麻疹病毒基因分型

麻疹病毒基因分型（精选七篇）

麻疹病毒基因分型 篇1

关键词：乙型肝炎病毒,基因分型,基因变异

乙型肝炎病毒(HBV)为一双链DNA病毒,主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌,其基因序列高度变异,其原因是由于HBV在复制过程中必须经过前基因组RNA(pg RNA)中间体进行逆转录,而负责逆转录DNA聚合酶缺乏校正功能[1],因此在逆转录过程中有很高的错配率。HBV变异的发生可引起乙肝病毒的生物学特征发生改变,对药物产生拮抗性,最终导致肝炎再发作。根据基因组核苷酸差异≥8%,将HBV分为A~H 8种基因型[2],其分布具有明显的地域特征。研究表明,HBV基因型与临床表现、预后判断、治疗应答均有一定关系,不同基因型具有不同的致病性,HBV基因型与肝癌发生率也存在一定的相关性[3,4]。因此,本文采用基因测序法对HBV基因分型与基因变异进行检测,以便结合临床资料更好地为病情的诊疗和判断预后提供重要依据。

1 资料与方法

1.1 病例来源

选取天津地区2009年1月~2011年1月门诊及住院乙肝患者血清标本102份。其中男性74例,女性28例;平均年龄(45.6±13.8)岁。诊断标准符合2000年第10次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[5]。

1.2 主要仪器与试剂

基因测序仪为美国AB公司的3130型测序仪;PCR扩增仪为美国AB公司的9700型PCR仪;乙型肝炎病毒P区核酸扩增检测及测序试剂由上海宝藤生物医药科技有限公司提供;Big-Dye、POP7胶由美国AB公司提供;DNA提取试剂盒由日本富士公司提供。

1.3 检测方法

1.3.1 HBV P区扩增

按照DNA提取试剂盒说明书提取HBV-DNA,利用PCR扩增引物进行PCR扩增,PCR反应体系:缓冲液2μL、d NTP 2μL、引物2μL、Taq酶0.2μL、DNA模板2μL、dd H2O 11.8μL,总反应体积为20μL。PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸45 s,12个循环并且每个循环减低0.5℃;94℃变性30 s,50℃退火40 s,72℃延伸45 s,35个循环;72℃再延伸7 min,4℃恒温。PCR扩增完毕后,取15μL PCR产物在浓度1.5%琼脂糖凝胶上电泳,判断扩增的目的条带。

1.3.2 HBV P区测序

扩增目的条带切胶,将PCR产物进行纯化。将纯化产物进行PCR测序,反应体系:纯化模板4μL,Big Dye mix 4μL,引物1μL,dd H2O 1μL。反应条件:96℃预变性1 min,96℃变性10 s,50℃退火5 s,60℃延伸4 min,25个循环,最后4℃保温。用醋酸钠-EDTA混合物及70%冰乙醇纯化后,加10μL Hi-Di Formamide溶解DNA,95℃变性4 min,置冰浴,上机测序。

1.3.3 HBV DNA基因序列分析

将HBV P区碱基序列运行DNA Star软件,与已知耐药位点进行比对,从而得到HBV针对不同的耐药突变情况。

1.3.4 HBV基因分型检测

将已检出的HBV DNA基因序列打开网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pro jects/genotyping/formpage.cgi,根据软件比对给出的得分,得分最高的既是患者HBV所属基因型。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 15.0软件包进行统计学分析,计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV变异检测结果

102例HBV患者中检出变异株84例,YIDD50例,占59.5%;YVDD 24例,占28.6%;181V 9例,占10.7%;202G 1例,占1.2%。见图1。

2.2 HBV基因分型检测结果

102例HBV患者基因分型结果显示,12份标本为B型,占11.8%;89份标本为C型,占87.3%,为本地区的优势基因型;1份标本为D型,占0.9%。基因分型图见图2。

2.3 HBV基因分型与基因变异的相关性

HBV变异类型与B、C基因型的关系结果显示,在50例发生YIDD变异的慢性乙型肝炎患者中,5例为B基因型,44例为C基因型,1例为D基因型;在24例发生YVDD变异的慢性乙型肝炎患者中,3例为B基因型,21例为C基因型;在9例发生181V变异的慢性乙型肝炎患者中,2例为B基因型,7例为C基因型。HBV B、C两基因型间HBV基因变异类型差异无统计学意义(χ2=1.025,P>0.05)。另由于D基因型、202G变异型例数较少未进行统计。见附表。

