细胞毒性T淋巴细胞

细胞毒性T淋巴细胞（精选十篇）

细胞毒性T淋巴细胞 篇1

1 材料和方法

1.1 对象及材料

从黑龙江省医院, 哈尔滨医科大学附属第三医院, 哈尔滨医科大学附属第四医院选取大肠癌病例279例, 所有病例均经肠镜检查并取材, 经病理确诊为大肠癌且未进行放、化疗, 年龄41～74岁, 经患者本人及家属同意情况下, 取空腹外周静脉血。选取黑龙江省医院健康体检中心健康体检人群347例作为正常对照组, 年龄25～62岁, 要求排除其他癌症病史, 其他详细记录与大肠癌患者相同。DNA提取试剂盒购自天为时代公司;DNA扩增仪采用PE-5700型定量PCR仪;Taq DNA聚合酶购自Ta KaRa公司;引物由上海生物工程公司测序。

1.2 方法

1.2.1 大肠癌患者及正常对照组全基因组的提取

采集大肠癌及正常对照组外周血5ml, 采用ACD抗凝, 利用DNA提取试剂盒将外周血当中的基因组DNA提取出来, 在-20℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 CTLA-4基因+1822C/T位点扩增

利用DNA体外扩增-聚合酶链式反应 (PCR) , 对CTLA-4基因+1822C/T位点扩增。PCR上游引物序列:5’-CAT CAT TTA TAA ATT CAA-3’;下游引物序列:5’-CTA TTC TCA CAA TAA AAT-3’。PCR反应体系为:总体积为20μl;5×PrimeSTARTM Buffer (Mg2+plus) 4μl;dNTP Mixture (各2.5mM) 1.6μl;上、下游引物各0.75μl;DNA模板 (100ng/μl) 2μl;DNA polymerase 0.25μl;灭菌蒸馏水10.65μl。PCR扩增条件:94℃预变性4分钟;接着30个循环, 94℃变性45秒, 52.8℃复性6秒, 72℃延伸30秒;72℃终末循环4分钟;最后置于4℃终止。PCR扩增片段为201bp。

1.2.3 限制性片段长度多态性分析

用限制性内切酶BsmAI对PCR产物酶切, 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离, 用溴化乙啶染色观察。

1.2.4 统计学处理

运用Hardy-Weinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率, 医学统计软件SPSS协助对数据进行处理, 采用χ2检验和logistic回归分析并计算OR值, P<0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 CTLA-4基因+1822C/T位点多态性酶切结果

CTLA-4基因+1822C/T位点PCR扩增片段为201bp, 经限制性内切酶BsmAI对PCR产物酶切, 琼脂糖凝胶电泳分离后得到基因型TT纯合子, 长度分别为163bp和38bp两个片段, 由于38bp片段太短, 电泳无法观察到, 所以只看到一个163bp片段;基因型CC纯合子, 长度为201bp;基因型TC杂合子, 长度分别为201bp和163bp同样由于38bp片段太短, 电泳无法观察到。

2.2 大肠癌患者和正常对照组CTLA-4基因+1822C/T位点多态性分布

经Arlequin软件检验, 大肠癌患者组和正常对照组CTLA-4基因+1822C/T位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。279例大肠癌患者和347例正常对照组CTLA-4第1内含子区+1822C/T基因型及等位基因频率, 如表1所示TT、CC纯合子和CT杂合子基因型发生频率在大肠癌组与正常对照组间有显著差异 (P<0.05) ;T等位基因和C等位基因在大肠癌患者和正常对照组中也有显著差异 (P<0.05) 。

2.3 大肠癌患者和正常对照组

CTLA-4单体型分析应用haploview软件, CTLA-4基因第1外显子+49位点和CTLA-4第1内含子区+1822C/T位点构成3个单体型 (频率>5%) 。其中, 其中+49A+1 822C单体型在对照组中的频率大于大肠癌组中的频率, 有统计学意义 (P=0.032, OR=0.89, 95%CI=0.98～0.72) ;而+49A+1822T单体型和+49G+1822T单体型无统计学意义。

3 讨论

大规模的人群普查研究表明, 35岁以上的人群中, 大肠癌的发病率约为24～32例/10万人口[4,5,6]。在西欧、北美等发达国家, 大肠癌为最常见的恶性肿瘤。而处于相对低发区的中国, 发病率更是呈逐年上升的趋势。尽管临床研究已取得了较大进步, 但是其复发及转移率仍然很高。

大肠癌的发生发展除了和遗传因素以及环境因素有关外, 另一个重要的影响因素就是人体的免疫系统。免疫系统是一个复杂的细胞网络, 这一网络与保护人类抵御感染和肿瘤生长息息相关。免疫调节基因的遗传多态性对于包括肿瘤在内的复杂疾病的免疫功能和基因易感性的变异方面起着重要作用。在大肠癌的发生发展过程中, 主要的抗肿瘤效应是包括T淋巴细胞、自然杀伤细胞 (NK) 在内的细胞介导的免疫反应。T淋巴细胞被肿瘤细胞表面的特异性抗原激活以后, 发生一系列的级联反应使T细胞增殖, 同时也募集其他免疫细胞分泌细胞因子。细胞因子在调节免疫反应中的关键作用以及他们的不同免疫功能引起了许多研究者的兴趣。

人类CTLA-4基因定位于2号染色体色体长臂33带 (2q33) , 主要表达在活化的T细胞上, 它可与抗原提呈细胞表面的B7分子结合并抑制T细胞的增殖与活化[7]。肿瘤是一个环境和基因共同作用导致的复杂疾病, 已知肿瘤细胞逃脱免疫系统和细胞因子产物的作用是肿瘤发展和转移的关键步骤, 因此可以推测CTLA-4表达水平升高会导致T淋巴细胞低反应性从而促进肿瘤的发展进程[8]。本实验对黑龙江地区汉族人群中大肠癌患者和正常对照组进行了研究, 确定了第1内含子+1822C/T基因型及等位基因频率, 结果发现TT、CC纯合子和CT杂合子基因型发生频率在大肠癌组与正常对照组间有显著差异 (P<0.05) ;T等位基因和C等位基因在大肠癌患者和正常对照组中也有显著差异 (P<0.05) 。同时, 单体型分析, 结果显示+49A+1822C单体型在对照组中的频率大于大肠癌组中的频率, 有统计学意义 (P=0.032, OR=0.89, 95%CI=0.98～0.72) 。虽然单独分析的+49A/G位点与大肠癌没有明显关系, 但在单体型或与其他相关位点联合分析中显示出与大肠癌的发生和发展有密切联系。

综上所述, CTLA-4基因+1 822C/T位点基因多态性同+49A/G位点与+1822C/T位点确立的+49A+1822C单体型与黑龙江地区汉族人群中大肠癌的发病有相关性。

参考文献

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T淋巴细胞知识点学习总结 篇2

一、t淋巴细胞有哪些分类

T细胞是相当复杂的不均一体、又不断在体内更新、在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群，但分类原则和命名比较混乱，尚未统一。按免疫应答中的功能不同，可将T细胞分成若干亚群，一致公认的有：

辅助性T细胞(Helper T cells，Th)，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能;

抑制性T细胞(Suppressor T cells，Ts)，具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能;

效应T细胞(Effector T cells，Te)，具有释放淋巴因子的功能;

细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells，Tc)，具有杀伤靶细胞的功能;

迟发性变态反应T细胞(Delayed type hypersensitivityT cells，Td)，有参与Ⅳ型变态反应的作用;放大T细胞(Ta)，可作用于Th和Ts，有扩大免疫效果的作用;

原始的或天然T细胞(Virgin or Natural T cells)，他们和抗原接触后分化成效应T细胞和记忆T细胞;

记忆T细胞(Memory T cell，Tm)，有记忆特异性抗原刺激的作用。T细胞在体内存活的时间可数月至数年。其记忆细胞存活的时间则更长。

其中，Th细胞又被称为CD4+细胞，因为其在表面表达CD4(cluster of differentiation4)。通过与MHCⅡ(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)递呈的多肽抗原反应被激活。MHCⅡ在抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)表面表达。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。Tc细胞又名为CD8+细胞，其表面表达CD8。这类细胞可以通过MHCI 与抗原直接结合。

流式细胞分析仪FCM根据淋巴细胞表面标志的不同来检测各淋巴细胞亚群：

淋巴细胞主要包括T淋巴细胞(CD3+)，B淋巴细胞(CD19+)，NK细胞(CD16+CD56+)，其中T淋巴细胞可进一步测定辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、CD4+T细胞纯真亚群(CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+)和记忆亚群(CD4+CD45RA—/CD4+CD45RO+)、功能亚群(CD28+)、激活亚群(CD38+、HLA—DR+)、凋亡亚群(CD95+)等。

