杂交试验过程中，就可以同时分离出上百个差异性表达的基因。灵敏度高。在退火时，高丰度的单链 DNA 同源杂交的速度快于低丰度的单链 DNA,导致原来在丰度上有差别的单链 DNA 在相对含量上能够达到一致，从而对于低丰度的基因也可以通过基因克隆表达出来。假阳性率低。经过 2 次杂交和 2 次 PCR 扩增选择性地扩增差异表达目的 DNA ，提高了特异基因的筛出率，使得假阳性率大大降低。简单易行，对仪器设备要求不高。背景低、重复性高。

1.3SSH技术存在的不足[2]

基因组中酶切位点较少的不适用 SSH 技术;分离到的差异表达基因片段，还需要扩增全长;起始材料相对要求较多，不适于来源困难的样品;对试验材料的要求较高，试验材料间差异性要求较低。

2SSH技术的应用

2.1SSH技术在医学上的应用

孙守娟等[3]采用 SSH 技术 ,构建了舌鳞癌 Tca8113 细胞系中高、低醛脱氢酶活性细胞差异表达基因 c DNA 文库，用 Trizol 分别提取 2 个细胞的总RNA;用 SSH 技术对 2 组 RNA 进行差异基因筛选和扩增，克隆片段均匀分布在 250~750 bp,无假阳性克隆。测序结果经同源性比对分析可知 ,与肿瘤有关的基因有SLC25,A13 NPC1,KLHL2,BARD1,WAPL,Notch2,EEF2K.车红花等[4]通过 SSH 技术，克隆了受病毒攻击的宿主细胞中被中药有效成分调控的基因，结果显示，核糖体蛋白 L27a 在中药组中高表达，病毒组中表达减弱或被抑制;益气活血中药复方能够影响受 CVB3 攻击的宿主细胞核糖体蛋白 L27a 的表达，有效保护心肌、阻断病程进度，实现治疗病毒性心肌炎的目的。

李守明等[5]采用抑制性差减杂交技术，鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因，构建了一个近200 个克隆的差减基因文库，得到 93 个有效克隆，从中克隆和鉴定了母鼠铅暴露致使学习和记忆能力显着下降的幼鼠中海马差异表达的基因，共 43种不同的基因以及 4 种未知功能基因。这些基因包括一些看家基因和一些与细胞蛋白折叠、信号传导、应激响应及 DNA 甲基化相关功能的基因。

2.2SSH技术在植物学上的应用

刘蕾等[6]应用 SSH 筛选植物青枯菌致病相关基因，研究该菌株致病力分化机理，以 Po82 为待测菌株，构建了抑制性差减杂交文库，结果表明，具有较高的接头连接以及文库构建效率，插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序，共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明，所得差异基因主要涉及新陈代谢、膜结构、转坐酶、毒力、分泌蛋白、转录因子以及未知功能等。闵卓等[7]以赤霞珠葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料(夏芽作为驱动方，冬芽作为试验方)，采用 SSH 技术构建冬芽和夏芽的c DNA 文库，筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段，结果发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因，如编码 MADS FLC-like 蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素 P450、细胞壁关联蛋白等基因;同时还认为，线粒体蛋白基因、开花相关基因、未知蛋白基因、ATP 合成酶β亚基基因、MADs FLC-like 蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。叶晓明等[8]以温敏雄性不育系 K121S 在可育温度 10℃下和不育温度 26℃下三核期花蕾为材料，以可育温度下的c DNA 为驱动子，采用 SSH 技术构建了不育温度下SSH 文库，随机挑选 97 个阳性菌落测序，得到 20个表达序列标签(EST)，包括与 ATP 合成酶β亚基、Rubp 羧化酶小亚基同源的 EST 等，为进一步获得育性转换相关基因和揭示 K121S 的育性转换分子机制奠定了基础。

2.3SSH技术在微生物学上的应用

李淼等[9]采用 SSH 技术寻找副猪嗜血杆菌的毒力基因，以无毒力菌株 H465 和有毒力菌株 SW124为材料，构建了 SSH 文库，使用 Southern 杂交和PCR 鉴定对差异基因片段进行筛选结果显示，从构建的文库中得到 7 个特异性差异基因片段，其中，2个差异基因片段与功能未知蛋白基因有关，5 个片段分别与膜多糖磷酸酶 / 糖基转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、荚核糖体蛋白丙氨酸、转移酶噬菌体重组蛋白和 ABC 型硝酸盐，碳酸氢盐 / 磺酸盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性。

祝昊丹[10]采用 SSH 技术将无毒株 SH040917SS9与强毒株 SH040917 进行杂交，共获得 61 个毒力特异的基因片段，结果表明，这些片段与 30 种不同的蛋白编码基因具有同源性，包括类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶、DNA 核酸酶、溶血素相关蛋白酶、苏氨酸磷酸化蛋白酶等。

戴建君[11]采用 SSH 技术对禽致病性大肠杆菌菌株和人尿源性大肠杆菌差异性表达基因序列进行了相关研究，结果发现了 28 个新毒力基因片段，并对这些基因片段流行病学进行了调查研究，发现大部分新的毒力基因与流行病学有较大的相关性。

2.4SSH技术在动物学上的应用曲

宪成等[12]应用 SSH 技术构建了黄鳝 IV 期卵巢和间期性腺的`差减 c DNA 文库，正向差减杂交以间期性腺为试验方，IV 期卵巢为驱动方;反向差减杂交以 IV 期卵巢为试验方，间期性腺为驱动方，将获得的差减 c DNA连接质粒载体，然后转化大肠杆菌 DH5α，最后获得的正、反向差减文库分别含461,678 个重组子。经 PCR 扩增鉴定，插入片段范围为 200~2 000 bp.随机选取正、反文库共 100 个阳性克隆测序分析，得到 90 个有效基因片段，与Gen Bank 进行 BLASTx 和 BLASTn 同源比对，进一步从文库中选取 2 个基因用于半定量 RT-PCR,对文库质量进行验证，结果表明，所建文库能够达到富集 IV 期性腺差异表达基因的目的。黄鳝性腺差减文库的构建，为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础。

李超等[13]利用 SSH 技术，以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞 c DNA 为材料，构建了罗非鱼免疫前后正、负 2 个 c DNA 差减文库，并采用地高辛(DIG)标记差减文库 c DNA 作为探针，进行差异表达片段的筛选鉴定，结果显示，2 个文库重组率均在90%以上，插入片段在 300~900 bp,接头连接效率超过 50%,差减效率非常高，阳性率均超过 70%.杂交筛选后，对正、负文库各挑选 30 个阳性克隆进行测序组装聚类，正、负文库分别获得 16,18 条 EST,所得序列经 Gen Bank 同源性分析，正、负文库分别有 10,11 条 EST 获得功能注释，且分别有 6,7 条unigene 没有同源性匹配，定为未知新基因。

刘晶等[14]采用 SSH 技术，研究营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响，对构建的文库中 48 个克隆进行了测序，结果发现了 32 个已知功能基因和 16 个新基因。王嘉等[15]采用 SSH 技术研究皱纹盘鲍 Vc缺乏诱导的差异表达基因，共获得了 63 个基因片段，其中，已知功能基因有 34 个;在 c DNA 文库中获得 39个片段，其中，已知功能基因有 21 个，包括细胞代谢、生物调节等相关基因。

另外，梅冰[16]利用 SSH 技术对溶藻弧菌的毒力相关基因进行筛选和鉴定研究，构建溶藻弧菌毒力菌株 SSH 文库，结果显示，所构建的溶藻弧菌毒力菌株的 SSH 文库含有 8 个已知的常见毒力相关功能基因，该文库还含有 166 个未知新基因，占文库中总基因数的 68.44%,溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于这些未知新基因中。说明构建的 SSH 文库中 166 个未知新基因很有可能包含有溶藻弧菌的关键毒力基因，为溶藻弧菌毒力基因的鉴定和今后开展溶藻弧菌基因工程疫苗的研制奠定了重要的基础。

3展望

在现代生命科学研究领域中，差异基因的筛选和鉴定已成为现代分子生物学研究的热点。SSH 技术操作简单、所需试验仪器廉价、试验过程简单、阳性率高，分离差异基因提供了一种强有力的工具。随着 SSH 技术的不断改进，在生物研究的各个领域，如微生物学、动物学、植物学、医学等领域得到了大力的推广。在未来的发展中，SSH 将与其他分子生物学技术相结合，各取所长，为研究差异基因的表达提供新的技术手段。

参考文献：

[1]顾克余，翟虎渠。 抑制性扣除杂交技术(SSH 技术)及其在基因克隆上的研究进展[J]. 生物技术通报，,15(2)：13-16.

[2] Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A P. Suppression subtractive hy-bridization:a method for generating differentially regulated or tis-sue-specific c DNA probes and libraries [J]. Proc Natl Sci USA,,93(12)：6025-6030.

[3]孙守娟，季平，邓诚，等。 基于舌鳞癌 Tca8113 细胞醛脱氢酶活性不同构建差异表达基因 c DNA 文库 [J]. 第三军医大学学报，,34(3)：226-230.

[4]车红花，张明雪，何伟，等。 益气活血中药复方对 CVB3 大鼠心肌细胞感染模型核糖体蛋白 L27a 表达的影响 [J]. 辽宁中医杂志，2012,39(9)：1862-1864.

[5]李守明，刘昌英，谢国秀，等。 应用抑制性消减杂交技术鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因 [J]. 中国当代儿科杂志，,12(10)：820-824.

[6]刘蕾，徐进，许景升，等。 应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因[J]. 农业生物技术学报，2012,20(7)：745-755.

[7]闵卓，耿万刚，房玉林，等。 应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因 [J]. 中国农业科学，,47(5)：1029-1040.

[8]叶晓明，彭少丹，陈升位，等。 不育温度下油菜温敏雄性不育系SSH 文库的构建[J]. 云南农业大学学报，2014,29(1)：6-10.

[9]李淼，李春玲，宋帅，等。 应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌 4 型菌株可能毒力基因[J]. 华北农学报，2012,27(1)：57-62.