例

3 讨论

基因突变和基因分型的检测有酶切法、线性探针、light-cycler技术、聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)等多种方法,这些方法费时,繁琐,而且检测到的突变最后还需测序来确定突变的类型及突变的位置。聚合酶链反应产物直接测序法(SBT)是鉴定HBV基因变异和基因分型的金标准。ABI3130型基因测序仪采用sanger双脱氧链末端终止法,以四色荧光标记技术代替手工测序需用的同位素标记,完成测序和分析过程的自动化,测序和分析时间大为缩短,并且避免了同位素的污染。

本研究结果显示,本地区主要出现M204V/I变异,其次为A181V变异。使用拉米夫定治疗仍是本地区患者出现变异的主要因素。拉米夫定引起的YMDD突变在用药后6个月开始出现,呈逐年用药递增的趋势。用药1年时有16%~32%的患者发生耐药变异,2年时为47%~56%,3年时达69%~75%[6]。阿德福韦第1年为24%,以后逐年增加,第2~4年为3%、11%和18%,恩替卡维、替比夫定也有相继耐药的报道,且同时服用多种核苷类药物可以导致多重耐药的发生。一旦发生基因耐药就有产生临床耐药的危险性,最终引起病毒拷贝数反弹以及肝炎复发、病情恶化。因此,在慢性肝炎抗病毒治疗过程中密切监测耐药突变位点的出现已成为临床治疗的需要。

HBV基因分型与HBV病毒复制、临床演变及治疗反应相关。国外文献报道,干扰素对B基因型的疗效优于C基因型[7],亦另有报道,拉米夫定对C基因型的远期疗效明显优于B基因型[8]。本研究结果显示,本地区HBV感染者基因型多为B型和C型,以C型为优势基因型,呈现了北方地区HBV型别分布特点。研究发现,亚洲人群中B基因型患者比C基因型对INF-α的应答率高,基因型C较基因型B更易发生C基因型启动子T1762/A1764的变异。C基因型的HBe Ag阳性率和血清HBV DNA水平均高于B基因型,慢性HBV感染的HBe Ag血清转换也比B基因型迟[9];从无症状携带者至慢性肝炎、肝硬化、肝癌的不同人群中,C基因型的检出逐渐升高,B基因型则逐渐下降[10,11]。因此,基因型的检测可以为临床医生提供判断预后的依据,从而制定个体化治疗方案。

国内有关HBV基因型与YMDD变异相关性的研究很多,但结果存在一定的差异。有研究显示,B基因型的治疗反应、耐药发生率均优于C型,HBV YMDD突变株(YIDD/YVDD)多发生于基因型C型和D型,基因型A发生YMDD变异的概率较高,基因型D可能需要较长的时间出现YMDD变异,而基因型B和C与YMDD变异无关系。王义光等[12]对HBV基因型与YMDD变异关系的研究显示,HBV各基因型发生YMDD变异率差异较大,HBV的基因型虽然以B型为主,但发生耐药变异率较高的却是C型,其变异率与A、B型比较差异有统计学意义。

HBV基因分型,P区基因区序列突变的应用,有助于临床上对乙型肝炎患者的预后和转归进行正确评价,为及时合理地实施干预措施提供重要依据。

致谢:感谢天津第一中心医院提供102例样本。

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麻疹病毒基因分型 篇2

刘士敬

使用干扰治疗乙肝，是目前临床常规的治疗方案。但是，并非每个乙肝患者都适合使用干扰素治疗，应当引起医生和患者的注意。

一般来说，高度黄疸、晚期肝硬化及合并有高血压、糖尿病、肾病的乙肝患者不能使用干扰素。然而，有时一些乙肝患者从一般情况看，非常适用于干扰素治疗，例如转氨酶升高、乙肝病毒大三阳和DNA阳性，肝功能处于良好的代偿阶段，也没有乙肝家族史，可以说是理想的干扰素治疗适应症。在这种情况下，我们满怀希望地给乙肝患者使用了干扰素，但1个疗程下来，患者的疗效并不理想，令医生和患者大失所望。为什么会这样?