二、t淋巴细胞的表面标志是什么

T细胞抗原受体

成熟T细胞表面具有特异性识别抗原并与之结合的分子结构，称为T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)。TCR是一种双肽链分子，按肽链编码基因不同可分为两类：

1、在外周淋巴器官中大多数成熟T细胞(95%)的TCR分子，由α链和β链经二硫键连接的异二聚体分子，也称TCR—2。T细胞特异性免疫应答主要是这一类T细胞完成。

2、少数成熟T细胞的`TCR分子是由γ链和δ链组成的异二聚体分子，结构与TCRαβ相似，也称TCR—1。它可直接识别抗原(多肽、类脂分子)，不必与MHC结合，也不需要抗原提呈分子。TCRγδ主要存在于小肠粘膜上皮和表皮，而外周血中仅占成熟T细胞的0。5%—10%。TCRγδ识别病原体表面抗原分子后，增殖分化为效应细胞发挥杀伤作用，同时他对被病毒感染的细胞和肿瘤细胞具有杀伤活性。

T细胞分化抗原

1982年以来，国际有关专门会议把多数学者所制备的多种白细胞表面抗原的单克隆抗体进行了分类整理，并以分化群(cluster of differentiation CD)统一命名。应用分化群抗体所鉴定的抗原，称为分化群抗原(CD抗原)。已经命名了CD1—CD166共180个分化抗原群，其中CD4和CD8是区分成熟T细胞亚群的主要表面标志。

三、t淋巴细胞有哪些生物学功能

T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。

T细胞，是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。它们的正常功能对人类抵御疾病非常重要。到目前为止，有关T细胞的演化以及它与癌症的研究取得了不少进展。特别是21世纪初人类开始的生命方舟计划对于T细胞的演化以及它与癌症的研究更是取得了突破性的进展。

造血干细胞又称多能干细胞，是存在于造血组织中的一群原始造血细胞。其最大特点是能自身复制和分化，通常处于静止期，当机体需要时，分裂增殖，一部分分化为定向干细胞，受到一定激素刺激后，进一步分化为各系统的血细胞系。其中淋巴干细胞进一步分化有两条途径。一些干细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素影响下，大量增殖分化成为成熟淋巴细胞的一个亚群，被称之为T淋巴细胞。T细胞的“T”字，是采用“胸腺”的拉丁文第一个字母命名的。第二个细胞群在类似法氏囊的器官或组织内受激素作用，成熟并分化为淋巴细胞的另一个亚群，被称为B淋巴细胞。B细胞的“B”字，是采用“囊”的拉丁文第一个字母命名的。法氏囊是鸟类特有的结构，位于泄殖腔后上方，囊壁充满淋巴组织。人和哺乳动物无法氏囊，其类似的结构可能是骨髓或肠道中的淋巴组织(集合淋巴结，阑尾等)，亦有法氏囊作用。

四、t淋巴细胞的抗癌研究有哪些

1月初，日本科学家首次培育出能够杀死癌细胞的T细胞。他们表示这一研究突破为直接将T细胞注入癌症患者体内，用以对抗癌症铺平了道路。实际上，人体可天然产生T细胞，但数量较少。成功培育T细胞让将这种细胞大量注入患者体内，以增强免疫系统成为一种可能。

为了培育这种细胞，他们首先对专门杀死一种确定癌细胞的T淋巴细胞进行“再编程”，使其变成另一种细胞，被称之为“诱导性多功能干细胞”，诱导性多功能干细胞随后发育成功能齐备的T淋巴细胞。诱导性多功能干细胞发育而成的T淋巴细胞未来可充当一种潜在的癌症治疗手段。

日本科学家将专门对抗一种皮肤癌的T淋巴细胞培育成诱导性多功能干细胞，方式是将这种淋巴细胞暴露在“山中因子”环境下。山中因子是一组化合物，能够让细胞退回到“非专业性”阶段。在实验室，研究人员将诱导性多功能干细胞变成T淋巴细胞。与最初的T淋巴细胞一样，此时的T淋巴细胞也专功同样的皮肤癌。它们的基因构成与最初的T淋巴细胞相同，能够表达癌症特异性受体。研究发现这种新型T淋巴细胞非常活跃，可以产生一种抗癌化合物。

细胞毒性药物在PIVAS的配制 篇3

关键词细胞毒性药物PIVAS生物安全柜防护职业暴露操作规程恶性肿瘤

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.27.263

细胞毒性药物(Cytotoxicdrug)：一类可有效杀伤免疫细胞并抑制其增殖的药物。可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖系统、泌尿系统、肝肾系统的毒害，还有致畸作用。尽管存在巨大的不良反应，但由于替代性药物的缺乏，几十年来细胞毒性药物一直是治疗恶性肿瘤的基础药物。

常用细胞毒性药物：①生物碱类：紫杉醇、多西他塞、长春瑞宾、羟基喜树碱。②代谢类：吉西他宾、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤。③抗生素类：表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌。④烷化剂类：异环磷酰胺、达卡巴嗪。⑤铂剂类：顺铂、奥沙利铂。

静脉药物配置中心(PIVAS)是指在符合国际标准，依据药物特性设计的操作环境下，受过培训的药剂人员严格按照操作程序进行包括：静静脉营养液、细胞毒性药物和抗生素药物的配置。第一世界国家在70年代初相继建立PIVAS_［1］，2002年，我国卫生部颁布的《医疗机构药事管理暂行规定》中规定：“医疗机构要根据临床需要逐步建立静脉液体配制中心(室)，实行集中配制和供应_［2］。PIVAS使得肿瘤化疗和某些细胞毒性药物等对正常人体有伤害的药物由原来开放环境转入洁净安全的环境中，在相对负压的条件下进行配置，增加了职业防护，大大减少了对医护人员的伤害。近年来，随着人们生活环境的恶化，生活节奏的加快及不良生活习惯的养成，各种癌症的发病率呈现出不断上升的趋势。到目前为止，已经有60多种细胞毒抗肿瘤药物应用于临床。我院是肿瘤专科医院，静配中心成立于2006年底，有生物安全柜6台，主要承担我院恶性肿瘤患者化疗静脉用药的配制工作。美国国立职业安全与健康研究所提出警示的易造成严重职业危害的57种细胞毒药物中34种为抗肿瘤药物，比例近60%。澳大利亚卫生部门通过特殊显影实验已经证实：在配制化疗药物过程中，当打开粉剂安瓿时、抽取瓶装药液后拔针等操作时均有肉眼看不见的药液逸出，可形成含有毒性微粒的气溶胶或气雾。可直接通过口、皮肤、眼睛和呼吸道进入人体，危害护士身体健康和污染环境。据调查得知，近20%的护士不知道药液溢出该如何处理，仅19%的护士知道确切的处理细胞毒性药物的步骤。有研究显示最大的潜在危险是对细胞毒性药物的职业暴露。PIVAS护士每天长时间在密闭的环境中进行抗肿瘤药物配制，频繁的暴露在细胞毒性药物中。因此，在极易受到化疗药物污染的PIVAS护士应熟悉它的理化作用，知晓如何配置是必要的。

加强防护

工作人员应穿隔离衣，戴口罩、帽子、戴双层手套(内为聚乙烯不渗透手套，外为乳胶手套)，据调查研究，乳胶手套的防护性较好，且最好选用无粉剂的乳胶手套，因为含粉剂的乳胶手套可能会吸收部分外溢的药液并戴眼罩，防止经呼吸道、皮肤黏膜进入人体。

正确使用生物安全柜

安全柜只有在工作正常时才能使用。

安全柜前脸的玻璃观察窗不得在安全柜处使用状态时打开。防护玻璃开启不超过安全线保持低于18cm。

柜内放置的物品必须保持在最低数量。静压箱后部的空气循环不得受阻。前送风格栅也不得被物品堵住，否则会干扰气流从而可能使物品受到污染，使人员处在暴露状态。

柜内所有的工作要在工作面的中部或后部进行，并能从观察面板中看到。

应在每次工作完成后使用75%酒精清洁安全柜的表面。

柜子的风扇在工作开始前和工作完成后要再各运行5分钟。

熟练掌握操作规程，防止药液外溅

安全柜操作台面准备：操作台中央铺一块无均手套内包装纸，纸上备一块无菌纱布。防止药物外滴进行吸附并防渗漏污染台面。

配药前要保证注射器完好无损，乳头与针头连接牢固，防止针头脱离，尤其是抽吸油剂时。

抽吸药液最好根据药量选择注射器大小，药液最好不超过针筒的3/4。

配制瓶装药物时注意瓶内压力(强负压或强正压)要用相当的气压将瓶内药物吸出。

安瓿类药物在打开之前应轻敲其颈部和顶部，以保证没有药液或粉末滞留于该处，溶解药物时，应将溶媒缓慢注入瓶内，折断安瓿时应用无菌纱布包裹；已在针管内的药物，若需调整剂量或排气时，要回抽活塞后才能进行，并且应排在空安瓿内。