[10]祝昊丹。 猪链球菌 9 型毒力基因的筛选及鉴定[D]. 南京：南京农业大学，.

[11]戴建君。 禽致病性大肠杆菌 IMT5155 疑似毒力基因的鉴定及分析[D]. 南京：南京农业大学，2010.

[12]曲宪成，尚晓莉，程翠，等。 黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析[J]. 中国水产科学，2011,18(1)：23-28.

[13]李超，陈明，李莉萍，等。 罗非鱼免疫前后白细胞 c DNA 差减文库的构建及鉴定[J]. 西南农业学报，2010,23(4)：1286-1292.

[14]刘晶，张文兵，麦康森，等。 皱纹盘鲍外套膜耐维生素 E 缺乏消减c DNA 文库的构建[J]. 中国水产科学，,14(3)：383-389.

[15]王嘉，马洪明，麦康森，等。 皱纹盘鲍肝胰腺和肾脏维生素 C 缺乏诱导的差异表达 c DNA 文库的构建 [J]. 中国水产科学，2010,17(4)：619-629.

芯片—基因组杂交技术 篇3

关键词：转基因；杂交棉品种；选育；栽培技术

中图分类号： S562.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0104-02

收稿日期：2013-10-30

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）2029]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2013380）；国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：2012ZX08013009-003）。

作者简介：蔡立旺（1965—），男，江苏盐城人，硕士，副研究员，主要从事棉花与特经作物研究。Tel：（0515）68668953；E-mail：jsclw86@163.com。苏棉29（代号：盐G0801）是江苏沿海地区农业科学研究所最新育成的高产、优质、抗病虫、中熟棉花新品种。该品种以盐2008与盐1136杂交，于2008年育成，属转基因抗虫棉杂交一代种。苏棉29的母本盐2008为中棉所12/泗棉2号//徐州576选择的后代，父本盐1136为苏棉15号//GK19杂交选择的后代，GK19是国产Bt基因导入泗棉3号材料中选育出的抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病、丰产稳产、品质优良的转基因抗虫棉新品种[1]。2013年经江苏省农作物品种审定委员会第五十三次会议审定通过，江苏省农业委员会2013年第6号公告公布（审定编号：苏审棉201302）。

1选育经过

2006年以盐2008为母本，盐1136为父本进行杂交；2007年、2008年继续做杂交，参加所级品种比较试验，同时进行抗性鉴定与品质测试；2009年参加江苏省棉花品种预备试验；2010—2011年参加江苏省杂交棉花品种区域试验；2012年参加江苏省棉花品种生产试验并于2013年2月获得农业转基因生物安全证书[农基安证字（2012）第099号]，2013年通过江苏省审定定名。

2特征特性

苏棉29出苗较好，前中期长势较强，后期长势稳健，生育期内整齐度好。株型较紧凑，通风透光性好，茎秆较粗壮，茸毛较少，耐肥抗倒；叶片中等大小，叶色较淡；果枝长，果节短，层次清晰，正常果枝6～7节，全株果节较多，果枝上举，果枝与主茎的夹角从下向上逐步减小，通风透光条件较好，有利于上、中、下部三桃齐结，单株成铃率40%以上；单铃重较高，铃卵圆形；吐絮畅，花色白，易采摘。2010—2011年江苏省区试平均结果：生育期139天。株高120.4 cm，单株果枝18.4台，果枝始节位7.2节，单株结铃35.1个，单铃重6.1 g，衣分41.5%，子指11.0 g，霜前花率87.3%。农业部棉花品质监督检验测试中心测试：HVICC纤维上半部平均长度30.9 mm，整齐度指数86.3%，断裂比强度29.0 cN/tex，马克隆值4.8，纺纱均匀性指数150。江苏省农科院植保所病圃接种及抗棉铃虫生物学鉴定：枯萎病指18.0，黄萎病指34.7，耐枯萎病，耐黄萎病，高抗棉铃虫。

3产量表现

苏棉29于2007年、2008年参加江苏沿海地区农科所所级品种比较试验。2年试验结果，苏棉29籽棉产量 3 898 kg/hm2，较对照泗杂3号增产12.32%；皮棉产量 1 573 kg/hm2，较对照增产12.08%，居10个参试品种首位。2009年参加江苏省棉花品种预备试验（G组），产量水平居23个杂交棉参试品种首位，籽棉产量为3 603 kg/hm2，皮棉产量为1 629 kg/hm2。皮棉产量是对照泗杂3号的111.2%。

苏棉29于2010—2011年参加江苏省棉花品种区试，2010年参加A组试验，2011年参加B组试验。2年12点次中，6点次皮棉产量居参试品种首位，3点次居第2位，仅1点次较对照减产1.4%，其余11点次均较对照增产。2年区试结果，苏棉29的籽棉产量4 185 kg/hm2，皮棉产量 1 737 kg/hm2，分别为对照品种泗杂3号的110.6%和1085%，2年皮棉产量均极显著高于对照品种，皮棉产量也是自2006年泗杂3号作为江苏省杂交棉花品种区试对照品种以来，增产幅度最大的棉花品种[2]。

苏棉29于2012年参加江苏省棉花品种生产试验，在6个试点中，苏棉29的籽棉产量和皮棉产量均较对照品种增产，其中籽棉产量4 176 kg/hm2，为对照的106.3%，皮棉产量1 745 kg/hm2，为对照的108.1%。

4稳产性

以苏棉29（盐G0801）参加的2010年（11个品种，7个试点）和2011年（11个品种，5个试点）江苏省杂交棉花品种区域试驗产量数据为基础，采用GGE双标图法[3-4]，作出各品种产量和稳定性分布图（图1、图2）。图中原点与品种边线到平均环境轴（ATC，右下为正向）的投影距离表示品种丰产性，正向距离越长表示丰产性越好；品种到平均环境轴的距离表示稳产性。可以看出，苏棉29是丰产性与稳产性结合较好的品种。

5纤维品质

农业部棉花品质监督检验测试中心HVI900系统对2010—2011年江苏省区试品种纤维品质测试结果，苏棉29与泗杂3号的纤维品质在年度间有一定的差异。2年平均：苏棉29的上半部纤维长度30.9 mm、比强度29.0 cN/tex、马克隆值4.8；泗杂3号的上半部纤维长度31.0 mm、比强度29.0 cN/tex、马克隆值4.4。苏棉29与泗杂3号品质相当，3项综合指标均达到农业行业标准《农作物品种审定规范 棉花》（NY/T 1297—2007）Ⅲ型标准[5]。

nlc202309012230

6抗病虫性及适应范围

2010—2011年江苏省农业科学院植物保护研究所以泗棉3号为枯、黄萎病感病对照品种，对所有参试品种进行了抗枯萎病和黄萎病鉴定，苏棉29的棉花枯萎病病指18.0，黄萎病病指34.7，表现为耐枯萎病、耐黄萎病；同时对参试品种进行了抗棉铃虫生物学鉴定，苏棉29的抗级达3.50以上，综合抗级为高抗。

2009—2012年江苏省预备试验、区域试验及生产试验多年多点的结果表明，苏棉28适宜在江苏省枯、黄萎病轻病区种植，且能达到较高的产量水平。

7栽培技术

7.1适时播栽

该品种出苗快而整齐。育苗移栽宜在3月底4月初播种，1钵1～2粒。采用脱绒包衣棉种应干籽下种，保证棉种吸足水分，利于出苗。有条件的可采用双膜育苗，其间注意苗床温湿度调节，从而促进早出苗。一熟棉或麦套棉种植，于5月上中旬移栽。麥后移栽棉可适当推迟播种，但不应迟于4月10日；地膜直播棉以4月中下旬播种为宜。

7.2合理密植

宜采用等行种植，行距90～110 cm，保证植株的通风透光；如用宽窄行种植，小行距保持在60 cm为宜。一熟棉、油菜茬、上等肥力田及肥水平较高的田块，移栽密度为 24 000株/hm2；麦后棉、麦套棉及中等肥力田，营养钵育苗移栽密度3 0000～37 500株/hm2；地膜直播棉密度为30 000～45 000株/hm2。

7.3科学施肥

施肥时注意氮、磷、钾肥的配合使用，适量补充多元微肥，保证植株营养均衡，促进棉花生长发育。育苗移栽棉全生育期内一般施肥4次：基肥采用N、P、K含量为15-15-15的复合肥300kg/hm2；棉苗活棵后，施1次提苗肥，用尿素

150 kg/hm2 左右，促进棉苗平衡生长；7月上旬和下旬分2次施花铃肥，用尿素225 kg/hm2和150 kg/hm2 。在施好基肥的基础上，花铃肥应采取早施、重施的原则，既保证结铃高峰期的养分供应，又防止后期脱力早衰。第1次花铃肥一般在单株成铃2个左右施用。对前茬为水稻或地力比较肥沃，棉花生长强劲有力的地块，可酌情少施或不施肥料；对于后劲不足的田块，可酌情补施盖顶肥，用尿素75～150 kg/hm2 。施肥方式以穴施或沟施为主，采用撒施的需适当增加用量。结合施肥及时中耕，做好培土壅根，防倒伏。花铃期是棉花需水敏感期，如干旱严重，可适当进行灌水保墒，以减少脱落，防止早衰，提高成铃强度和铃重。

7.4及时打顶

打顶时间根据棉花生长情况决定。气候正常年份，棉花生长良好的地块，打顶时间一般在8月上旬，对长势较好的田块，可适当推迟打顶，一方面增加果枝生长量，另一方面利用顶端优势抑制后期赘芽的生长。

7.5适度化控

全生育期化控3～4次，甲哌纯品用量：蕾期 15.0 g/hm2，初花期15.0～30.0 g/hm2，盛花结铃期 45.0 g/ hm2 左右，打顶后5～7 d 60.0 g/hm2左右。具体应根据棉花长势、天气状况酌情增减用量和次数，应掌握少、轻、勤的原则。对长势均衡的田块，可结合治虫等农艺措施采取少量多次的办法，中期每次用7.5～15.0 g/hm2，打顶后用60.0 g/hm2封顶，以改进通风透光条件，塑造理想株型。

7.6病虫草害防治

棉苗移栽时，可穴施或沟施呋喃丹颗粒剂来防治地下害虫，同时可兼治棉蚜、棉叶螨、蓟马等。注意防治盲椿象、蚜虫、红蜘蛛、烟粉虱和斜纹夜蛾等害虫。苏棉29高抗棉铃虫，一般2代不治，注意棉铃虫的后期防治工作。及时中耕除草，可以根据杂草种类使用合适的除草剂。

参考文献：

[1]施爱民，涂松林，胡国祥，等. 转基因抗虫棉GK19生产试种示范与研究[J]. 湖北农业科学，2000，39（1）：18-21.