最新的研究成果揭开了这个谜底，原来是乙肝病毒基因在作怪。研究发现，每个国家和地区的乙肝患者身体内潜藏的乙肝病毒有着不同的基因分型，有些病毒基因型使用干扰素治疗，比较容易获得满意的治疗效果；有些病毒基因型则相反，很难取得理想的治疗效果。乙肝病毒可以分为8个基因型，分别命名为A～H。我国的乙肝患者基因分型主要为A、B、C、D四个型别，其中B和c基因型为优势基因型，分别占30％和60％。D型基因主要分布在新疆地区。不同的基因分型有着不同的临床意义，一般来说，A型基因预后较好，治疗应答率较高；B型治疗效果和预后要比C型好，C型治疗应答率最低，疗效不好，病情容易重症化，预后不良。

以普通干扰素a治疗为例，如果是B型基因的乙肝患者，治疗有效应答率为41％(即乙肝病毒DNA和e抗原转阴)；而对于c型基因的乙肝患者，有效应答率只有15％。如果使用最新的长效干扰素(聚乙二醇化干扰素)治疗不同基因型的乙肝患者，也有不同的治疗有效应答率。治疗A型基因的乙肝患者，乙肝病毒e抗原血清转换率为47％，B型基因为44％，c型基因为28％，D型基因仅为25％。

也就是说。如果我们用干扰素治疗乙肝患者前，先对患者的乙肝病毒基因分型进行一次检查，就可以预测到远期治疗效果。这是非常重要的措施，比如说一个乙肝患者经过化验检查，提示为c型基因，如果我们为其使用普通干扰素Q进行治疗，有效应答率只有15％；即便使用最新的长效干扰素治疗，有效应答率也只有28％。像这种情况，最好选择其他治疗药物和治疗方案，不要硬着头皮蛮干。使用1个疗程(半年)的普通干扰素a，要花费7000余元人民币，使用长效干扰素则需要30000余元。这是一笔不小的开支，而且极有可能是赔了夫人又折兵。所以，在决定是否使用干扰素治疗乙肝之前，最好先做一次乙肝病毒基因分型检查，作为确定治疗方案的可靠依据。

“肝炎病毒携带者”并不健康

伏新顺

按照以往的医学观点，把肝功能正常的慢性乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性者和慢性丙肝病毒抗体阳性者称为“健康携带者”。他们的血清抗原持续阳性6个月以上，没有肝炎病史和明显的症状体征，肝功能化验正常或基本正常。对这些患者往往采取观察、等待的做法，不主张用药治疗，在临床上，这类人群占相当数量。尽管大部分人可以照常生活、学习和工作，而且少数人随着机体免疫力的增强，可以发生乙肝表面抗原自然转阴。但他们并不是真正意义上的“健康人”，乙肝、丙肝病毒在肝细胞中可持续存在数年、数十年，甚至终生，并且有病毒复制和传染他人的可能。

随着医学的发展，通过肝脏穿刺病理检查，发现一部分乙肝表面抗原携带者和丙肝病毒携带者的肝组织中存在不同程度的炎症和纤维化。其中丙肝病毒携带者80％以上存在这种病理变化。因此，“健康携带者”这一名词，逐渐被“无症状慢性乙型或丙型肝炎病毒感染者(或携带者)”所取代。临床上相当一部分肝硬化病人无明显的乙肝或丙肝病史，是由“无症状肝炎病毒携带者”发展而来。他们平时的症状和体征不明显，也未注意定期复查，若干年后进行体检，或者症状、体征明显时才进行检查，此时已经发展成了肝硬化。由此可见，无论是“健康携带者”，还是“无症状肝炎病毒携带者”，他们都不健康，是介于肝炎现症病人和正常人之间的一种情况。

麻疹病毒基因分型 篇3

1 材料与方法

1.1 研究对象

2010年8月~2012年1月来我院就诊的门诊和住院乙型肝炎患者共172例,汉族,病毒载量≥1.00×104IU,男性126例,女性46例,年龄9~71岁,平均(33.24±7.73)岁。所有患者均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[3]其中:泸州:69例,宜宾:41例,自贡:24例,内江:22例,乐山:16例;患者包括的临床类型中有:无症状携带者(ASC)84例、急性乙型肝炎(AHB)11例、慢性乙型肝炎(CHB)36例、肝硬化(HC)26例、肝细胞癌(HCC)15例。

1.2 仪器

美国ABI7500fast实时荧光定量PCR仪;FYY-3型分子杂交仪;SORVALL Biofuge Primo R低温高速离心机;HB-100型恒温金属浴;AU2700全自动生化仪;河北白洋B160A离心机;TS-8型脱色摇床;XH-B型漩涡混合器;超净工作台;医用冰箱;