药物注入液体瓶时要注意瓶内压力，及时抽出瓶中气体以防拔针时瓶内压力过高药液溅出。

配制时若有药液滴漏要用纱布及时沾吸。

细胞毒性药物污染物需妥善处理

多余的药液应弃于密闭的容器中，废安瓿与小瓶，注射器，手套等所有污染过的材料要密闭集中及时处理，不得暴露在室内空气中。

在操作中要随时注意防止意外损伤

一旦皮肤不慎直接触到细胞毒性药物后，应立即用肥皂水清洗，清水冲干净，操作完毕后也应这样处理，洒在地面桌面的药物，应先用纱布吸附，并用清水冲干净。

讨论

细胞毒性药物是造成医护人员职业损伤的多种危害因素之一。操作过程中若不注意个人防护而吸入药物粉尘或雾滴，或药液接触皮肤直接吸收，或间接经口摄入，可引起人体肝脏损害，白细胞减少，自然流产率增高，而且有致癌、致畸、致突变的危险，特别是PIVAS护士，在进行配制操作中，频繁接触，虽然每次接触药物很少，但药物在体内有一定的蓄积作用，可产生远期危害。应加大对接触此类药物人员的自我防护意识的教育力度，专业培训，制定严格的规章制度和操作规程，采取保障医护人员身心健康的有效措施。

参考文献

1胡晋红,蔡溱.美国的医院药学［M］.上海:第二军医大学出版社,1996:6.

2卫生部.卫医发［2002］24号,2002.

细胞毒性T淋巴细胞 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

病毒性脑炎(病脑)组:收集我院2009年7月～8月份确诊病毒性脑炎42例,其中资料完整的病例20例。男性患儿14例,占70%,女性6例,占30%,年龄(3.5～14)岁,平均年龄8.3岁。其中,学龄前儿童(3.5～6岁)5例,占25%;学龄儿童(7～13岁)15例,占75%。20例患儿中仅1例诉发病前有游泳后劳累症状,2例有腹痛史,其余患儿均不能诉清明显诱发因素。自发病至入院就诊时间为(1～4)天,故均为急性起病;临床症状及体征:20例患儿中均以发热、头痛并呕吐起病,2例并发抽搐伴有意识障碍,1例伴有痛觉过敏,2例伴有腹部压疼痛。脑膜刺激征检查,20例全部有颈部抵抗感,其中,3例合并克氏征阳性,2例合并布氏征阳性,3例合并双侧巴氏征阳性;行常规脑电图监测结果示:弥漫高波幅慢波表现,结论为轻至重度广泛异常脑电图。此组病例均已除外合并有严重肝肾疾患及贫血性疾病的患儿。对照组:20例,男10例,女10例,年龄(3～9)岁,平均年龄6.5岁,均为正常健康查体儿童,近期预防接种者也予以排除。全部临床资料临床诊断符合《中国实用儿科杂志》2004年第7期关于病毒性脑炎的诊断及分期标准[1]。

1.2 治疗方法

确诊后早期给予甘露醇(青州尧王制药有限公司,生产批号:09050207)[(2.5～5)ml/kg/次]脱水降低颅内压,抗病毒治疗,激素(地塞米松(浙江仙琚制药有限公司,生产批号:090319304)(0.25～0.5)mg/kg/天)及丙种球蛋白(广东卫伦生物制药有限公司,生产批号:090414)(0.4g/kg/天×5天)调节免疫治疗,并能量等对症、支持治疗。治疗时间10～16天,平均2周。全部病例经上述治疗后达到临床治愈标准:(1)体温降至正常;(2)头痛、恶心及呕吐消失;(3)神经系统查体无异常发现。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集

将病脑组分别于急性期[入院后(1～2)天]、治疗后2周、治疗后4周行腰椎穿刺术抽取脑脊液,除常规送检外,另外留取2ml测定脑脊液中IgG、IgA及IgM的含量,应用美国Beckman Immage800特殊蛋白分析仪测定;同时于入院后,治疗后2周,治疗后4周抽取空腹静脉血2ml测T淋巴细胞亚群,肝素防凝,使用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪进行测定。

1.3.2 统计学处理

观察分析上述两类指标在不同时期的变化情况,不同时期的T淋巴细胞亚群百分含量与对照组比较,不同时期的脑脊液免疫球蛋白含量作自身前后对照。F检验确定两样本总体方差相等。各期和对照分别比较,采用两样本的t检验,定检验水准α=0.05。

2 结果

注:*P<0.05;△P<0.005。

病毒性脑炎患儿急性期T淋巴细胞亚群出现明显变化,表现在与正常对照组相比,百分率明显降低,差异有显著性(P<0.05),其中以降低尤为显著(P<0.005),百分率明显升高,差异有显著性(P<0.005);脑脊液免疫球蛋白与正常值比较,以IgA为主均有不同程度降低,但无显著性差异(P>0.05)。平均治疗2周后,T淋巴细胞亚群各项指标较治疗前有恢复,但仍较对照组有异常,差异均有显著性(P<0.05)。治疗4周后,全部免疫指标接近正常,与对照组比较无显著性差异。

3 讨论

人类白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)系列单克隆抗体可识别T淋巴细胞表面抗原决定簇,其中代表T细胞总数,细胞主要指Th细胞,可促进B细胞、细胞毒T细胞(CTL)及其他免疫细胞增殖和分化。细胞中Ts细胞可对抗Th细胞功能,Tc细胞则能特异性地杀伤携带抗原的靶细胞。某一淋巴细胞亚群数量或功能发生异常时,机体免疫平衡紊乱,可发生一系列病理损伤[2]。我们知道,病毒感染后激发中枢神经系统产生Ⅱ型变态反应,导致T淋巴细胞分化异常。T细胞亚群之间的相互促进和制约失衡[3,4],并继发产生各种淋巴因子,参与了脑损伤过程[1]。本文对20例病脑患儿急性期T细胞亚群进行测定,发现百分率降低,而百分率升高,均较对照组有明显差异,说明病毒性脑炎在发病的急性期主要以细胞免疫的紊乱为主,其最终表现形式、强弱和发生部位均与T细胞的功能状态有密切关系[5]。谢大泽等还认为年龄、病程与T细胞亚群的这种异常密切相关[6]。

对患儿急性期脑脊液免疫球蛋白测定结果按前文显示与对照组差别不大,这与以往报道相符[7]。可能与机体促进B细胞产生免疫球蛋白,而抑制此过程相对平衡有关[8],以致体液免疫变化不为主要;另外,因观察样本数量少、观察时间相对较短也可能影响结果。

本实验结果显示,T细胞亚群的改变还与病程密切相关。早期及治疗2周临床痊愈后,其数值均较对照组有显著性差异,病程4周之后则转为正常,说明病毒性脑炎在临床治愈之后仍有一段时间的免疫损伤,提示适当应用免疫调节剂、加强恢复期的康复治疗及随访,对于病脑的预后有一定的价值。另外,此组病人发病时间相对集中,以7、8月份为著,学龄期儿童多见,临床表现相同,但由于目前医院条件受限,不能进行病原学及进一步流行病学的监测,因此测定其患儿免疫学指标并进行动态观察,可以为病毒性脑炎提供有价值的诊断及治疗依据。

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细胞毒性T淋巴细胞 篇5

细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法

实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

一、用途：

药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

二、优点：

1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；

3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；

5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；

6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；

7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

三、所需设备及仪器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板

4.二氧化碳培养箱

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四、方法及步骤：

实验一：细胞增殖分析

1、制备细胞悬液：细胞计数。

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。

5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

实验二：细胞毒性分析

1、制备细胞悬液：细胞计数

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

五、实验注意事项：

·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。

·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。

·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。

六、经验总结及分享：

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括

1、种板数；

2、种板后细胞的贴壁生长时间；

3、加药后的孵育时间；

4、cck8试剂加入量；

5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。

做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。

补充

突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？

这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。

再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

细胞毒性T淋巴细胞 篇6

近年来研究发现，免疫功能紊乱是呼吸道疾病发生的最重要的内在因素。有研究发现，小儿反复呼吸道感染（RRTI）免疫异常者占20.9%～36%，而细胞免疫功能持续异常则是RRTI反复发生的主要原因[1]。鉴于免疫功能在呼吸道疾病中的重要作用，清楚了解免疫细胞的免疫功能、作用机制，将对掌握与之相关疾病的发生具有指导意义。现对T淋巴细胞的功能、与之相关呼吸道疾病可能作用机制及免疫治疗作一综述。