[2]江苏省棉花新品种试验总结汇编：2006—2012[Z].

[3]金石桥，许乃银. GGE双标图在中国农作物品种试验中应用的必要性探讨[J]. 种子，2012，31（12）：89-92.

[4]许乃银，张国伟，李健，等. 基于HA-GGE双标图的长江流域棉花区域试验环境评价[J]. 作物学报，2012，38（12）：2229-2236.

[5]NY/T 1297—2007农作物品种审定规范：棉花[S].

芯片—基因组杂交技术 篇4

关键词：基因芯片技术,早期大肠癌,筛选

大肠癌是一种常见的恶性消化系统肿瘤, 其发病率、死亡率极高, 一般认为其发生与高脂肪低纤维素饮食、大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传因素和其他因素如:与血吸虫病、环境因素 (如土壤中缺钼) 等有关, 吸烟、长期处于辐射的环境也对其具有较大影响[1]。大肠腺瘤是公认的大肠癌癌前病变, 在其后的10~15年有极大可能演变为大肠癌[2]。本文通过基因芯片技术对早期肠癌及大肠腺瘤与正常肠黏膜组织基因差异性表达研究, 来探讨研究基因差异表达可能与大肠癌的发生及诱发有关, 来预测早期大肠癌的发生。基因芯片是目前最为先进的分子检测技术, 指对数以千计的DNA片段同时进行处理分析的技术, 诸如基因组的DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等。该技术系指将大量的探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交, 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而进行大量的基因表达及监测等方面的最新革命性技术。即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法, 在一块芯片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时, 通过确定荧光强度最强的探针位置, 获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。为了探讨并分析利用基因芯片技术筛选早期大肠癌的相关基因, 本文选取2015年7-12月我院肿瘤外科、胃肠外科、内镜室收治的大肠癌患者4例切除的肿瘤标本、大肠腺瘤患者4例以及正常人的大肠活检标本4例进行基因分析, 结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

资料来源于2015年7-12月我院肿瘤外科、胃肠外科、内镜室收治的大肠癌患者4例切除的肿瘤标本、大肠腺瘤患者4例以及正常人的大肠活检标本4例, 分别作为A、B、C组。所有患者均对本次试验知情同意, 并签署有关知情同意书。排除近期接受放疗、化疗等针对肿瘤的治疗措施的患者, 排除具有其他如糖尿病、高血压等疾病的患者, 排除合并其他严重大肠疾病的患者。所有患者的标本在从患者体内取出后, 立即于30min内将其低温保存在液态氮中。所有患者均经过病理学证实, A组4例为大肠癌组织, 避开肿瘤中心坏死组织及深部结缔组织和肌组织, B组为大肠腺瘤组织, C组为正常肠黏膜组织。

1.2 方法

(1) 首先, 采用Trizol试剂盒 (美国生产) , 提取三组组织的总RNA, 分离出其中的mRNA, 然后用分光光度计对其分别进行定量检测, 测定波长为260nm与280nm时的吸光度, 然后对两者比值进行计算。取三组等量的总RNA, 利用逆转录酶引物T7- (dT) Primer, 逆转录合成cD-NA一条链, 再以此为模版合成另一条链。将合成的cDNA进行纯化处理, 采用的是GeneChip Sample Cleanup Module试剂盒 (美国生产) 。之后利用合成的cDNA在RNA合成酶作用下, 体外转录生成cRNA片段, 并对其进行生物素标记。 (2) 将三组体外生成的RNA片段制成杂交液, 并将其加入到本次选用的HG-U133Plus2.0全基因组芯片 (上海生产, 包含47 000个转录本及其变异体基因, 其中已知38 500个) 中, 杂交过程为16h, 之后取出芯片放入工作站中进行洗脱与染色。 (3) 采用荧光扫描仪 (GeneChip Scanner) 对芯片进行扫描, 获取基因表达的相关荧光信号, 对其进行转换处理, 并进行分析。

1.3 观察项目和指标

首先对所提取的RNA进行完整性与纯度检测, 对所准备的全基因芯片进行质量判定, 然后观察杂交结果, 并进行PT-PCR检测。

1.4 统计学方法

采用LuxScan 3.0图像分析软件进行计算机自动分析与处理, 将利用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪扫描芯片获取的荧光信号强度转换为信号值, 并对各个基因探针检测出的辨别值与标准值进行比较, 得出上调或下调差异较大的基因组。

2 结果

2.1 芯片杂交的结果

经分光光度计检验及凝胶电泳鉴定, 样品RNA完整性良好, 纯度较高;从3组样品杂交后的扫描图可见, 杂交区域四周电线均匀, 边界清晰可见, 四角及中心标志物 (+字) 清晰, 芯片质量较好。图1显示芯片杂交的结果, 为正常组织基因 (横轴) 与腺瘤组织基因 (纵轴) 散点图, 图中斜线自上往下依次为上调30、10、4、2倍以及下调2、4、10、30的基准线, 2~4倍线之间较密集。

2.2 RT-PCR基因芯片检测结果

通过对400~500bp之间升高表达基因以及降低表达基因的RT-PCR检测发现其结果与基因芯片检测结果一致, 基因芯片检测结果可信度较高。图2显示癌组织与正常组织基因表达的RT-PCR检测结果, 选取的为升高表达基因479bp以及降低表达基因446bp。

注:1、2为正常组织mRNA表达, 3、4为癌组织mRNA表达

2.3 差异表达基因及其变异体数目

经过计算机筛选发现早期大肠癌相关基因A组及B组表达但C组不表达的有125个, 其中已知的有113个 (包括LOC401074、SOX4、BF等) ;A组及B组不表达而C组表达的有475个, 其中已知391个 (包括LOC284723、SSB1、C19orf21等) 。结果见表1。

3 讨论

大肠癌包括结肠癌和直肠癌, 最容易发生在直肠癌、乙状结肠癌, 是一种常见的恶性消化系统肿瘤, 是一种多基因、多步骤、多途径变化的疾病, 在我国的发病率非常高, 与饮食偏于油腻、食用蔬菜较少、肠道炎症、腺瘤及遗传因素有关, 吸烟、长期处于辐射的环境也对其具有较大影响[3]。肠癌在最初并没有明显的临床表现, 仅有比较轻微的不适感或大便潜血。后期逐渐表现出腹痛、大便习惯改变、便血、包块等, 还有可能伴有不同程度的全身症状, 最后可累及多个器官及组织。

大肠癌发病隐匿, 早期常无明显临床症状, 被确诊时20%~30%为较晚期, 即使进行手术、放化疗等综合治疗仍不能很好达到治愈的目的, 因此, 对于大肠癌的及早发现及早治疗对于患者来说具有非常重要的意义。可应用粪便OB检测、血CEA、肠镜等技术提高早期肠癌的检出率, 但是因粪便OB、CEA的特异性低, 且肠镜的有创性及费用高, 有些患者无法接受反复多次的肠镜检查等因素, 故在临床应用中有一定的局限性, 那么不久将来是否可以尝试推广利用基因芯片技术筛选早期肠癌, 积极处理大肠腺瘤, 成为一项值得关注的临床研究。大肠癌发生分为散发性、家族性、遗传性几种特征, 其中家族性遗传性基本遵循“腺瘤-腺癌”的演变过程, 故对此类疾病早期进行基因检测, 以此来预测肿瘤的发生至关重要, 目前针对大肠癌的基因学检测手段已经由早期的单基因检测发展到多基因联合检测[4]。肿瘤是局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控, 导致细胞的增殖失控和分化异常, 从分子水平探索癌变相关基因, 可望早期发现肿瘤。

本文通过基因芯片技术对早期肠癌及大肠腺瘤与正常肠黏膜组织基因差异性表达进行分析, 来探讨基因差异表达可能与大肠癌的发生及诱发有关, 预测早期大肠癌的发生。结果显示, 早期大肠癌相关基因A组及B组表达但C组不表达的有125个, A组及B组不表达而C组表达的有475个, 总共600个差异基因及变异基因。而在A组大肠癌与B组腺瘤共同特异性表达的125个基因及变异基因中, 有些已知的与癌症发生密切相关, 例如FABP6基因、LCN2、CHRM3[5~8]。大肠癌是一种消化科常见的恶性肿瘤, 而大肠腺瘤是一种公认的大肠癌癌前病变[9]。大肠癌与大肠腺瘤共同特异性表达的基因总数为125个, 而其中许多证明与大肠癌发生有较大关系, 大肠腺瘤经历10~15年时间变为大肠癌, 可能与这些基因的表达有着密切关系。而正常组织表达, 大肠癌与腺瘤不表达的有475个, 大肠癌的发生也或与这些基因的抑制有一定关系。因此在将来, 可以尝试推广利用基因芯片技术筛选早期肠癌, 积极治疗大肠腺瘤并提高早期肠癌的检出率, 提高肠癌治愈率, 减少患者痛苦及节省医疗资源, 当然还需要大样本继续探索和相关研究的完善, 并且更深入地研究大肠癌的发病机制, 从而更好地为肿瘤的基因治疗服务, 是后续研究目标。

参考文献

[1]刘峰, 郭久冰, 沈智勇, 等.基因芯片技术筛选结直肠癌腹膜转移相关基因〔J〕.南方医科大学学报, 2012, 32 (3) :400-403.

[2]程家乐, 姚敬, 彭佳远, 等.大肠癌肝转移相关的间质差异表达基因的筛选〔J〕.医学综述, 2014, 20 (5) :903-907, 封3.