1.3 试剂

HBV基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.4 引物及探针设计

选取乙型肝炎病毒基因组中前S1基因的编码区为扩增靶区域,设计特异性引物及各型特异性探针,利用PCR及反向点杂交技术,检测乙型肝炎病毒B、C、D三种基因型,引物、探针序列如下:(1)A-F型共用引物序列:p1:5'-TCACCATATTCTTGGGAAC AAGA-3';S1-2:5'-CGAACCACTGAACAAATGGC-3'(P1为正义,s1-2为反义);(2)探针序列:B型探针:5'-CAGGTTGGTGAGTGACTGGAGA-3';C型探针:5'-GGTCCTAGGAATCCTGATGTTG-3';D型探针:5'-GCCAACAAGGTAGGAGCT-3'。

1.5 方法

1.5.1 HBV-DNA提取

采用浓缩后金属浴加热裂解提取法。

1.5.2 PCR扩增

取PCR反应管,分别加入处理后样品、阴阳性质控品5μL,加入PCR反应管中,于ABI 7500fast RT荧光定量PCR仪扩增仪扩增,程序:50℃3 min,93℃5 min预变性;93℃30 s、58℃40 s、72℃45 s,10个循环;93℃30 s、56℃40s、72℃45 s扩增,10个循环;93℃30 s、55℃40 s、72℃45 s扩增,25个循环,最后72℃延伸7 min。

1.5.3 杂交过程

将特异性探针包被在尼龙膜上,再利用生物素标记的引物对靶片断进行PCR扩增,PCR产物和膜条上的特异性探针杂交,靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合,未结合的PCR产物通过洗膜去除,最后进行显色和结果分析。

1.6 质量控制

膜条上探针阵列见表1。

阳性质控品:膜条上5、6和7号位点应为阳性(阳性质控品来源于HBV B型血清),其他位点应为阴性;阴性质控品:7号位点阳性,其他位点应为阴性,见表1。

注:C1、C2和C3为C型探针,D为D型探针,B为B型探针,PC为阳性位点,CC为质控位点

1.7 结果判断

若7号位点阳性,其他位点均为阴性表明,样本未检测到HBV DNA,浓度低于试剂盒的检测下限。

若6号阳性表明HBV DNA阳性,CC位点、PC位点阳性,其余位点阴性表明HBV感染,但不能具体分型。

常见结果判断如下:5、6和7号位点阳性为B型感染;1或2或3号位点阳性,6和7位点阳性为C型感染;4、6和7号位点阳性为D型感染;2、5、6和7号位点阳性为B、C混合型感染;4、5、6和7号位点阳性为B、D混合型感染。

1.8 统计学方法

计量资料用t检验,计数资料用χ2检验,数据用SPSS 18.0进行处理,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

172例HBV-DNA阳性患者HBV基因分型结果见表2。表2表明,川南地区汉族人群HBV基因型以B型和C型为主,分别占到56.98%和34.88%,其他型别基因型少见。

不同临床类型乙肝患者HBV基因型分布见表3。表3显示,急、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等肝病中,C型比例明显高于B型基因患者,差异具有显著性(P<0.05),但各型之间差异无显著性(P>0.05)。

基因型与临床指标之间关系见表4。表4表明,C型基因患者年龄、ALT、TBi L等指标明显高于B型基因患者(P<0.05),但性别、GGT、及HBV病毒载量在两基因型之间差异无显著性(P>0.05)。

注:1)与无症携带者比较,P<0.05;2)与急、慢性乙型肝炎患者比较,P>0.05;3)与肝硬化患者比较,P>0.05

注:1)与B型基因组比较,P<0.05;2)与B型基因组比较,P>0.05

3 讨论

乙型肝炎病毒基因型是HBV异质性的表现之一,到目前为止,全球发现了A-H共8种基因型,其分布存在明确的地域和人种的差异:A型主要分布于欧洲西北部、北美洲;B型和C型主要在东亚地区;E、F两型以非洲和南美最为多见;G、H两型较少,在美、德等国被发现。在我国,HBV基因型分布同样存在着较大差异,汉族人群中以B、C型两型为主,其它型别较少,而B、C两大主要型别之间,北方以C型为主,南方则以B型为优势基因。我们的实验结果显示,川南五地市(泸州、宜宾、自贡、内江、乐山)的汉族人群中,HBV基因型以B型最为多见,占到总数的56.98%,C型基因比例也较高(34.88%),B、C两型共占总数的91.86%,B/C混合型只有4.65%。此外,还有4例未能分出基因型,可能是除B、C、D以外的其它基因型,也可能是HBV-DNA载量过低、或是引物结合位点发生变异导致扩增失败,尚需进一步证实。川南地区地处我国中南部,其基因型分布与我国北方城市资料[4,5]比较,B型基因比例大幅上升,C型基因比例明显下降,而与成都等中部城市的基因型分布相似[6,7]。