1 T淋巴细胞功能及可能作用机制

T淋巴细胞的功能大概可分为3种，即辅助功能、杀伤功能和抑制功能。T细胞具体功能及与之相关呼吸道疾病可能作用机制介绍如下。

1.1 辅助功能 T淋巴细胞辅助功能是辅助性T细胞（Th）辅助其他淋巴细胞发挥免疫活性的功能。Th细胞前体在抗原刺激下分化为Th0，Th0可同时产生Th1和Th2型细胞因子，在不同作用因素的作用下，Th0可分化为Th1和Th2。Th1细胞合成IL—2、IFN—γ、LT等，通过促进CTL、NK细胞及巨噬细胞活化和增殖，主要负责细胞免疫应答，抑制Th2的分化，在抗病毒和细胞内寄生菌感染中发挥重要作用；Th2细胞以分泌IL—4、IL—5、IL—6、IL—9和IL—10 等细胞因子为特征，辅助B细胞分化为抗体分泌细胞，抑制Th1的分化，主要负责体液免疫，主要参与B细胞增殖、抗体产生，在抗细胞外微生物、寄生虫的感染中发挥重要作用。因此，抗病毒主要是由Th1类细胞因子介导的细胞免疫的功能，而抗细菌感染主要是由Th2类细胞因子介导的体液免疫的功能[2]。

1.2 杀伤功能 T淋巴细胞杀伤功能是细胞毒性T细胞（CTL或Tc）具备的对靶细胞的直接破坏功能，CTL根据其分泌的细胞因子不同，可进一步分化为Tc1和Tc2两个亚型。分泌细胞因子类型与Th1类似的CTL细胞称为Tc1细胞；和Th2细胞类似的CTL称为Tc2细胞。IFN—γ和IL—12可促进Tc1的生成；IL—4可促进Tc2的生成。目前认为CTL杀伤靶细胞主要有两种途径，即细胞裂解性杀伤和诱导细胞凋亡。研究发现，NKT细胞在抗隐球菌感染中发挥重要作用。Vasan S [3]认为，当机体接触病原微生物时，NKT细胞可较快分泌IFN—γ等细胞因子 ，可诱导树突状细胞（DC）的活化和成熟，从而抑制病原体的感染。

1.3 调节功能 T淋巴细胞调节功能是T细胞对机体应答的负调节功能，具有免疫抑制功能，主要是通过抑制CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖，达到免疫的负调节作用，可以限制致病性抗原免疫应答过度所致的免疫损伤，在维持机体免疫动态平衡中具有重要的调节作用。调节性T淋巴细胞（Treg）可分为CD4+CD25+Tr细胞、Tr1和Th3等多种亚型，CD4+CD25+Tr细胞占CD4+T细胞的5%～10%，具有免疫无能和免疫抑制两大功能特征。Tr1也属于CD4+T细胞，多在IL—10的诱导下生成，具有巨噬细胞的功能，间接地抑制Th1细胞分泌IL—2和IFN—γ。Th3主要分泌TGF—β，可抑制Th1细胞介导的免疫应答和炎症反应，还可抑制B细胞、CTL细胞和NK细胞的增殖和功能，抑制细胞因子的合成。

2 免疫治疗

近年来，免疫调节剂在辅助治疗呼吸道疾病中起到非常重要的作用。现对几种常见的细胞免疫调节剂的功能、作用机理及应用介绍如下。

2.1 匹多莫德 匹多莫德是一种人工合成的免疫促进剂，有促进非特异性免疫反应和细胞免疫反应的作用[4]。文献资料表明，匹多莫德作用于免疫反应的不同阶段：在快反应期，刺激非特异性自然免疫，增强自然杀伤细胞活性，增强中性粒细胞和巨噬细胞的趋化、吞噬和杀伤作用；在免疫反应中期，可刺激细胞免疫，促进IL—2、INF—γ的产生，诱导T淋巴细胞增殖，调节Th /Ts的比例，使之正常化，通过促进CD4细胞分化成熟，提高CD4/CD8比值，因而可改善免疫功能低下患者T细胞亚群的比例失调，进而促进Th1、Th2分化成熟，恢复Th1、Th2之间的平衡，调节细胞免疫应答；在慢反应期，可刺激机体体液免疫，刺激B淋巴细胞增殖和抗体产生，通过这些免疫功能调节机制发挥其抗细菌和抗病毒功能。

2.2 转移因子 转移因子是指从健康人正常白细胞中提取的一种多核苷酸肽（分子量小于5000），不被胰蛋白酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶所破坏，可将供体的免疫信息转移给受体，使后者的淋巴细胞增殖分化为致敏的效应Tc细胞，从而获得供体样的特异性和非特异性细胞免疫功能[5]，并能间接影响抗体形成。转移因子能诱生干扰素，直接阻止病毒蛋白质的合成与复制，并能增强细胞表面抗原表达，促进NK细胞的细胞毒活性，调节T淋巴细胞和巨噬细胞功能，解除某些病毒对T淋巴细胞和T淋巴细胞亚群功能的抑制，防止其免疫功能受损。

2.3 胸腺肽 胸腺肽是由动物胸腺中提取的具有生物活性的多肽，具有提高细胞免疫、增加机体免疫监护和防御的功能，还具有双向免疫调节作用，通过免疫调节达到维持机体免疫平衡的目的。它通过增强T辅助细胞的数量和功能，促进淋巴细胞分化成熟，对T细胞亚群的异常具有免疫调节作用，从而增强机体的细胞免疫应答[6]。它通过调理Thl/Th2值，刺激胸腺内的前T细胞分化为成熟的T细胞亚群（主要为CD4、CD8两大类）有关，还能增强成熟的T淋巴细胞对抗原或其他刺激的反应。它可以增加白细胞介素— 2（IL— 2）及—γ干扰素（IFN—γ）分泌，通过IL—2和IFN—γ激活NK细胞，从而发挥免疫调节作用。

综上所述，生理情况下，T淋巴细胞各分子间维持动态平衡，可发挥正常的免疫应答功能，一旦机体平衡被破坏，当病原体入侵时机体可呈现过强的免疫应答或较弱的免疫抵御，使机体发生自身免疫性疾病或免疫缺陷病。免疫功能紊乱是呼吸道疾病发生的重要发病机制之一。因此，免疫调节剂的使用可增强患者的免疫功能，增强抵抗力，降低呼吸道疾病的发病率，是防治呼吸道疾病的一种较为有效的措施之一。

参考文献

[1] 王克萍.反复呼吸道感染患儿细胞及体液免疫功能及全血SIL—2R水平监测的临床研究[J].临床儿科杂志，2000，18（6）：352—354.

[2] 吴敏毓.医学免疫学[M].北京：中国科学技术出版社，2003：82—84.

[3] Vasan S，Tsuji M.A double2edged sword ： The role of NKT cells in malaria and HIV infection and immunity[J].Semin Immunol，2010，22（2）：87—96.

[4] 齐岩，孟丽红.匹多莫德治疗儿童反复呼吸道感染95 例疗效分析[J].中国中西医结合儿科学，2007，26（5）：375—376.

[5] 左志文，庄绪娟，王翠梅.转移因子咽部注射治疗慢性咽炎疗效观察[J].新医学，1996，27（2）：80.