[3]陈曦, 陈向征, 刘明, 等.基因芯片筛选结肠癌伊立替康耐药相关基因〔J〕.四川大学学报:医学版, 2011, 42 (1) :15-18, 36.

[4]Kim ER, Kim YH.Clinical application of genetics in management of colorectal cancer〔J〕.Intest Res, 2014, 12 (3) :184-193.

[5]Zhang H, Lee MY, Hogg MG, et al.High-throughput transfection of interfering RNA into a 3Dcell-culture chip〔J〕.Small, 2012, 8 (13) :2091-2098.

[6]Li M, Wang N, Zang W, et al.Sensitive SNP Detection of KIF6Gene by Quantum Dot-DNA Conjugate Probe-Based Assay〔J〕.Analytical Letters, 2013, 46 (1/3) :508-517.

[7]Quan J, Saaem I, Tang N, et al.Parallel on-chip gene synthesis and application to optimization of protein expression〔J〕.Nature Biotechnology, 2011, 29 (5) :449-452.

[8]Liu Y, Bowen NJ, Matyunina L, et al.Gene transfection enhanced by ultrasound exposure combined with drug treatment guided by gene chip analysis〔J〕.International journal of hyperthermia:The official journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group, 2012, 28 (4) :349-361.

芯片—基因组杂交技术 篇5

1.1 实验材料

健康成年雄性SPF级SD大鼠(体重150～200g)24只,购自南华大学实验动物中心。

1.2 动物分组及大鼠哮喘模型的建立

大鼠按随机表随机分为正常对照组与哮喘模型组。哮喘模型组(B组,分别为两周B1组、四周B2组、8周B3组,每组各6只)在第1天和第8天腹腔注射OVA(1 mg)+Al(OH)3(100 mg)生理盐水混合液1 m L致敏,第15 d开始以1%OVA雾化激发,每次30 min,隔天1次,以大鼠出现呼吸急促、腹肌抽搐、口唇紫绀代表哮喘模型复制成功。正常健康大鼠为正常对照组(A组6只)以生理盐水致敏,蒸馏水雾化吸入作为对照。分别在哮喘激发2周、4周和8周雾化吸入后的24 h后处死,收集肺泡灌洗液行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数、取肺组织行HE染色、病理图像分析、提取肺组织RNA行基因芯片筛选及实时定量PCR。

1.3 实验方法

1.3.1 肺泡灌洗液炎性细胞检测

肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数,分离气管,作“V”形切口,行气管插管,每次注入Hankp s液2 m L作肺泡灌洗,重复3次,要求回收率大于75%且无血液混入。将所收集的BALF离心(2 000r/min离心20 min),取细胞沉淀,用1 m L Hankps液重新混悬,并涂片行瑞氏染色,油镜下记数500个细胞,进行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数。

1.3.2 气道形态学参数测量

肺组织HE染色后,以图像分析软件测定支气管基底周径(Pbm)、总管壁面积(WAt)、内壁面积(WAi)、平滑肌面积(WAm),并用Pbm将测量值标准化,分别以WAt/Pbm,WAi/Pbm,WAm/Pbm表示,代表相应管壁各层厚度。

1.3.3 肺组织总RNA的提取

用Trizol按一步法分别提取总RNA,每50～100 mg组织加Trizol 1m L,匀浆,室温下5 min;加0.12 m L氯仿摇匀,4℃离心15 min(12 000 g);取上清液移至新EP管,加0.15 m L异丙醇,4℃冰箱保存30 min;4℃离心15min(12 000 g);弃上清,加75%乙醇1 m L清洗,再4℃离心5 min(10 000 g)。无RNase水溶解RNA,测得所提的总RNA A260/A280的比值在1.18～2.10之间,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察18 s与28 s条带清晰且密度比值约等于2,无基因组污染时可用。

1.3.4 基因芯片实验

由杭州联川生物信息技术有限公司采用Phalanx Rat OneArray基因芯片进行基因表达谱实验,每样品进行二次技术重复实验,用激光共聚焦扫描仪对杂交后的芯片进行扫描,并对杂交信号值进行背景扣除,归一化。筛选差异表达基因的标准为:以基因表达倍数值≥2.0和基因表达倍数值≤-2.0为阈值来确定差异表达基因。

1.3.5 生物信息学分析

用GO及Pathway功能分类标准对差异基因进行功能分类分析。

1.3.6 荧光定量RT-PCR验证

选取2个在2种组织中差异表达的基因,根据GenBank序列号获取全长c DNA序列,由杭州联川生物技术有限公司设计并合成上下游引物基因名称和上下游引物序列以及退火温度和产物长度见表1。SYBRGreen荧光实时定量RT-PCR反应在ABI PRISMR 7900HT型荧光定量PCR仪上进行各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成,每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品受检基因校正后的相对含量。

1.4 统计学分析

所有实验数据用(x±s)表示,使用SPSS 13.0软件进行统计学分析,组间比较应用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,采用Pearson直线相关性分析进行相关性分析,P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 白细胞(WBC)及嗜酸性粒细胞(EOS)计数

正常对照组及哮喘模型各组大鼠肺泡灌洗液中白细胞(WBC)及嗜酸性粒细胞(EOS)计数见表2。

2.2 病理组织学改变

正常对照组气道周围无炎性细胞浸润,平滑肌层均匀,无杯状细胞增生及黏液分泌,周围散在少许胶原。见图1。哮喘二周组支气管黏膜下及管壁周围嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润,黏液腺增生,部分气道上皮脱落,黏膜下细胞外基质沉积,新生血管形成,气道平滑肌增厚,杯状细胞增生,伴黏液高分泌,胶原过度沉积,基底膜增厚。见图2。随着哮喘病程的进展,气道平滑肌增厚逐渐增加,气道壁进一步增厚,气道管腔狭窄程度更加明显明显。见图3、4。

注:1)示哮喘二周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);2)表示哮喘四周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);3)表示哮喘八周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);4)哮喘四周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);5)表示哮喘八周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);6)表示哮喘八周组与哮喘四周组比较,差异有显著性(P<0.05)

2.3 图像分析

哮喘大鼠模型在激发两周出现支气管管壁及平滑肌增厚,大鼠激发八周WAt/Pbm、WAi/Pbm及WAm/Pbm均较对照组、激发两周及四周显著增加,表现出气道平滑肌随着激发时间的延长而逐渐增厚。见表3。

注:1)表示哮喘二周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);2)表示哮喘四周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);3)表示哮喘八周组与正常对照组比较,差异有显著性(P<0.05);4)哮喘四周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);5)表示哮喘八周组与哮喘二周组比较,差异有显著性(P<0.05);6)表示哮喘八周组与哮喘四周组比较,差异有显著性(P<0.05)

2.4 总RNA定性分析

哮喘组和对照组提取总RNA的A260/A280比值分别在1.81～2.10之间,说明没有蛋白质和DNA残留,纯度较高。经1%甲醛变性、琼脂糖凝胶电泳后,可以清晰地看到18S和28S两条条带,说明RNA完整性好,没有降解。见图5。

1:对照组;2:正常对照组;3:哮喘模型二周组;4:哮喘模型四周组;5:哮喘模型八周组

2.5 芯片杂交结果

扫描结果显示芯片信号强度均一,基因点清晰,背景值均匀,符合要求,且每个标本进行一次技术重复,所有检出信号点的强度经归一化以后的相关性大于95%,说明实验数据可靠;小图为每个基因扫描图右下角放大图。每一个点代表一个基因的表达,亮度越高就代表表达量越高。见图6。

A:正常对照组;B:哮喘模型二周组;C:哮喘模型四周组;D:哮喘模型八周组

2.6 基因表达谱芯片筛选结果分析

按P<0.05差异显著性标准,从24 358条基因中,筛选出哮喘患者与正常对照差异表达2倍以上的基因,其中与哮喘疾病过程中持续表达相关的基因有13条,其中上调基因9条,下调基因4条见表4。用GO及Pathway功能分类分析发现上述差异表达基因主要涉及到炎症反应、免疫反应、防御反应、免疫过程、创伤反应、外部刺激反应固有免疫反应等功能。

2.7 荧光定量RT-PCR结果

在哮喘大鼠肺组织差异表达的基因中选取2个基因Mal、TPD52L1做荧光定量RT-PCR检测,发现在哮喘大鼠肺组织中,上述2个基因在两种组织中变化倍数的变化方向与基因芯片检测结果一致,证明基因芯片结果准确可靠。见表5。

3 讨论

哮喘作为一种多基因遗传疾病,它受到环境因素和遗传因素的双重影响,其发病的复杂分子生物学机制及调控机制目前仍未明朗。以往对于哮喘的研究多局限于气道炎症或气道重塑的某一阶段,而哮喘的发病是一个动态过程,其早期以气道炎症为主,而后期以气道重塑为主。基因芯片技术克服了以往在哮喘研究中的缺陷,能够更全面地从整体分子学水平研究哮喘发病的病因及病理生理机制。本研究以差异基因表达倍数值2.0和基因表达倍数值-2.0为阈值来筛选差异表达的基因,笔者观察到哮喘两周组VS正常对照组中有472条基因表达上调,187条基因表达下调,哮喘四周组VS正常对照组中有447条基因表达上调,365条基因表达下调,哮喘八周组VS正常对照组中有642条基因表达上调,392条基因表达下调,从中可以看出随着哮喘病程的进展参与差异表达的基因越多,通过GO及Pathway对差异基因进行功能分类分析,发现有13条基因在哮喘病程中持续表达,这13条基因涉及到哮喘的防御反应、免疫反应、细胞凋亡等功能有关。

本研究中基因芯片筛选出的基因NOX1、C5、XCL1等目前已经在许多实验中证实参与哮喘的疾病进程,影响哮喘气道炎症及重塑[3,4,5],由此也说明,本组哮喘大鼠模型建立是成功的,但还有许多哮喘发病中的典型基因在本实验中未出现,可能与实验样本容量等有关。此外,本实验中笔者还发现许多新基因在哮喘发病过程中表达,其中Ma L(T细胞成熟相关蛋白)、TPD52L1是其中表达较典型基因,而本组的实时定量PCR结果也显示这两个基因参与哮喘疾病的发展。