人体感染HBV后可表现出不同疾病谱,即HBV被清除、HBV无症状携带状态、急慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等,越来越多的研究表明,HBV基因型与肝脏疾病的发生、发展、转归和疗效等过程密切相关[8,9]。在对不同临床类型乙肝患者分型过程中,笔者发现,在急慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等严重肝病的患者中,C型基因的检出率明显高于无症状携带者(P<0.05),与国内资料相似[1,4];在对比各基因型患者肝功能时发现,C型患者ALT、TBi L、年龄等指标均明显高于B型基因患者(P<0.05),但C型基因和B型基因患者之间的HBV病毒载量差异并无显著性(P>0.05),以上结果提示,C型较B基因更容易造成患者肝功能的严重损害。同时,也是向肝硬化、肝细胞癌等严重肝脏疾病转化的危险因素之一,这可能与C型病毒株在前C区nt1896位点更容易发生突变,使前C蛋白的翻译中断,从而不能产生HBe Ag,进而逃避机体的免疫机制有关。有文献报道[10],不同基因型患者之间存在性别差异,本实验的结果尚不支持这一结论。

综上所述,进行HBV基因分型及研究它在临床上的应用,对进一步明确乙肝的发病机制、提高检测效率、寻找治疗对策、实现流行病学控制都具有重要意义。

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麻疹病毒基因分型 篇4

关键词：已婚女性,宫颈上皮细胞,人乳头瘤病毒,基因分型,基因芯片技术

宫颈癌是威胁全世界妇女健康的重大问题,居全球女性恶性肿瘤发病率的第2位。因此,早期发现、早期诊断、早期治疗是降低宫颈癌发病率和死亡率的关键。现研究已证实,高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素[1~5]。世界卫生组织新近提出HPV感染性疾病的诊断不仅要有临床和病理学诊断,还应具有基因水平的检测才能确诊。HPV基因分型检测技术的开展,将为临床和流行病学的研究提供客观、准确、科学的依据[1~3]。现采用基因扩增及基因芯片检测技术,对2000例已婚女性宫颈上皮细胞标本进行23种常见的HPV基因检测,以了解南京地区已婚女性宫颈上皮细胞中HPV感染和基因型分布的情况,以便为宫颈癌的防治、高危人群的筛查、HPV疫苗的研发以及流行病学研究提供数据资料。同时也为我国HPV感染基因数据库的建立提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2011年4~10月江苏省南京市扬子石化集团公司的2000例已婚健康女性职工的宫颈上皮细胞标本,年龄23~56岁,平均40.1±13.2岁,其中年龄20~29岁40例,30~39岁594例,40~49岁1258例(40~44岁691例,45~49岁567例),50~59岁108例。受检者均无宫颈环切和锥切手术史。由两位经验丰富的技术人员按照说明书规范操作。

1.2 仪器与试剂

HPV基因分型检测试剂盒(由深圳亚能生物技术有限公司提供);基因扩增仪为新加坡生产的Gene Amp PCR system 2400型;分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY-3型;高速冷冻离心机为德国生产的Eppendorf 5810R型;生物安全柜为江苏省苏州市安泰空气技术有限公司生产的BHC-1300ⅡA2型;青岛海尔有限公司生产的-20℃冰箱等。显色液需新鲜配制,使用时所需浓度加蒸馏水配制。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集及保存

采用窥阴器或阴道扩张器充分暴露宫颈,用棉拭子擦去宫颈口过多的分泌物,将采样宫颈刷置于宫颈口,顺时针旋转宫颈刷4~5圈,慢慢抽出,以获得足够的宫颈上皮细胞标本,然后沿刷柄折痕处折断刷头,将宫颈刷头部放入洗脱管中,旋紧洗脱管盖,做好标本标识,保持采集管直立,放入-20℃冰箱保存待测。

1.3.2 DNA的提取

将宫颈刷头充分漂洗后,把洗脱液全部转移至1.5 ml的离心管中,随后加入裂解液50μl,充分振荡混匀,在金属浴中加热100℃10分钟,立即13000 r/min离心10分钟后,离心半径为7 cm,取中间层DNA溶液待用。

1.3.3 PCR扩增

将PCR反应管(20μl)3000 r/min离心4秒后依次编号,分别加入2μl矿物油和已提取的DNA样品、空白对照、阳性对照各5μl,反应体系总体积27μl,3000 r/min离心4秒,上机扩增。扩增条件为50℃15分钟,95℃10分钟,94℃30秒,42℃90秒,72℃30秒,共40个循环,72℃5分钟。