细胞毒性T淋巴细胞 篇7

1资料与方法

1.1临床资料

我院2011年1月至2012年6月间共收诊恶性肿瘤患者60例,性别男38例,女22例;年龄最低48岁,最高78岁,平均(66.3±4.8)岁;原发症包括:乳腺癌10例,肺癌18例,肝癌16例,鼻咽癌6例,宫颈癌4例,前列腺癌2例,其它恶性肿瘤4例;患者癌症临床分期参照国际抗癌联盟TNM的相关标准[3]:II期24例,III期20例,IV期16例。

1.2方法

1.2.1 CIK细胞的制备所有患者于未化疗前取外周血液样本,采用血细胞分离机进行外周血液单个核细胞的分离,体积(70~90)ml;自单个核细胞内出淋巴细胞,含血清培养基将细胞浓度调至2×106/ml,浓度5%二氧化碳、37℃培养箱环境培养,当日加入基因重组人干扰素γ(INF-γ)1 000μ/ml静置24h后,加入基因重组人白细胞介素IL-1 50μ/L、IL-23×105μ/L、和CD3单抗50μg/L,继续培养和传代。

1.2.2肿瘤细胞制备临床治疗过程中取病变样本制备成肿瘤细胞株,包括肺癌细胞株(SC-1680)、乳腺癌细胞株(MCF-7)、前列腺癌细胞株(PC-3)等,分别以适当浓度接种于RPMI-1640培养基,浓度5%二氧化碳、37℃环境下培养,细胞贴壁生长。

1.2.3细胞回输细胞培养14d后,采用0.2%台盼蓝行CIK细胞计数,并回收CIK细胞对相应患者进行回输,行IL-2肌注,每日50万U,连用10日。

1.3观察指标

1.3.1细胞表型检测[4]分别取患者杀瘤前后1天的外周血液采用流式细胞仪进行免疫表型的检测。外周血液分离行细胞培养,PBS洗涤,再以荧光标记法标记抗体,振荡温和再离心去除上清液,PBS重悬细胞,于1小时内上机进行检测。

1.3.2细胞毒性检测杀瘤前后取外周血液分离单个核细胞与肿瘤细胞入培养基内,5%二氧化碳37℃环境下培养,18小时后细胞收集于玻璃纤维膜静待过夜,加入干燥滤纸,液体闪烁计数器测定OD值。另置空白培养基作为对照。计算杀瘤率[5]:

杀瘤率=[1-(实验组O D-对照组O D)]/对照组OD]×100%。

1.4统计学方法

所获数据录入软件包SPSS13.0进行数据处理,计量资料采用(±s)表示,t检验,计数资料采用X2检测。以P<0.05认为统计学具有显著差异。

2结果

2.1细胞表型

如表1,杀瘤前后淋巴细胞表型经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明显高于杀瘤前,CD8+明显低于杀瘤前。

如有2,杀瘤前后NK细胞表型经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后CD3+16+56+明显高于杀瘤前。

2.2细胞毒性

如表3,杀瘤前后CIK杀瘤率经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后杀瘤率明显高于杀瘤前。

2.3相关性研究

采用相关性分析发现,杀瘤率与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK细胞表型呈正相关(r=0.665,0.736,0.837,P<0.05),与CD8+呈负相关(r=0.728,0.823,P<0.05)。

3讨论

CIK细胞具有较好的免疫活性,属于新型肿瘤杀灭细胞类型,也是目前临床生物学研究肿瘤治疗的一种突破与创新。CIK细胞主要以人体外周血液中的单个核细胞利用体外环境进行培养,从而获得一群异质性细胞应用于患者的肿瘤细胞,起到杀灭癌症细胞的作用。何跃东等的研究指出,CIK具有高活性、快速增殖、广泛杀瘤谱等特点,临床应用于杀瘤范围广、效果佳、速度快,因而受到广泛重视[6,7]。本文采用流式细胞术对杀瘤前后的表型变化以及细胞毒性变化进行比较和相关性分析,希望为临床过继免疫治疗、以及自体CIK细胞恶性肿瘤治疗提供科学依据。

淋巴细胞和NK细胞是临床反应组织细胞免疫状态的重要指标之一,而肿瘤患者随着病情的发生与进展,免疫系统受到严重破坏,免疫状态低下,淋巴细胞和NK细胞在这个病理过程中表现出明显的变化。淋巴细胞被认为是细胞免疫的效应细胞,可调节机体的免疫功能,因而对淋巴细胞表型的监测与比较可明确肿瘤细胞在机体内的变化情况和免疫调节机制。CD3和CD4存在于淋巴细胞表面,参与T细胞的信号转导,可标记T淋巴细胞。CD3和CD4细胞表型的增高说明T细胞受体与CD3、CD4复合物分化、发育、成熟后迁移至机体外周血中,并游离于外周淋巴组织,从而提高细胞免疫应答的介导,提升免疫应答能力,患者免疫功能获得提升[8,9]。CD8属于T淋巴细胞亚群,可识别和呈递抗原,可对免疫细胞表面结合的抗原物质产生识别,对抑制性T细胞的标记。CD8表型的下降,体现了机体免疫力的提升。在本组研究中,杀瘤后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明显高于杀瘤前,CD8+明显低于杀瘤前,提示经CIK细胞杀瘤后,患者机体的细胞免疫能力增强,从而提示杀瘤实验的有效性。NK属于非抗源依赖性的免疫效应细胞,对敏感的肿瘤细胞具有直接杀灭作用[10],CD16和CD56是其主要的标志物。在本组研究中,杀瘤前后NK细胞表型明显高于杀瘤前,提示CIK细胞在回输患者机体后促进了杀瘤作用,提高免疫细胞活性,从而获得有效的肿瘤治疗目的。

淋巴细胞与NK细胞的表型在杀瘤后的变化说明了CIK细胞抗原在肿瘤细胞的杀灭过程中起到了重要的作用。而对杀瘤率与细胞表型的相关性分析结果又显示,CIK细胞的杀瘤率确实与淋巴细胞和NK细胞具有相关性,杀瘤率与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK细胞表型呈正相关,与CD8+呈负相关,就此也证实了CIK细胞的杀瘤有效性。希望临床相关研究进一步深入探讨,也希望CIK细胞的肿瘤治疗能够上一个新的台阶,为广大癌症患者带来治愈的曙光。

摘要：目的:研究和探讨CIK细胞杀瘤实验前后细胞表型以及细胞毒性之间的相关性,希望为相关生物学研究提供科学依据。方法:我院恶性肿瘤患者60例于未化疗前取外周血液样本,制备CIK细胞、肿瘤细胞并进行细胞回输,荧光标记法检测细胞表型,液体闪烁法计算细胞毒性,并进行杀瘤前后的比较分析。结果:杀瘤前后淋巴细胞表型经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明显高于杀瘤前,CD8+明显低于杀瘤前。杀瘤前后NK细胞表型经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后CD3-16+56+明显高于杀瘤前。杀瘤前后CIK杀瘤率经统计学比较具有显著差异(P<0.05),杀瘤后杀瘤率明显高于杀瘤前。杀瘤率与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK细胞表型呈正相关(r=0.665,0.736,0.837,P<0.05),与CD8+、CD19呈负相关(r=0.728,0.823,P<0.05)。结论:CIK细胞抗原在肿瘤细胞的杀灭过程中起到了重要的作用,且具有有效性,与淋巴细胞和NK细胞表型呈正相关。

关键词：CIK,杀灭肿瘤,细胞表型,细胞毒性,相关性研究

参考文献

[1]李晓英,鲍杨漪,江蓓蕾,等.不同类型肿瘤患者自体CIK细胞治疗对机体免疫状态及临床症状改善的影响[J].安徽医科大学学报,2012;47(4):434~436

[2]王健,苏安英,柴锡庆,等.Tα1对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导T细胞杀瘤活性的影响[J].世界华人消化杂志,2008;16(32):3673~3675

[3] Perreau M,Mennechet F,Serratrice N,Glasgow JN,et al.Contrasting effects ofhuman,canine,and hybrid adenovirus vectors on the phenotypical and functionalmaturation of human dendritic cells:implications for clinical efficacy[J].Virol,2007;81(81):3272~3282

[4]杨妤,杨新辉,周光华.恶性肿瘤患者外周血CIK细胞体外增殖能力及其杀伤活性[J].医学临床研究,2012;29(1):27~29

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[6]何跃东,潘小玲,刘珊玲,等.脐血淋巴因子激活的杀伤细胞杀瘤活性的研究[J].中国输血杂志,2007;20(6):491~494

[7]陈诗萍,买世娟,余杏娟,等.树突状细胞诱导的CIK细胞对肺癌生长的抑制作用[J].中国医药生物技术,2012;7(2):125~127

[8]杨光,李汉冲,王彬.自体CIK细胞治疗恶性肿瘤免疫表型和杀伤活性变化[J].中国实用医刊,2009;36(24):1~5

[9]朱继红,张晓明,苗榕生,等.脑出血患者外周血粘附分子表达及T淋巴细胞亚群变化[J].中国医药导刊,2003;5(4):255-256.