Ma L基因于1987年分离得到,定位于2q13,含4个外显子,其c DNA全长为1 051 bp。Ma L基因家族成员在肺、肾等多种组织中广泛表达,而且不同种属之间有同源蛋白质,提示它们在细胞中具有重要的功能。Ma L作为顶端膜蛋白在细胞表面的存在,具有调节上皮细胞吸收和分泌的重要作用[6],并且Ma L基因在顶端膜蛋白转运和蛋白分泌机制中也起作用[7]。近年研究发现Ma L与肿瘤的发生发展有密切的关系。文献报道,在口腔鳞状细胞癌细胞与正常口腔上皮细胞相比,Mal基因的表达显著减少[8]。另外,研究发现Ma L基因在乳腺癌、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、胃癌细胞中均表达下调,认为Ma L下调的机制与启动子的甲基化有关[9,10]。Ma L可通过Fas途径抑制肿瘤细胞的运动浸润和肿瘤的发生,促进细胞凋亡[11]。FERNANDO等[12]发现Ma L除了具有基底-顶端转运的基本功能外,还具有维护上皮样组织细胞的正常极性,其表达下降和分布状态改变,能破坏正常细胞极性,导致肿瘤发生。

气道上皮在哮喘发病中发挥着重要的作用,气道上皮结构完整性的缺陷或功能紊乱是哮喘等疾病的启动环节[13],但其相关机制尚不明确。本实验通过利用全基因表达谱芯片技术,对哮喘大鼠模型的不同阶段进行基因表达差异谱分析,发现Ma L随着大鼠哮喘病程的进展其表达逐渐出现下调。以往文献表明,MaL主要在上皮细胞中表达,与维持上皮细胞形态和功能密切相关,笔者推测Ma L在肺组织中下调,主要是在气道上皮细胞中表达减弱,可能与哮喘发病有关。且本实验研究发现在哮喘疾病中气道内炎性细胞的浸润以嗜酸性粒细胞为主,并在早期即有气道上皮的破坏,且随着疾病的进展气道内炎症的浸润及上皮的破坏和气道重塑情况越严重(见表2、3,图1～4)。为此,笔者推测Ma L在哮喘疾病中的作用机制可能是内外界因素不断刺激气道上皮细胞,引起Ma L表达下降。使气道上皮细胞正常形态和功能发生改变,促使气道上皮细胞分泌促炎性因子或致纤维化因子,从而启动气道炎症,维持其慢性发展,进而促使气道重塑的形成,导致哮喘病理、病程的进展。如果能提高Ma L表达,能否延缓或抑制哮喘的炎症启动、持续和气道高反应性及气道重塑,是一个新的治疗途径。

TPD52L1是癌蛋白52(D52)家族成员之一。D52家族基因扩增与肿瘤增生和病毒转导细胞增生相关[14]。逆转录病毒转导的D52能够促使鸡的神经胶质上皮细胞增生[15],又证实了D52家族基因表达与细胞增生相关。通过本实验发现,TPD52L1随着哮喘病程的进展其表达逐渐上调。结合本实验结果及相关文献,笔者推测TPD52L1参与哮喘疾病的进展,可能与气道上皮细胞的增殖等有关,从而促进哮喘气道重塑的形成。

结合本实验结果及相关文献报道,笔者将在今后的实验中,通过对气道上皮细胞的研究,检测Mal、TPD52L1基因在气道上皮细胞中的具体作用,从而为哮喘的发病机制提供新的实验依据。

另外,从结果中发现有许多基因参与哮喘的疾病进程,但在哮喘整个疾病过程中只有13个基因持续表达,这一现象是否因本实验样本量有关,此外某些基因在大鼠哮喘早期表达上调或下调,而在晚期表达下调或上调,这在以往的文献中未见报道,笔者也将在后续试验中对此进行研究及分析。

支气管哮喘的发病是多因素、多基因共同影响的结果。现已发现了许多与哮喘发病相关的基因,但我们还需要在全基因组的水平上进行检测,以全面研究哮喘相关基因的表达。基因芯片(gene chip或DNA microarray)作为一种高通量高效能的筛选工具是研究基因表达的有效方法[1,2],它在疾病研究中以一种系统、整体的方法进行研究,打破了一种疾病,一种基因的陈旧模式,整体宏观地研究生物体基因的表达及功能。为此,我们采用全基因表达谱芯片技术,筛选哮喘大鼠差异基因表达的动态变化,并分析这些基因的功能,以进一步探讨哮喘发病的分子机制。

摘要：目的 利用基因芯片技术寻找哮喘大鼠与正常大鼠之间差异基因的动态变化,寻找参与哮喘发病的新基因。方法 分别于激发哮喘2、4、8周处死大鼠收集肺泡灌洗液行炎性细胞及嗜酸性粒细胞计数,取肺组织行HE染色、病理图像分析,提取肺组织RNA行基因芯片筛选及实时定量PCR验证。以基因表达倍数值2.0和基因表达倍数值-2.0为阈值来确定差异表达基因,然后用GO及Pathway分析对差异表达基因进行功能分类分析,结果以P<0.05为差异显著性标准。结果 从24 358条表达基因谱中,筛选出哮喘大鼠与正常大鼠持续性差异表达2倍以上的基因有13条,其中发现Mal和TPD52L1等新基因参与哮喘疾病过程。结论 Mal、TPD52L1基因在肺组织中异常表达,影响哮喘的病程进展。

芯片—基因组杂交技术 篇6

基因芯片技术主要包括4个步骤:芯片制备、样本制备、杂交反应及信号检测和结果分析。即将大量特定纯化的寡核苷酸片段或基因片段作为探针, 将它们高密度、有规律地点样排列固定于支持物上, 借助核酸分子杂交配对的特性, 与萤光标记样品分子进行杂交, 将未互补结合的片段洗去, 经激光光束激发杂交分子发出与探针杂交程度有关的萤光, 通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描, 收集每个探针分子的杂交萤光信号强度, 并通过专门的计算机软件对荧光信号进行综合分析, 即可获得样品中大量基因序列及表达的信息[1]。不同类型的肿瘤中, 每一种类型的肿瘤均有其独特的表达方式, 因此这些基因的表达数据, 通常作为一种标签, 用于将组织学分类相似的肿瘤分为不同亚型, 进而为临床提供新的相关信息[2]。

子宫内膜癌为一类分子异质性疾病, 由复杂的基因调控网络调节其发生发展。通过基因芯片技术分析其基因表达谱的变化, 找出与子宫内膜癌发生、发展相关的候选基因或调节通路, 有助于从分子水平全面整体的了解子宫内膜癌的生物学机制。

1 子宫内膜癌相关基因的筛选及基因芯片制备

2000年, Smid-Koopman等[3]首次用Atlas癌症c DNA表达微阵列检测了2个子宫内膜癌细胞系、2例子宫内膜癌组织标本、1例良性子宫内膜组织样本和1个乳腺癌细胞系的基因表达谱。结果显示, 在良性子宫内膜组织和内膜癌样品中有3个差异性表达基因, 它们分别是小亮氨酸原糖 (Decorin) 、组织抑制金属蛋白酶3 (TIMP3) 和Cyclin D1。Decorin可以通过抑制TGF-β, 引起p21的产生, 进而抑制肿瘤细胞的增生。TIMP3抑制基质金属蛋白酶 (MMPs) 的产生, 避免过量的MMPs刺激肿瘤细胞扩散转移。Cyclin D1促使细胞由G1期向S期转化。这3种基因在子宫内膜癌的浸润生长过程中发挥着重要作用。同时研究还发现, 某些看家基因在子宫内膜的样本中具有相似的表达水平, 而在乳腺癌中则无表达, 说明这些看家基因与子宫内膜特异性相关。

子宫内膜癌中子宫内膜样腺癌约占3/4左右, 是最常见的一种病理类型。Planaguma等[4]利用含8345个基因的c DNA芯片分析筛选了与子宫内膜样腺癌发生、发展相关的差异表达基因。其中, RUNX1/AML1基因在子宫内膜样腺癌组织中的表达显著上调, 通过Real-time PCR验证发现其结果与芯片结果相一致, 并且RUNX1在发生肌层浸润的组织中表达升高。免疫组化结果也证实, 从正常内膜组织到子宫内膜单纯性增生、复杂性增生, 再到内膜癌, RUNX1蛋白的表达逐渐增强, 提示其与子宫内膜样腺癌的发展紧密相关。同样, Saghir等[5]利用含28869个基因的c DNA芯片分析筛选了正常子宫内膜组织与子宫内膜样腺癌间的差异基因共622个, 其中146个差异基因, 包括Erb B3、Erb B4、ELF3及CXCL17等在子宫内膜样腺癌中表达上调, 另476个基因, 包括STAT5b、TGFβ3、CAV1及PKCA等表达下调。通过基因富集分析, 发现这些基因分别参与了子宫内膜癌发生、发展中的ALK通路及整联蛋白通路等。

子宫内膜浆液性腺癌较子宫内膜样腺癌少见, 其侵袭性较强, 患者预后较差。Santin等[6]利用基因芯片的技术, 分析发现了与其相关的分子标记物。其中5倍以上差异的基因共529个, 在子宫内膜浆液性腺癌中表达上调的139个基因中多为细胞黏附因子和癌基因等。其中, Claudin-4特异性的表达在子宫内膜浆液性腺癌中, 或许可作为进一步研究的靶点。

随着基因芯片技术研究的不断进展, 研究者们目前逐渐倾向于研发一种小型专业化的芯片。Yao等[7]在既往子宫内膜癌基因相关研究的基础上, 结合人类肿瘤相关基因芯片 (H.sapiens Cancer Subset V3.0) 首次构建了一个含有492个基因的特异性子宫内膜癌c DNA芯片。这种特异性的低密度芯片与当前广泛使用的全基因组基因芯片相比, 有其自身特点。首先, 小的专业化芯片只含有与所研究的生物学过程有关的基因, 消除了“噪声”的干扰, 并能发现一些在普通基因芯片中易丢失的关系。其次, 小的芯片简化了数据分析, 并降低了对计算机配置的要求。