1.3.4 杂交、孵育和显色

取15 ml离心管,放入标有样本编号的膜条,加入5~6 ml A液(2×SSC,0.1%SDS)及所有27μl PCR产物,拧紧管盖,将离心管放入沸水浴中变性10分钟(确保A液液面完全位于沸水浴液面之下),取出并立即放入51℃杂交箱内杂交1.5小时,同时取50 ml离心管,加入50 ml B液(0.5×SSC,0.1%SDS),于杂交箱预热。取出膜条,转移至已预热的B液中,51℃轻摇洗涤5分钟,将膜条转移至孵育液(A液∶POD=2000∶1,4张膜可用6μl POD配制成12 ml孵育液),室温孵育30分钟,弃去孵育液,用A液室温轻摇洗涤2次,每次5分钟,再用C液(0.1 mol柠檬酸钠)轻摇洗涤2分钟;显色液(C液19 ml,TMB 1 ml,30%H2O22μl)中显色至少30分钟;转移至去离子水中浸泡即可观察结果。

1.4 结果判定

(1)实验后得到的每张膜条在PC位点必须出现蓝色显示信号;(2)阴性质控品除PC位点出现蓝色显色信号外其余位点均不出现蓝色显色信号;(3)阳性质控品除PC位点出现蓝色显色信号外,必须在相应HPV基因型位点上出现蓝色显色信号;(4)每张膜条上除PC位点外有23种HPV型别(6、11、16、18、31、33、35、39、42~45、51~53、56、58、59、66、68、73、MM4、83型)的杂交显色位点,除PC位点显色外,肉眼可观察23种HPV型别位点上呈现蓝色小圆点为阳性信号;(5)出现一个阳性信号为单一型别的感染,出现两个阳性信号为二重型别的混合感染,出现两个以上的阳性信号为多重型别的混合感染。

1.5 统计学分析

应用统计软件包SPSS 13.0对相关数据进行统计学处理。

2 结果

2.1 单一型别和混合型别的感染情况

2000例已婚女性宫颈上皮细胞标本中23种HPV基因分型检测检出21种HPV基因型别(除44型和MM4型外),其HPV阳性感染者205例,阴性者1795例,HPV感染率为10.25%(205/2000),其中单一型别的阳性检出率为8.80%(176/2000)。单一型别的感染中HPV43型为33例是最主要的感染型别,其阳性检出率为1.65%(33/2000);其次HPV58型为22例,其阳性检出率为1.10%(22/2000)。混合型HPV感染29例,其阳性检出率为1.45%(29/2000);其中HPV16型+X型8例及16型+X型+X型2例是混合型感染的主要型别,占混合型感染的34.48%(10/29);其次是HPV43型+X型6例,43型+X型+X型3例,占混合型感染的31.03%(9/29)。单一型别和混合型别感染出现频率前5位的HPV型别为43型42例、16型28例、58型25例、33型21例及18型18例。205例HPV阳性感染者中单一型别的HPV感染176例,二重型别的HPV感染24例,三重型别的HPV感染5例。单一型别的感染和重叠感染的比例数为6∶1。

2.2不同年龄阶段的HPV感染率

2000例已婚女性中,29岁以下的40例,HPV感染率10.00%(4/40);30~39岁的594例,HPV感染率7.24%(43/594);40~49岁的1258例,HPV感染率11.45%(144/1258),其中40~44岁的691例,HPV感染率10.85%(75/691),45~49岁的567例,HPV感染率12.17%(69/567);50岁以上的108例,HPV感染率12.96%(14/108)。

2.3 高危型HPV感染情况

所有205例HPV感染阳性的南京地区已婚女性中有160例(除6型2例、11型2例、42型8例、43型33例外)都伴有高危型HPV感染,其总感染率为8.00%(160/2000)。

3 讨论

HPV属乳头瘤病毒科,是一类特异感染人类上皮、黏膜的微小共价双链环状DNA病毒。现已发现乳头瘤病毒及HPV有二百多个型别、亚型及变异体,至今已鉴定出一百多种[1~5]。分子流行病学调查显示,高危型HPV导致宫颈癌的概率约为1.00%,而低危型HPV导致宫颈癌的概率仅为0.10%[5]。本研究选择了23种常见致癌型的HPV作为研究的感染源,采用高通量的分型检测技术对南京地区2000例已婚女性宫颈上皮细胞标本进行了23种HPV基因分型的研究,并对HPV基因感染型别的比率作一分析和总结。