镍离子体外细胞毒性研究 篇8

镍合金是一种在医疗器械领域应用广泛的生物材料,其中镍钛合金因其具有形状记忆性和超弹性,被用于制造血管支架、正畸丝、封堵器等[1]。镍铬合金是常见的口腔医用材料之一。由于镍是一种具有较高毒性的元素,因此镍合金的生物相容性一直备受关注。从上世纪七八十年代至今,已经开展了大量关于镍合金生物相容性的研究,其中包括细胞毒性研究。目前关于镍合金细胞毒性的研究方法主要是采用浸提液法,将镍合金在浸提介质中浸提,然后用浸提液进行细胞毒性检测。大部分试验结果表明镍合金无细胞毒性或者具有轻微的毒性[2]。镍合金材料主要的有害溶出物为镍离子,镍离子浓度变化如何影响细胞增殖并无系统的研究[3]。本文选择七种不同种类的细胞对镍离子的细胞毒性进行研究。选择L929小鼠结缔组织细胞主要考虑到其为医疗器械细胞毒性试验首选细胞。选择h9c2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞主要考虑到心血管支架及封堵器等产品是镍钛合金材料的重要应用方向。选择h FOB1.19人成骨细胞主要是考虑到镍钛合金材料也常应用于骨科医疗器械。293[HEK-293]为人胚肾细胞和THLE-3为人肝永生化细胞,这两株细胞的选择主要考虑到肾与肝为主要的毒物代谢器官。H9为人T淋巴瘤细胞和IM-9为人外周血B淋巴细胞,这两株细胞的选择主要是想考查镍离子对免疫细胞的毒性影响。

本研究中所选取的细胞毒性研究方法是根据医疗器械生物学评价标准推荐的方法,以MTT为显色剂,结果以细胞相对增殖率表示,并按细胞毒性的分级标准进行分级[4,5]。此外,计算镍离子对各种细胞的TC50值。因此,本研究的结果对于含镍医疗器械的细胞毒性评价重要的参考价值。

1 材料和方法

1.1 试剂

六水氯化 镍 ( Sigma ) ; MEM培养基(HyClone);小牛血清(天津康源生物技术有限公司);胰酶/EDTA(Hy Clone);PBS(不含Ca和Mg)(吉诺生物医药技术有限公司);MTT(Sigma-Aldrich);青霉素-链霉素(吉诺生物医药技术有限公司);谷氨酰胺(Solarbio);二甲亚砜(DMSO)(Sigma);钛合金;DMEM培养基;MEM-EBSS培养基;DMEM/F12(1:1);CloneticsCorporation, Walkersville, MD 21793培养基;RPMI1640培养基。

1.2 仪器、设备及耗材

二氧化碳细胞培养箱 ( MCO-18AIC , 三洋 ) ;超净工作台(BCN-1360B);液氮罐(YDS-50B-200,东亚);倒置显微镜(DMIL,莱卡);酶标仪(MK3,Thermo);4 oC及-20 oC冰箱;高压灭菌锅;天平;细胞计数板;微量加样器(1 000μL、100μL和10μL);25 cm2培养瓶;96孔细胞培养板;吸管;冻存管;离心管;滤器;加样枪头。

1.3 细胞

H9c2 (2-1) ; 293[HEK-293];hFOB1.19 ;THLE-3;H9;IM-9;L929,均从ATCC购买。

1.4 试剂配制

氯化镍贮备液将六水氯化镍溶于生理盐水中配制成镍离子浓度为4 g/L的贮备液,用无菌滤头过滤除菌后备用。使用时用培养基梯度稀释,使其接触细胞的终浓度为160 mg/L,80 mg/L,40 mg/L,20 mg/L,10 mg/L,5 mg/L,2.5 mg/L,1.25 mg/L。

MTT用PBS溶液中,配成浓度为5 mg/m L的溶液,过滤灭菌,分装后避光保存在-20 oC。

阳性对照将用培养基配制5%的DMSO作为阳性对照。

阴性对照用培养基对钛合金进行浸提,浸提液作为阴性对照。

1.5 试验步骤

1.5.1细胞培养

H9c2(2-1)用DMEM培养基,293[HEK-293]用MEM-EBSS培养基,h FOB1.19用DMEM/F12(1:1)培养基,THLE-3用Clonetics Corporation, Walkersville,MD 21793培养基,H9和IM-9用RPMI 1640培养基,L929用MEM培养基。将各种细胞培养于含10%小牛血清的相应培养基中,静置于37 oC、5%CO2、95%相对温度的恒温培养箱中孵育。

1.5.2 接种及给药

待细胞处于对于生长期时,贴壁细胞用0.25%的胰酶进行消化后调成1.5×104细胞浓度,悬浮细胞直接调节成1.5×104细胞浓度。细胞悬液接种于96孔培养板,设空白对照、阴性对照、阳性对照和8个不同镍离子浓度试验组,每组各设至少8孔,每孔接种100μL细胞悬液。

置于5%CO2培养箱37 oC培养24 h后,贴壁细胞弃去原培养液,悬浮细胞维持原培养基。空白对照组加入新鲜细胞培养液,阴性对照组加入阴性对照浸提液,阳性对照组加入阳性对照液,试验组加入相应浓度的镍离子溶液,每孔100μL,置于培养箱继续培养72 h。

1.5.3 吸光度测定:

每孔加入20μL MTT溶液,继续培养4 h后,贴壁细胞组弃净孔内液体,加入100μL DMSO,悬浮细胞组直接加入100μL DMSO。置振荡器上振荡10 min,在酶标仪570 nm和630 nm波长下测定吸光度。

1.5.4 计算相对增殖率:

式中:

RGR──相对增殖率,%;

A──供试品组(试验组、阴性对照组、阳性对照组);

AB──空白对照组吸光度。

1.6 细胞毒性分级

按GB/T 14233.2-2005标准中细胞毒性试验推荐的分级方法[5],根据相对增殖率进行分级,级别越高细胞毒性越大。

1.7 计算IC50值

取细胞增殖率曲线中涵盖增殖率为50%的一段,对其进行拟合,得出线性方程,再计算出IC50值。

1.8 统计学处理

统计学处理应用SPSS 11.0 for Windows软件。

2 结果与讨论

2.1 细胞相对增殖率及细胞毒性分级

相对增殖率见表2,按表1细胞毒性反应分级原则进行分级,细胞毒性级别见表3,从细胞毒性分级结果来看,所有种类细胞增殖率随着镍离子浓度增加而降低。所有种类细胞的细胞毒性在镍离子浓度为1.25 mg/L时,均不大于1级。当镍离子浓度为2.5 mg/L时,除H9细胞毒性结果为2级,其他均不大于1级。当镍离浓度度增加到5 mg/L时,H9c2(2-1)、293[HEK-293]及L-929三种细胞毒性仍不大于1级,而h FOB1.19和THLE-3细胞毒性为2级,而IM-9和H 9细胞毒性分别为3级和4级。当镍离子浓度为10mg/L时,L929细胞毒性为2级,293[HEK-293]、H9c2(2-1)、h FOB1.19及THLE-3细胞毒性为3级,H9和IM-9细胞毒性为4级。当镍离子浓度大于等于20 mg/L时,所有种类细胞毒性均4级。由此可见,1.25 mg/L浓度对目前所用的七种细胞都是安全的,而大于20 mg/L时所有的细胞毒性均为4级。

值得注意的是L929细胞,作为医疗器械细胞毒性推荐的首选细胞,目前各检验中心也均使用L929细胞进行细胞毒性试验。对于L929细胞,只要镍离子浓度不高于5 mg/L,均无细胞毒性。因此在对于含镍医疗器械产品进行生物学评价时,只要该产品的镍离子溶出后终浓度不大于5 mg/L, 可以推断细胞毒性试验结果应该能符合目前我国对细胞毒性结果不大于1级的要求。

2.2 IC50值

IC50结果见表3。IC50值可以反应细胞对化学物毒性的敏感程度,IC50值越低说明细胞对该化学物越敏感。从IC50的值可看出,H9的IC50最低,为3 mg/L,IM-9的IC50为6 mg/L,h FOB1.19为8 mg/L,THLE-3和H9C2(2-1)为9 mg/L,293[HEK-293]为10 mg/L,L929的IC50最大,为15 mg/L。由此可见H9细胞对镍离子毒性最敏感,而L929细胞对镍离子毒性最耐受。Schmalz G等[6]研究发现,镍离子对L929细胞的IC50值在332μmol/L,也即19.5 mg/L,高于本研究结果。可能是由于本试验中细胞浓度和细胞接触毒性物质的时间与文献报道有差别。Issa等[7]用MTT法研究不同浓度的镍离子对牙龈成纤维细胞毒性进行研究,发现镍离子对牙龈成纤维细胞的IC50值达到827.9μmol/L,也即是48.6 mg/L,远高于本试验中各种细胞的IC50值。目前医疗器械细胞毒性试验首选L929细胞作为评价细胞,从本实验结果来看,L929细胞是一种对毒性较耐受的细胞,相对不敏感,但选择较耐受的细胞有利于实验体系的稳定。细胞毒性为体外试验,对医疗器械毒性仅起到初筛的作用,还需要配合体内试验对医疗器械生物相容性进行综合评价。