2 子宫内膜癌基因分型

根据组织形态学标准, 子宫内膜癌可分为子宫内膜样腺癌、浆液性腺癌和透明细胞癌等。利用基因芯片进行肿瘤的分型已经在淋巴瘤、黑色素瘤及乳腺癌等中取得了很大的进展。其中研究最为成熟的即为乳腺癌, 通过基因表达谱的研究, 乳腺癌目前大致分为Luminal A、Luminal B、基底样、正常乳腺细胞及HER2阳性5种类型, 并得到了后期临床试验的反复印证。

Smid-Koopman等[8]对12例子宫内膜癌, 3例良性内膜组织及3例肌层组织的基因表达谱进行聚类后发现, 子宫内膜癌与其他组织的基因表达谱明显不同, 分别聚为不同组。而子宫内膜癌又进一步聚为两组, 且与肿瘤的FIGO病理分期高度类似, 经随访两组间的预后明显不同。Risinger等[9]利用含9431个基因的c DNA芯片检测了19例子宫内膜样腺癌、16例非子宫内膜样腺癌 (13例浆液性腺癌和3例透明细胞癌) 及7例正常内膜。通过非监督多维量表法, 样本聚为四类, 且聚类结果与样本的组织学特点一致。此外, 聚类分析显示, 透明细胞癌与大多数浆液性癌及内膜样腺癌为不同类别。通过进一步分析各组间的基因表达谱, 发现浆液性癌与透明细胞癌间的差异最小, 而浆液性癌与正常内膜间的差异最大。这说明利用基因表达谱分型至少具有与组织学分型相类似的效力, 同时, 又能在此基础上反映出各类别间潜在的生物学异质性。Chen等[10]对32例子宫内膜样腺癌及5例浆液性腺癌的基因表达谱进行无监督聚类后发现, 5例浆液性腺癌独立于子宫内膜样腺癌单独聚为一类, 而32例内膜样腺癌则进一步细分为3类, 且各组类别间的临床病理特点显著不同。这提示子宫内膜样腺癌中存在着生物学特征显著不同的亚类, 而这种亚类的区分需要借助于基因芯片技术来实现。

除上述分类外, 还存在其他类型的分型研究。如Catasus等[11]则利用PI3K-AKT通路22基因芯片将38例子宫内膜癌分为3类:高分化子宫内膜癌聚为一组, 以高频PTEN突变 (10/17, 59%) 及微卫星不稳定性 (6/17, 35%) 为特征;低分化子宫内膜癌分为两组, 一组以PIK3CA外显子20突变 (9/15, 60%) 及p16过表达 (8/13, 62%) 为特征, 几乎所有的非内膜样腺癌 (浆液性癌和透明细胞癌) 均聚集于该类中;另一组以p53突变 (6/6, 100%) 及p16过表达 (5/5, 100%) 为特征, 且该组样本中无PIK3CA外显子20突变及PTEN突变的出现。由此可见, 对于那些镜下及组织化学辨别不清楚的不同水平上的异质性均可通过基因芯片技术得以解决。

3 子宫内膜癌基因表达谱的研究

3.1 子宫内膜癌不同病理类型间基因表达谱研究

子宫内膜癌包括多种具有显著不同生物学特点及临床表现的组织类型, 此外, 即使具有相同组织学特点的肿瘤也可能会呈现出显著不同的生物学行为。而这种生物学上的差异多源自于细胞内基因表达谱上的异质性。例如Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌预后的5年生存率分别为80%和30%~40%, 两者间具有显著不同的生物学特点。Moreno-Bueno等[12]利用含6386基因的c DNA芯片分析了24例Ⅰ型子宫内膜癌与11例Ⅱ型子宫内膜癌 (7例浆液性癌和4例透明细胞癌) 之间基因表达谱的差异, 筛选出2倍以上的差异基因66个:在Ⅰ型内膜癌中表达上调的31个基因中包括了一些常见的激素调节基因, 如MGB2、LTF、END1等, 证实Ⅰ型肿瘤的激素依赖型特征;反之, 在Ⅱ型子宫内膜癌中表达上调的35个基因中, STK15、BUB1、CC-NB2这3个基因分别参与了有丝分裂纺锤体校验点的调节, 与Ⅱ型子宫内膜癌细胞染色体非整倍体的形成及侵袭性表型密切相关。随后, 部分研究对子宫内膜癌中两种常见的病理类型, 即子宫内膜样癌与子宫浆液性腺癌进行了基因表达谱差异的分析, 进一步证实了各类型的肿瘤中分别存在着不同的基因调控通路。

此外, 临床研究中发现, 早期低分化 (G3) 子宫内膜样腺癌与早期浆液性癌的预后相似, 其5年生存率分别为72%左右, 并且镜下形态学检测有时也很难将两者区分开, 在这种情况下临床往往需要借助于一些特异性的分子标记物的检测来加以区分。但究竟是何种机制导致了两者最终形态学上的差异呢?Mhawech-Fauceglia等[13]利用寡核苷酸芯片分析发现, 两者在信号转导等调控通路上存在着显著的不同, 如与浆液性癌相比, P53信号通路在低分化子宫内膜样腺癌中显著上调。这表明潜在的基因调控机制不仅决定了预后的差异性, 也决定了细胞病理类型转化的不同。

3.2 子宫内膜癌预后相关基因表达谱的研究

无论从何种角度出发, 预后始终是子宫内膜癌研究所关注的焦点。Muinelo-Romay等[14]利用微阵列分析了51例子宫内膜癌的基因表达谱, 筛选出77个在高危复发子宫内膜癌样本中发生特异性改变的基因, 经过基因间的相互作用与功能分析, 发现TGF-β1信号通路在该基因调控网络中发挥了重要的作用。并且进一步体外研究显示, TGF-β1信号通路可以通过诱发子宫内膜癌细胞上皮间质转化, 导致细胞的侵袭性增强。

Levan等[15]利用含13526个基因的芯片分析了45例子宫内膜癌 (21例幸存者, 24例死亡) 的基因表达谱, 经t检验分析筛选出与预后显著相关的基因218个, 经交叉验证该218个基因的预后分类准确率为89% (40/45) ;随后利用这218个差异基因的表达谱对45例样本进行无监督聚类, 发现各聚类分组内样本预后的相符率均为80%以上。为进一步验证该基因分类的准确性, 研究者在另外一组26例 (9例幸存者, 17例死亡) 新病例中重新筛选了预后相关基因, 共92个, 这92个差异基因中与前面筛选的218个差异基因间共有64个重叠基因。利用该64个基因的表达谱在19例验证标本中进行无监督聚类, 发现分类的准确率为74% (14/19) , 并且采用不同的运算方法其准确性的差异并不大 (68%~79%) 。此外, Salvesen等[16]利用无监督聚类的方法将57例子宫内膜癌标本分为两类, 并经生存分析发现两组间的无瘤生存率存在着显著性差异。对各组样本进行基因组测序后发现, 预后较差组中存在着较高频率的PIK3CA突变及PI3K通路的激活;代表PI3K通路激活状态的STMN1蛋白在预后较差组中表达增强, 且可作为一种独立于其他临床病理因素的预后标记物。

由此可见, 利用基因芯片构建子宫内膜癌预测模型, 能够提前对患者的预后进行判断, 并通过相关基因及通路的筛选, 为靶向治疗提供依据。

4 基因芯片技术在子宫内膜癌早期诊断和治疗效果中的应用

在肿瘤发生、发展的过程中, 基因的改变往往先于细胞学及组织学形态的变化, 因此, 对于小肿瘤或癌前病变来说, 基因表达谱对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。Kabbarah等[17]利用显微切割技术从石蜡包埋子宫内膜癌标本中获取了少量癌细胞, 通过提取细胞RNA进行基因芯片分析后发现, 在子宫内膜癌中存在着一些已知在其他肿瘤中异常表达的基因, 其中, 在其他肿瘤组织中表达增加的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (Amd1) 在小鼠子宫内膜癌中也呈过表达状态。由此可见, 基因芯片检测有助于临床上微小病变肿瘤或癌前病变的早期诊断。

子宫内膜癌辅助系统性治疗, 包括放化疗、内分泌治疗等, 用于消除术后的残余病灶。Du等[18]分别对放疗敏感的细胞株KLE及放疗不敏感的细胞株Ishikawa给予同等剂量放疗照射后, 利用寡核苷酸微阵列技术分析比较了两种细胞株照射治疗前后基因表达谱的变化。其中, Ishikawa与KLE细胞中发生2倍以上表达差异的基因分别为227个和354个, 而这两组差异基因之间不同的基因仅有53个, 这些基因即为与放疗敏感或放疗抵抗相关的基因, 经功能注释后发现, 这53个基因多与DNA修复、凋亡、生长因子、信号转导、细胞周期及细胞黏附等生物学过程相关。Paulssen等[19]通过基因表达谱分析发现, 经30μg/ml高剂量孕激素短期作用4小时后, 121个基因出现表达上调, 135个基因出现表达下调。在这247个差异基因中135个基因分别涉及到细胞周期、细胞增殖和分化、免疫反应及胞内蛋白转运等生物学过程。利用基因表达谱可以提前辨别出对辅助性治疗敏感及耐药的患者, 避免对患者造成不必要的痛苦及医疗资源的浪费。

5 结论

基因芯片作为一项新兴的信息分析研究的技术平台, 为研究肿瘤发生、发展的分子机制提供了强有力的手段。但在基因芯片的研究中, 有几点问题是需要注意的: (1) 研究中所涉及到的临床参数设定必须要有具体的参考标准, 以避免分类错误的产生; (2) 同样的DNA微阵列, 不同的研究组, 不同的研究人群, 最终获得的基因标签可能会不同, 预测预后的准确程度也会不同[20]; (3) 同样的微阵列数据, 采用的生物信息学分析方法不同, 最后获得的基因数据集也会有所不同[21]。