由于女性在35岁以后开始进入宫颈癌的高发期,尤其近十年来宫颈癌的发病人群呈现低龄化的趋势,发病率以每年2%~3%的速度递增。临床研究发现,早期宫颈癌的治愈率可达90%以上,于是早期诊断、早期治疗对预防、治疗宫颈癌有着非常积极重要的意义[6,7]。因此,弄清我国各地区、各民族群体中HPV感染基因型分布及基因谱的流行趋势是一件非常重要而且紧迫的工作。这将为我国开发出适合本国各地区、各民族群体HPV感染的基因诊断试剂和疫苗提供非常重要的数据和资料。

本资料显示,2000例已婚女性宫颈上皮细胞标本中23种HPV基因分型检测检出21种HPV基因型别(除44型和MM4型外),其总的HPV感染率为10.25%。提示(1)我国南京地区已婚女性宫颈上皮细胞中即有单一型别的HPV感染,也有混合型别的HPV感染,以单一型别感染为主,混合型别感染为辅。(2)南京地区2000例已婚女性的自然群体中HPV总的感染率为10.25%,表明HPV在南京地区为中等以上的流行度,应密切关注其流行趋势(流行度及基因谱的变化)。(3)南京地区已婚女性宫颈上皮细胞HPV感染存在着两个高峰,一个在29岁以下,一个在50岁以上。以往已婚女性在50岁和60岁出现两个年龄段宫颈癌患病高峰,现发现较多的29岁以下宫颈癌及其癌前病变的患者。由于女性在35岁以后开始进入宫颈癌的高发期,本研究HPV感染率从30岁以上的7.24%到40岁以上的11.45%(40~44岁的10.85%,45~49岁的12.17%),再到50岁以上的12.96%,呈现出逐渐攀升的曲线,达到了50岁以上宫颈癌发病高峰期和HPV高感染期,且宫颈HPV高感染率与宫颈癌高发病率的年龄段相吻合。而29岁以下的感染率为10.00%,提示发病人群呈现低龄化的趋势。(4)本研究检出伴高危型HPV感染的160例感染者,而这些高危型别的HPV感染往往是宫颈癌前病变及宫颈癌的主要诱发因素。因此,对所有伴有高危型别HPV感染的已婚女性对其进行HPV感染型别的追踪检测就显得非常必要,如果她们成为持续性的感染者,就可成为HPV的传染源,而且宫颈癌前病变及宫颈癌发生的风险将会大大增加,应引起我们高度的重视。(5)单一型别和混合型别感染出现频率前5位的HPV型别为43型、16型、58型、33型及18型,这5种型别是南京地区已婚女性宫颈上皮细胞感染出现频率最高的类型,也是我们重点关注和监测的型别。(6)本研究发现单一型别的HPV感染除44型和MM4型外,只是数量上的增加,而混合型别的HPV感染除44型和MM4型外,不但数量上增加,而且组合型别的多样化也不断地增加,暂未发现四重型别的混合感染。由于HPV各型别之间无交叉免疫保护作用,HPV的重叠感染呈现多重化的趋势,目前,HPV的重叠感染仍以二重和三重感染为主。据报道,HPV单一型别的感染可使宫颈癌的发病风险增加19.9倍,而多重型别的HPV感染可使宫颈癌的发病风险增加31.8倍。重叠感染的HPV病毒载量高于单一型别HPV感染,癌变相关风险更大,是宫颈癌发生的一个非常重要的危险因素,并且致病力更强,病变发展更快,复发率更高[5~7]。提示体检医生及临床妇产科医生应该加强对多重型别HPV感染女性及患者的随访跟踪和监控。(7)HPV单一型别的感染和重叠感染的比例一般约为3∶1,重叠感染有多重化的趋势。本组资料中HPV单一型别的感染和重叠感染的比例约为6∶1,比一般的3∶1要高1倍,这可能和受检者均为健康体检已婚女性有关。