3 结论

本研究结论如下:(1)不同细胞对镍离子的敏感度不同,H9细胞对镍离子最敏感,而L929细胞对镍离子的毒性最耐受。(2)当镍离子浓度不大于1.25 mg/L时,细胞毒性均不大于1级,当镍离子浓度为20 mg/L及以上时,所有细胞毒性级别均为4级。当浓度处于1.25 mg/L到20 mg/L之间时,不同细胞的细胞毒性级别有所差别。根据目前我国对医疗器械细胞毒性要求,镍离子浓度在1.25 mg/L以下可认为是安全的。体外毒性研究结果对体内毒性研究有一定的预示作用,本次体外细胞毒性研究得出的安全浓度值对今后含镍医疗器械全身毒性研究及毒性限量建立具有参考价值。(3)目前医疗器械细胞毒性试验采用L929进行试验,根据本文研究结果,当医疗器械镍离子溶出的终浓度在5 mg/L以下时,可预测溶出的镍离子不会引起细胞毒性。如果含镍器械接触人体部分成简单,可能的潜在毒性来源只有镍元素,本试验结果可以直接用于判断该器械可能的细胞毒性。如果含镍器械与人体接触部分组成复杂,可能含有除镍元素外的其它潜在毒性源,应该在本研究结果的基础上充分考虑其它潜在毒性。(4)本研究结果可为含镍医疗器械生产企业初步筛选细胞毒性合格的原料提供依据。

起搏器用植入材料的细胞毒性研究 篇9

细胞毒性实验是利用体外细胞培养方法来评价生物材料或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性, 是生物学评价体系中最基本的检测指标之一, 一般列为首选和必选项目。为了更灵敏地反映起搏器材料的细胞毒性, 实验采用材料浸提液与细胞接触的方法, 反映材料对细胞生长及活性的影响。

实验按照美国药典进行细胞毒性评价, 采用噻唑蓝比色 (MTT) 法进行定量分析, 其原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将3-2 (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴盐还原, 产生紫色结晶物, 用二甲基亚砜溶解, 其吸收值与活细胞量成正比[2]。用酶联免疫检测仪测定其光密度值, 通过与对照组的比较得到实验组的相对增殖率, 从而评价受试样品的细胞毒性。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 受试样品:

环氧树脂EP-301, 组分由EPOXY TECHNOLOGY提供, 室温固化;纯钛Ti:宝鸡英特耐公司, 医用级, 经喷砂处理;硅橡胶R-633, 双组份由Biomax提供, 室温固化48h以上。样品依照GB/T16886.12制备, 并经超声波清洗干燥后, 通过环氧乙烷灭菌。

1.1.2 细胞细胞系:

选用小鼠成纤维细胞株L929, 南方医科大学提供, -196˚C下冻存备用。

1.1.3 培养基:

DMEM:美国GIBCOBRL公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 浸提液制备

以DMEM培养基作为浸提介质, 按照3cm2/ml的比例进行浸提, 浸提条件为37˚C, 时间为72h。阴性对照为纯DMEM培养基, 阳性对照为5%二甲基亚砜DMSO溶液。

1.2.2 细胞基数和血清浓度选择

将冻存的L929小鼠成纤维细胞复苏后, 置入含血清DMEM培养瓶培养。待细胞长势良好后, 制成悬浮液, 采用正交法, 梯度浓度加入细胞和血清至培养板, 再加入DMEM培养基, 培养3天, 通过观察细胞的长势形态和数量, 确定细胞毒实验用细胞基数为2000个/孔, 血清浓度为2%。

1.2.3 MTT细胞毒实验

取对数生长期的L929细胞, 按选定细胞基数接种于96孔细胞培养板, 以含5% (体积分数) 二氧化碳的空气作为缓冲系统, 在37˚C下进行培养24h后, 弃去培养孔中的培养基, 加入等量浸提液和2%体积比的血清为培养介质, 每样品各5个复孔, 继续培养48h, 72h, 96h后于光学显微镜下观察拍照。各观察期, 在细胞拍照后, 每孔加入20ulMTT液, 继续培养3h, 小心吸去液体, 加入二甲基亚砜DMSO 150ul/孔, 避光振荡10min, 在酶标仪上以570nm波长测其OD570值。

1.2.4 细胞毒性评价

实验对RGR范围按照表1所示, 分为5级对材料细胞毒性程度进行评价[3][4]。

2 结果

2.1 细胞形态观察

高压蒸汽灭菌的样品浸提后, 按2000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板, 每样品各5个复孔, 继续培养48h, 72h, 96h后于倒置显微镜下观察拍照。图1为样品在各时间显微镜照片, 可以看出随时间增加, 细胞数目增殖明显, 细胞形态正常, 数目与空白对照相差不大, 少量的死亡细胞呈现圆形且亮度明显, 复合细胞的正常代谢。而阳性对照组细胞几乎全部死亡, 呈现出规则圆形和少量细胞碎片。

2.2 MTT法测定细胞增殖。

按照MTT方法对各受试组测定其OD570值, 结果如表2所示, 其中所得数据均采用统计学分析, 使用Excel 2003软件将同一时期内各组的吸光度值OD570值作方差分析和均数间两两比较的统计学分析。以P<0.05为差异有显著性[5]。

细胞相对增殖率 (RGR) 的计算公式:

RGR=实验组OD570/对照组OD570

本实验采用未加样品培养液为空白对照组。

RGR计算结果集材料毒性程度评价如表3, 3种材料的细胞毒性评级结果为0级或者1级。

3 讨论

MTT试验法具有通用性, 已广泛用于各种医用材料的评价。将细胞增殖度与细胞形态学观察相结合, 可以更加有效地评价材料的细胞毒性。

实验参照GB/T16886.5-2003-ISO 10993-5:1992 (医疗器械生物学评价细胞毒性试验-体外法) 的评价标准和要求, 选择了最常用且与材料应用条件类似的浸提条件及实验细胞系。通常材料的细胞毒性随浸提液浓度的增加而增加[6], 实验选用100%浓度的浸提液进行细胞培养和检测, 最大限度的放大了材料的毒性效应。L-929细胞是细胞毒性试验中应用最早, 使用最广泛的细胞, 已被美国质量标准协会推荐为细胞毒性试验中的两种标准细胞之一[7]。

在此条件下, 实验选用材料其细胞毒性均保持在0级和1级范围之中, 未见细胞毒性作用, 但由于体外实验本身的局限性, 实验材料应用于人工心脏起搏器还需要系统的实验研究, 并不能依据此次实验结果给出材料生物相容性的结论。实验结果为3种材料应用于植入材料方面提供了一定的实验数据, 为植入式人工心脏起搏器的研究开发提供了材料学的研究基础。

摘要：目的:对NERC植入式人工心脏起搏器拟用的环氧树脂、钛金属以及硅橡胶等材料进行细胞毒性实验, 探讨各材料对L-929细胞的毒性作用情况, 为材料在起搏器的应用提供依据。方法:按照GB/T 16886, 制备样品及各种材料的浸提液。分别在48h、72h、96h天, 对细胞生长状况进行观察, 并通过MTT方法, 检测各种材料浸提液对成纤维细胞的细胞毒性作用, 根据细胞相对增值率, 对材料毒性进行分级。结果:成纤维细胞在起搏器相关材料浸提液中生长正常, 细胞形态良好, 各浓度浸提液对成纤维细胞的相对增殖率均在90%以上, 材料毒性分级为0级或一级。结论:选用相关材料细胞相容性良好, 基本上无细胞毒性, 符合植入式人工心脏起搏器材料细胞毒性要求。

关键词：细胞毒性,MTT,心脏起搏器

参考文献

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[4]李玉宝生物医学材料化学工业出版社2003 281

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[6]Richardson R R J r, Miller J A, Reichert W M.Polyimidesas biomaterials:preliminary biocompatibility testing.Biomaterials, 1993, 14 (8) :627-635.