但是随着相关临床研究的不断深入, 基因芯片技术的不断发展, 这些获得的数据将会被新的研究加以证实或重复利用, 最终会获得相对可靠的基因数据集。目前, 美国国家癌症研究所生物信息学中心协同联合国癌症研究中心、国家转化癌症研究网络, 提供了必要的生物信息基础[22]、肿瘤微阵列数据库ON-COMINE以及网络为基础的数据库平台[23], 大大促进了这一目标的实现。

摘要：基因芯片技术发展至今十余年来在科学界产生了巨大的影响, 这种一次性分析成百上千个基因的方法为肿瘤的基础研究及转化研究提供了新的途径。本文分别从特征基因的筛选、基因表达谱分析、基因分型及早期诊断和疗效预测等方面就目前基因芯片技术在子宫内膜癌中的应用进展作一简要综述。

芯片—基因组杂交技术 篇7

1 基因芯片技术概述

基因芯片主要应用于基因诊断, 还用于基因表达的研究, 多态性分析、核酸测序后基因组研究等。目前, 包括细菌、酵母菌等许多微生物的基因组序列已基本完成, 为基因组功能分析提供了一个切入点, 核苷酸芯片为平行研究大量基因组信息与功能提供了有利的工具。高密度寡核苷酸芯片与DNA杂交只用单一杂交步骤实现了大量序列的鉴定, 迅速敏感地监测基因表达, 完成染色体DNA序列的多态性与单核苷酸多态性定位检测, 并对小片段缺失和插入进行分析。该技术的出现使得同时分析数以千计的DNA序列成为可能, 对于基因与基因组研究和诊断而言, 具有重要的划时代意义[2]。

2 基因芯片的基本原理

基因芯片的制作技术主要包括四个步骤, 即芯片制备, 样品制备, 杂交反应, 信号检测和结果分析。是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面, 微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针, 然后再与芯片上寡核苷酸点杂交, 最后通过扫描仪定量好分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物[3]。该技术可检测各种介质中的微生物, 研究复杂微生物群体的基因表达。与传统的细菌培养、生化鉴定、血清分型等检测方法相比, 基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测;一次实验即可得出全部结果;操作简便快速, 整个检测只需9h基本可以出结果;特异性强, 敏感性高。

3 基因芯片技术在微生物检测中的应用

3.1 在食源性致病微生物检测中的应用

细菌、病毒和真菌等微生物是引起食品安全问题的重要危害因素, 严重威胁人类的健康。目前传统食源性微生物的检测方法主要包括前增菌培养、分离、生化鉴定和血清型鉴定等程序, 但过程繁琐, 而且操作相对独立, 很难及时、高通量的对食品进行检测。基因芯片技术可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测, 一次实验即可得出全部的检测结果, 且操作简单快捷、特异性强并且敏感性高, 整个检测在几个小时内即可得到检测结果。预计基因芯片检测食源性致病微生物技术将广泛应用于出人境检验检疫、食品质量控制、突发食品安全事件检测, 将为食品安全提供更有力的技术保障。

3.2 在传染性致病微生物检测中的应用

SARS冠状病毒在2003年曾在世界范围内流行, 当时由其引起的严重急性呼吸综合征病死率高, 虽然现在具有多种血清学和分子生物学技术用于病原体检测, 如:ELISA、IFA等, 但是没有任何方法能够在感染早期确认好排除SARS—Co V的感染。清华大学联合中国军事医学科学研究所研制的70—mer基因芯片对SARS—Co V进行早期检测, 他们试验证实了基于基因芯片的分子生物学检测方法对于SARS—Co V的检测是具有高度特异性而且可用于早期的检测。他们的结果证实基于基因芯片的分子检测技术对SARS—Co V的检测是具有特异性的, 而且对SARS病人的血清的检测率比单独PCR检测高8%。

3.3 在环境微生物群落分析中的应用

微生物的生态多样性在各种生态系统的功能和持续都起着综合的、独特的作用, 因而关系到地球在物质平衡、大气构成、地质形成等方面的变化, 如微生物所进行的反硝化作用使土壤、海洋的氮预算失去平衡, 所形成的中间产物NO和N:O的积累则是全球气候变暖和臭氧层的破坏的主要原因之一。另外, 微生物在环境的生物治理中有着极为重要的作用。所以弄清楚微生物群落的组成、结构和功能, 它们对毒素污染、气候变化、农业和工业活动等环境变化的反应和适应, 对于持续和恢复理想的尘态功能是非常必要的。然而, 仅有小于1%的微生物能人为培养, 微生物群落的定性和对其在自然环境中的种群的检测是长期困扰着微生物学家和生态学家的一大难题。现已表明基因芯片技术是研究环境微生物群落的一种强有力的研究工具, 同时也是研究原核和真核生物基因多态性的极好方法。与传统的以膜为基础的杂交方法比较, 以载玻片为支撑物的基因芯片技术具有高密度、快速检测、基于多荧光素标记的平行检测等多种优势, 并且还有相对成本低、自动化、低背景噪音等特点。可以预计, 基因芯片将是研究微生物群落的一种潜在有力的方法。

3.4 在微生物菌种鉴定中的应用

利用基因芯片杂交图像进行细菌基因分型与菌种鉴定, 筛选监测细菌抗药性基因。应用分枝杆菌基因芯片进行基因分型与菌种鉴定, 筛选监测结核分枝杆菌利福平抗药性基因突变。Gingeras等利用rpob寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法分析了10种分枝杆菌种间与种内的序列多样性, 并确证了几种特异性单碱基多态性。利用基因芯片技术可以对细菌基因组多个基因表达同时进行定量分析, 为了解细菌调节网络, 研究细菌对环境信号或药物的反应, 研究细菌侵袭力的发生提供了一种直接、高效的检测方法。

基因芯片技术作为一种新技术, 具有高通量、快速、灵敏的优点, 可以同时平行检测大量样本。人类基因计划的完成和各种病原微生物基因组测序分析使得在分子水平对病原体进行检测和致病机理的研究成为可能, 因此基因芯片的研发会更加实用广泛, 将为为本世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命。

参考文献

[1]徐炳森, 邵建忠.几种新型生物芯片的研究进展[J].生物化学与生物物理进展, 2000, 27 (3) :251-254.

[2]王志存, 葛长荣.基因芯片技术在病原性食品微生物检测中的应用[J].肉类工业, 2006 (12) :56.

芯片—基因组杂交技术 篇8

1 应用基因芯片技术探讨中医证候的本质

中医证候是中医药研究的核心, 证候本质的研究是中医现代化研究的热点和难点, 如能获得突破性进展, 必将使中医理论研究取得质的飞跃。应用现代医学理论和分子生物学技术阐明中医证候本质是实现中医药现代化的基础和关键, 具有重大科学意义。中医药在功能基因调控方面具有潜在的优势[1], 通过对足够数量的同一病位或病性患者的基因表达进行分析, 建立辨证要素的基因表达谱数据库, 再相互组合便可建立证型基因表达谱数据库, 以此可作为辨证的客观规范化标准。

杨裕华等[2]应用基因芯片检测了“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型脑基因的改变情况, 研究结果提示, 肾阳虚模型小鼠基因表达改变涉及生长激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和脑脂肪酸结合蛋白 (B-FABP) 相关基因;炎症/免疫、促细胞凋亡相关基因以及影响多巴胺生成的限速酶、影响凝血纤溶机制和精子发育代谢的相关基因。宋洁等[3]观察了“劳倦过度、房室不节”肾阳虚小鼠模型睾丸基因的改变, 共筛选出差异表达基因5 505个, 其中上调2 425个, 下调3 080个。上调基因前百位中已知基因41个, 下调基因前百位中已知基因62个, 主要涉及细胞结构/功能、物质/能量代谢、信号转导/传递、炎症/免疫、细胞凋亡、转录/翻译、增殖/分化及细胞周期等。潘志强等[4]探索丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 信号通路基因在不同证候H22肝癌荷瘤小鼠肾上腺中的表达特征, 结果提示, 不同证候肝癌小鼠的肾上腺组织主动参与了MAPK信号转导过程。杨丽萍等[5]则利用基因芯片数据挖掘的最新技术手段———基因功能模块, 从功能模块水平研究虚寒证发生的分子机制, 结果发现, 用25个差异基因分类样本准确率为93%, 用11个功能模块分类样本准确率为87%～100%。认为基于特征功能模块法研究基因表达谱更有利于对疾病的阐释。

2 应用基因芯片技术探讨针灸的作用机制

针灸以其明显的临床疗效已在世界范围内被广泛认可, 而基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段, 可以在一次试验中同时对成千上万个基因进行分析。针刺既然可引起人体多系统、多功能的同步变化, 因此可以设想, 通过观察不同穴位、刺激方法、频率、强度等, 导致有关组织基因转录的差异, 从而在分子水平全面而深刻地反映其广泛的作用途径和治疗靶点, 探明针刺的作用机制, 体现针灸的整体调节作用, 完善针灸理论, 为临床治疗提供依据和指导。

笔者在既往的实验中, 采用结扎冠状动脉前降支法复制大鼠急性心肌梗死模型, 比较肺经组与模型组、心经组与模型组、小肠经组与模型组的下丘脑基因表达谱变化。结果发现, 与模型组比较, 肺经组中大于2倍的差异表达基因 (包括EST) 有26个下调和57个上调, 心经组中有34个下调和190个上调, 小肠经组中有97个下调和122个上调。就大于2倍的表达基因而言, 仅仅在心经组和小肠经组出现促甲状腺激素释放激素 (TRH) 基因表达明显上调和促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 基因表达明显下调。认为下丘脑差异表达基因, 特别是TRH和CRH基因表达, 可能参与了电针心经、小肠经对急性心肌缺血的保护作用[6,7,8]。曲怡等[9]应用基因芯片技术研究电针对局灶性脑缺血-再灌注大鼠脑组织基因表达谱的影响, 研究结果表明, 筛选出的差异表达基因可能参与脑缺血-再灌注后脑损伤的发生及发展过程, 并参与了针灸抗损伤的机制。江励华等[10]采用基因芯片技术观察了电针治疗抑郁症的机制, 结果表明, 电针治疗抑郁症的机制与调控凝血、免疫、炎症反应和凋亡等相关的基因表达有关。