细胞毒性药物使用中的管理 篇10

1 了解常用抗癌药物的分类及适应证

1.1 烷化剂

环磷酰胺主要用于恶性淋巴瘤、淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤。异环磷酰胺主要用于肺癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌。

1.2 抗代谢类

阿糖胞苷对急性非淋巴细胞性白血病疗效较好, 对慢性粒细胞白血病的急变期、恶性淋巴瘤也有效。吉西他滨适用于中晚期非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他实体瘤。氟尿嘧啶适用于胃肠道肿瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等。替加氟主要用于治疗消化道肿瘤, 亦可用于乳腺癌。

1.3 抗肿瘤抗生素类

多柔比星适用于急慢性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部瘤及其他实体瘤均有效。吡柔比星适用于头颈部癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、恶性淋巴瘤和急性白血病。柔红霉素适用于急性粒细胞性白血病、成骨肉瘤。

1.4 植物类

紫杉醇主要用于卵巢癌和乳腺癌及非小细胞癌的一线治疗和二线治疗。多西紫杉醇主要对晚期乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌有较好疗效。

1.5 其他抗肿瘤药

顺铂对睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌有良好疗效。卡铂主要用于卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食管癌、膀胱癌等。奥沙利铂用于经氟尿嘧啶治疗失败后的结、直肠癌转移的病人。

2 掌握抗癌药物性质, 正确管理

对于难溶药物如环磷酰胺等, 注入溶剂后, 一定要充分溶解, 抽出空气, 可易于溶解, 完全溶解后才能使用, 注射剂稀释后不稳定, 应于2 h～3 h使用。阿糖胞苷静脉输注液应稀释至0.5 mg/mL, 配制好的注射液可在4 ℃保存7 d, 室温下仅能保存24 h[2]。吉西他滨, 配制好的溶液应贮藏在室温下 (15 ℃～30 ℃) , 不得冷藏, 在24 h内使用, 单次静脉输注时间通常是30 min, 最长不超过60 min。多柔比星, 配制好的溶液应在2 ℃～8 ℃处避光保存, 并于24 h内使用。紫杉醇未稀释的浓溶液不要接触聚氯乙烯塑料器械或设备, 且不能进行静脉滴注, 必须稀释成0.3 mg/mL～1.2 mg/mL的溶液才能使用。替加氟呈碱性且含碳酸盐, 避免与含钙、镁离子及酸性较强的药物合用。

3 加强输液管理, 合理使用静脉

3.1 做好评估

给药前评估病人是初次化疗还是多次化疗, 血管是否受损, 以及对化疗相关知识的掌握程度。若为初次化疗, 向病人讲清楚静脉炎及药物外渗的临床表现。评估药物的特性, 根据药物外渗后对组织的损伤程度, 将细胞毒性药物分为发疱性药物、刺激性药物、非发疱性药物3类。了解对血管的刺激性, 对发疱性药物, 要严密监测输液过程, 防止外渗。

3.2 选择合理的静脉给药通道

3.2.1 静脉的选择

选择有弹性且直的静脉, 避开淤血、发炎的部位, 避免在循环功能不良的肢体上给药。手背和腕部富有细小的肌腱和韧带, 药液一旦外渗造成的损伤极难处理, 甚至致残, 故对强刺激性药物, 不可在该处注射, 宜用前臂较粗的静脉。

3.2.2 静脉穿刺器材的选用

直接单次注射可使用头皮针, 头皮针宜选用7号针头, 针头越细, 对静脉的伤害越小, 而且有较多的血流经过针旁, 可以尽快除去具有刺激性的药物, 以减少化学性静脉炎的发生。连续静脉输注时, 应用静脉套管针可提供更好的安全性, 连续多日静脉输注且多疗程注射时最好应用中心静脉给药, 能更好地保护静脉, 防止外渗。

3.2.3 输液管道的选择

正确选择输液管道, 减少药物的吸附或有害物质的析出。含有增塑剂的输液器或输液管道可影响某些药物的稳定性, 如紫杉醇, 需采用非聚氯乙烯类注射器和输液管[3]。某些药物遇热易分解, 对光不稳定, 如卡铂、顺铂等, 在连续静脉输注时, 要选择避光输液管。

3.3 给药前的注意事项

给药前先用生理盐水测试, 检查回血是否顺畅再给药。如果同时给予数种药物, 先用刺激性强的药物[4], 因为此时的静脉完整性较好、外渗的几率低, 给每种药物前后都要用生理盐水或葡萄糖 (奥沙利铂只能用5%葡萄糖液) 冲洗静脉, 以免产生相互作用。

3.4 经外周静脉给药的注意事项

经外周静脉给药的过程中, 应当密切观察病人的情况, 询问病人注射部位有无疼痛、灼热感。如果发现任何外渗的可能性, 立即停止注射并按照化疗药物外渗处理。在需要另选一条静脉注射时, 最好选择对侧手臂。如果必须在同侧手臂的静脉或原注射过的静脉输液, 要选择近心端的静脉输注, 以免穿刺部位渗漏。

4 掌握药物的主要毒性反应、及时处理

4.1 静脉炎的处理

①喜疗妥软膏外涂, 可迅速缓解疼痛和压迫感, 减轻水肿和血肿, 对皮肤无刺激性, 其有效成分能迅速吸收而在患处发挥作用。外涂喜疗妥霜剂时, 要有一定的厚度, 以保证药物的持续性, 保证治疗效果。②50%硫酸镁冷湿敷, 50%硫酸镁为高渗溶液, 湿敷可引起神经肌肉的传导发生阻断而使血管平滑肌松弛、血管扩张, 促进局部血液循环, 从而减轻炎症反应。③中药外敷。黄柏、黄芩、黄连各10 g水煎湿敷, 每天2次, 每次0.5 h。

4.2 药物外渗的处理

①立即停止输液或静脉注射, 保留穿刺针头, 利用此针头尽量回抽渗漏在皮下的药液, 由保留针头注入相应的细胞毒药物拮抗剂后拔针并于局部皮下注入解毒剂[5]。②局部冷敷:对于大多数药物, 渗出后宜采用局部冷敷6 h～12 h, 但草酸铂及长春碱类药则不宜采用冷敷, 以免加重末梢神经毒性反应。③抬高患肢, 患处勿受压, 必要时可用磁疗减轻疼痛和肿胀。④保守治疗后仍持续疼痛或发生溃疡, 采取外科治疗, 早期手术可加快愈合, 避免长期疼痛。

4.3 骨髓抑制的护理

①加强全身支持治疗, 如高蛋白、高热量、高维生素饮食、药膳等。②密切监测血常规, 了解血象的变化。③预防感染, 安排病人住隔离病房, 监测体温加强探视管理, 增加病房消毒次数。④血小板降低时协助病人做好生活护理, 多休息少活动, 慢活动, 避免磕碰引起出血。

4.4 消化道症状的护理

①清淡易消化饮食, 少量多餐, 鼓励进食, 保证营养。②当有恶心感时, 做深呼吸, 分散其注意力, 如听音乐, 看电视。③化疗前按照医嘱使用止吐药, 必要时可使用镇静药辅助治疗。④出现口腔黏膜炎的病人应加强口腔护理, 用不含刺激性的漱口水漱口, 用软毛牙刷刷牙。⑤口腔溃疡者可喷喉风散, 疼痛者给予0.5%普鲁卡因含漱或喷1%丁卡因以减轻疼痛。⑥发生腹泻、便秘等症状时可对症治疗, 腹泻严重者密切观察并记录大便次数、性状, 监测水电解质, 及时止泻补液治疗。⑦若出现腹胀或肠鸣音减弱, 疑有肠梗阻发生时, 及时胃肠减压。

4.5 脱发的护理

①给予心理支持, 告诉病人脱发只是暂时现象, 治疗结束后会重新长出, 使病人消除顾虑。②指导病人进行头发护理, 不使用有刺激性的洗发水、不染发和烫发, 也不使用温度太高的吹风机吹风。③介绍病人使用假发, 尽可能纠正形象紊乱所致负性情绪。

4.6 其他

有些药物会引起体位性低血压, 如依托泊苷 (VP-16) 、替尼泊苷 (VM-26) 等。用药过程中, 病人应卧床休息或缓慢活动, 如厕要有人陪同, 以免发生意外。使用肾毒性化疗药, 嘱病人多饮水, 使尿量维持在每日2 000 mL以上, 并教会病人观察尿液的性状, 准确记录出入量, 如出现任何不适及时报告。草酸铂的神经毒性较强, 可出现感觉迟钝和感觉异常, 遇冷时加重, 所以告诉病人注意保暖, 禁止用冷水洗漱、进冷食和接触铁制品。

5 小结

细胞毒性药物因其本身的特殊性, 护理人员在使用过程中必须引起足够重视, 认真学习使用说明, 严格遵守使用要求, 合理选择输入药物的静脉, 认真观察、及时处理用药后的不良反应, 加强使用中的护理管理, 以保证治疗效果。

参考文献

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