3 应用基因芯片技术探究中药作用机制

中药由于所含有效成分复杂、作用靶点不明确、重现性差, 难以用现行生物医学理论解释, 严重地制约了中药的现代化发展。基因芯片作为一种高通量、大规模研究基因功能的新技术, 能够从基因表达水平上阐明中医药治病的机制。伴随后基因组时代的来临, 基因芯片技术平台可以将中药的药性、功能及主治与其对特定模型细胞相关基因表达和调控的影响关联起来, 在分子水平上用现代基因组学的理论来解释传统中药理论及作用机制。

3.1 中药单方研究

李昊等[11]应用基因芯片研究藤梨根对胃癌细胞的作用, 结果表明, ERBB2、TRAILR2、p53、TNF、Cyclin E基因的表达改变可能与藤梨根杀伤和诱导胃癌细胞凋亡有关。于华芸等[12]利用基因芯片技术研究寒性中药黄连对正常大鼠肝脏全基因表达谱的影响, 结果提示, 黄连可上调炎症反应、免疫反应、防御反应相关基因, 增强抗感染、防御能力, 调控代谢、凋亡相关基因, 影响P450家族成员, 发挥代谢抑制、抗感染作用。其后, 于华芸等[13]又利用基因芯片技术探讨大黄“清热泻火解毒”作用的分子机制, 结果表明, 调控机体防御反应、花生四烯酸代谢相关基因表达, 可能是大黄发挥“清热泻火解毒”作用的分子机制之一。

3.2 中药复方研究

毛秉豫等[14]观察加味四物汤对自发性高血压大鼠 (SHR) 的心肌组织基因表达谱的影响。结果表明, 阳性基因重叠有18条, 其中高表达的基因有4条, 低表达的有14条。该方作用靶点较多, 可上调或下调SHR的某些与生物酶、血管活性物质、心肌纤维化、脂肪酸代谢有关基因的表达, 这可能是其产生药理作用的重要因素。王刚等[15]利用基因芯片技术对复方丹参滴丸对心肌梗死大鼠基因表达的影响进行评价和研究, 基因芯片结果表明, 复方丹参滴丸可通过调节Wnt信号通路等多个基因和信号途径来减少心肌梗死模型大鼠心脏缺血区的心肌损伤。袁丁等[16]观察中药复方小金丹对人肝癌细胞信号转导基因表达的影响, 结果表明, 小金丹能显著影响SMMC-7721细胞信号转导基因表达。

3.3 中药有效成分研究

吕纯芳等[17]应用基因芯片研究藏花素对膀胱移行细胞癌T24细胞基因表达谱的影响, 结果发现, 3 mmol/L藏花素作用于T24细胞48 h引起该细胞系基因表达谱的广泛改变, 其中表达差异2倍以上的基因共836个, 这些差异表达基因的功能涉及多个方面, 最为明显的是与细胞生长调节相关的细胞周期调节基因、细胞凋亡调控基因、DNA复制相关基因等类型。谭敏等[18]观察补骨脂素对人乳腺癌MCF-7 (ER阳性) 细胞基因表达谱的影响。结果显示, 经补骨脂素作用的实验组细胞样本与对照组细胞样本比较, 呈现差异表达的基因有1 113个。其中, 表达上调的有456个, 表达下调的有657个。差异表达明显的基因主要与细胞凋亡、细胞周期调控、核酸转译调节、转译因子活性、核苷酸转移酶活性、血管收缩调节等有关。黄杉等[19]应用基因芯片技术研究黄芩素对白色念珠菌基因表达谱的影响, 结果发现, 共有522个差异表达基因, 其中, 上调基因251个, 下调基因271个。差异基因功能主要涉及细胞周期、跨膜物质转运、多药耐药、毒力因子及热休克蛋白等。

4 小结

从基因概念的提出到人类基因组学计划的完成, 基因芯片相关技术得到了飞速的发展。目前, 基因芯片技术以其具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点, 而广泛应用于中医药领域, 主要体现在:中医证候、中药药效及药理学研究、中药有效成分筛选研究、中药毒性及不良反应研究等方面, 在基因组学与中医药学研究之间架起了一座桥梁, 为中医药客观化、定量化、标准化研究提供了技术上的保证。虽然基因芯片技术费用相对昂贵, 部分芯片特异性相对较低等局限了其在中医药领域的应用, 但仍有其广阔的发展和应用前景。

摘要：基因芯片技术是当今微观整体研究的一项最新技术, 现对应用基因芯片技术在寻找中医证候的基因组、探索针灸作用机制以及研究中药疗效的基因表达谱方面取得的成果进行综述。

芯片—基因组杂交技术 篇9

1 花期调节

1.1 品种特性

从北京引进的耐热转基因材料,种质名称为KT3-2,紫花,小叶形状为椭圆形,主茎茸毛为棕色,在黑河自然光照条件下生育期超过120 d,霜前不能正常成熟。该品种分枝性强,株型发散,2010年黑河出现历史最高温度39℃,该品种生长正常,对高温表现出了较强的耐受性,但对水分变化较敏感,属于喜肥水型品种。

1.2 种植方法

因为KT3-2在当地条件下不能正常成熟,花期较晚,自然条件下与当地多数品种花期不能相遇,所以要获得杂交成功,首先要解决花期不遇问题。通常亲本花期不遇可通过育苗移栽、遮光处理和温室分期播种等方法调节花期,使花期相遇。生育期差异在15～25 d的亲本,对其早熟亲本要进行分期晚播,晚熟品种要进行短光照处理[2,3]。因此,对温室移栽遮光处理和温室分期种植两种方法进行了比较。

用KT3-2作父本,当地骨干品种作母本。采用两种种植方法:(1)父母本均采用盆栽方式种植,母本分3期播种,播种日期分别为5月10日、5月20日、5月30日,将父本于4月12日催芽处理,待籽粒发芽于室内播种在育秧盘内,至长出一片真叶时再移至桶内,使父母本在自然条件下生长。(2)母本的种植方式和播期同处理(1),父本于5月10日播种,长出第一片真叶后移栽到桶中,用自制的遮光棚进行遮光处理,17∶00遮光,第二天7∶00去掉遮光棚,光照时间控制在10 h左右,遮光时间为从移栽直至开花。

在处理(1)即自然光照条件下,KT3-2的始花期(R1)为8月15日左右,与5月10日播种母本花期不能相遇,与5月20日播种的母本开花后期相遇,此时母本花基本接近顶部,虽然在花期重叠的时期每天都有新开的花朵,但其所处的节位对杂交的成活非常不利,所以,可认为第二期播种的母本也不适于大量杂交。5月30日播种的母本花期与KT3-2的花期重合较好,适宜杂交的花的数量多,且多在中间部位,对杂交果的成活率有较好的保障。所以,分期播种可以使父母本花期相遇,但母本出苗晚,生育期相应延后,所以后期需要在温室中继续种植,才能正常成熟。

在处理(2)即遮光条件下,KT3-2的始花期(R1)在7月20日左右,其花期与5月20日播种的母本花期相遇得较好。在此种处理条件下,父母本的盛花期基本重合,此时开放的花多处于植株中部节位,便于杂交操作,且数量较多,花朵较大,为提高杂交成功率提供有利条件。该种情况下,母本可在自然条件下正常成熟,杂交果的成熟度好,发芽势和发芽力较强。同时与处理(1)相比省去了后期为母本提供温室条件的工作,节省了部分人力。

2 授粉方式的选择

常用的授粉方式主要有2种,一种是清晨边去雄边授粉,另一种是下午去雄次日再授粉,有研究[4,5,6]表明,授粉方式对杂交成活率影响不大,不过对杂交果的生长速度有影响。先去雄再授粉的方式,去雄后雌蕊可以有进一步发育的时间,达到受精的较好状态,对杂交成活率有较好的保障。但是,大豆杂交时节多为雨季,所以去雄后的花蕾遇见下雨等恶劣天气,对雌蕊的发育造成不利影响[7,8,9],致使其受孕能力降低甚至是丧失,使得前一天的去雄工作前功尽弃。樊翠芹等[4]认为边去雄边授粉的方法虽然与上述方法成活率差不多,但适宜杂交的花的数量较少,所以成活的绝对数量也少,影响杂交效率。也有不去雄直接授粉的报道[10,11],这种方法利用雌蕊柱头比雄蕊花药早成熟的时间差,在柱头成熟后花药散粉前对其授粉。该方法对选花要求比较严格,每天适宜操作的花的数量也较少,会延长杂交时间加大劳动强度,父母本亲和力较差时容易出现伪杂种。

对比不同授粉方式的特点,采取一种折中的办法,即把早晨杂交的时间分为两部分,在前半部分时间内只去雄,连续对多个组合进行去雄工作,待父本散粉时,对各个组合集中授粉,一般去雄工作应该在早晨5∶30之前完成,可保证雌蕊未受孕。授粉应在7∶30以后进行,授粉的顺序是先去雄的花先授粉,这样既可以让去雄后的雌蕊有一段生长和愈合伤口的时间,又可以避免间隔过长时间,恶劣天气等外界因素对杂交过程的破坏,可以大幅提高杂交成功率。

3 杂交后的处理

大豆杂交过程中,花萼上半部分被去掉,这对整个花而言也是一种伤害,被去雄的花朵雌蕊直接暴露于空气中受外界影响较大,所以必要包扎措施有利于提高成活率[12]。有研究[13]表明杂交后不同的处理方式对杂交果成活率有很大的影响,包扎的比不包扎的成活率高,有保湿措施的比没有的成活率高,硫酸纸袋包扎比鲜叶包扎成活率高。多数育种单位的做法[2,10,14,15,16]是用鲜叶进行包扎,获得了较好的成活率。鉴于亲本数量少,要求杂交果数量又较多的情况,宜采取硫酸纸袋包扎,并在袋内加湿棉球来增加空气湿度的方法,有助于进一步提高成活率。

4 讨论