我院病理科已对宫颈及肛门区进行了近八年的HPV研究,正在筹建南京地区及江苏省宫颈及肛门区HPV感染的细胞和组织基因数据库。现研究表明,女性生殖道存在着一条HPV感染通道,宫颈是其通道中HPV感染率最高的部位,也就是最易感部位。虽然HPV仍然有许多问题有待继续探索,但是有关HPV致病的研究已表明高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的最主要的病因[8,9]。随着研究的不断广泛和深入,HPV的致癌机制逐渐被认识,由于各种HPV疫苗的开发和应用是现阶段研究的热点之一,所以建立对HPV流行趋势和与宫颈癌发生发展演变关系进行长期监测的数据库是一项非常紧迫的任务。因为该数据库的建立将为宫颈癌及HPV感染相关疾病的防治提供非常宝贵的分子流行病学的基础资料,更有利于政府部门对公共卫生决策的制定。又由于HPV可引起人类的许多恶性肿瘤,此类疫苗具有广阔的应用前景。随着人们对HPV致癌、致瘤机制日益深入的研究,将有助于预防性和治疗性多价疫苗的成功开发和应用,可逐渐减少宫颈癌及其他癌对人类健康的威胁,而宫颈癌很可能会成为人类第一个可进行有效预防的恶性肿瘤,这将造福于广大的女性。

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麻疹病毒基因分型 篇5

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2011年7月-2012年6月浙江余杭第二人民医院儿科住院部5岁以下腹泻患儿,均符合以下临床诊断标准[3]。

1.2 纳入方法

腹泻患儿均到肠道门诊就诊,小于5岁患儿先登记门诊登记表,需住院治疗患儿收入我院儿科住院部。入院后由儿科医生填写个案调查表。每个病人收集新鲜粪便标本1~2ml,置于特制容器内,存放在-20℃的冰箱中低温保存,分批检测。同时静脉抽血分离血清冷冻保存。

1.3 腹泻病情判断标准

根据Vesikari提出的20点评分法对不同RV-P血清型的腹泻患儿病情严重程度进行评分。脱水程度根据中国腹泻病诊断治疗方案[4]中腹泻患者脱水状况评估办法进行分类。

1.4 实验室方法

1.4.1 A组轮状病毒抗原检测

用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immune-absorbent Assay,ELISA)检测轮状病毒抗原。

1.4.2血生化实验室指标检测

患儿入院后2小时内行静脉抽血分离血清后在本院临床检验中心行电解质、肝功、心肌酶谱等生化指标检查。

1.4.3 A组轮状病毒P基因型的鉴定

利用多重集式RT-PCR法进行P基因型鉴定。

1.5 统计学方法

结果以均数±标准差表示,并采用卡方检验以及t检验等方法进行组间比较,以P<0.05为差异具有统计学意义,全部分析过程利用SAS9.1统计软件完成。

2 结果

2.1 A组轮状病毒腹泻患儿一般情况

本研究共纳入腹泻患儿211例,平均月龄为(11.3±3.7)月,大便标本中ELISA法检测出RV阳性标本为137份,检出率为64.9%。

2.2 A组轮状病毒P血清型鉴定结果及临床特点分析

2.2.1 P血清型鉴定结果分析

本研究共鉴定了RV感染患儿大便样本137例,共检出P[4]型83株,分型结果见表1。

2.2.2不同P血清型患儿腹泻临床分度比较

本课题收集到的P[4]血清型患儿与P[8]血清型患儿腹泻临床严重度进行比较,发现P[4]血清型患儿Vesikari评分、重度腹泻人数、重度脱水人数、呕吐人数、发热人数以及发热持续时间与P[8]血清型患儿比较均无显著差异(P>0.05);但是其腹泻病程和呕吐持续时间则显著长于后者(P<0.05),见表2。

*与P[4]组比较无显著差异(P>0.05)。#与P[4]组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.3不同P血清型患儿腹泻胃肠外临床合并症比较

本研究数据显示,P[4]血清型患儿与P[8]血清型患儿比较,其上/下呼吸道感染、高热惊厥以及电解质紊乱的发生人数均无显著差异(P>0.05);但是发生心肌损害和肝功损害的患儿人数则显著高于P[8]血清型(P<0.05),见表3。

*与P[4]组比较无显著差异(P>0.05)。#与P[4]组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.4不同P血清型患儿主要血生化指标比较

本研究数据显示,P[4]血清型患儿的谷丙转氨酶和磷酸肌酸激酶同工酶MB显著高于P[8]血清型患儿外(P<0.05),谷草转氨酶、乳酸脱氢酶以及磷酸肌酸激酶等均无显著差异(P>0.05),见表4。

(均数±标准差,单位IU/L)

*与P[4]组比较无显著差异P>0.05;#与P[4]组比较,差异有统计学意义P<0.05。

3 讨论

3.1 轮状病毒肠炎P血清型分子流行病学特征

P型在各洲的分布较G型简单[5],国内大多数地区报告结果比较类似,主要仍以P[8]型和P[4]型为主,而其中P[8]型则为主要的优势基因型[6,7,8,9],少数地区则以P[4]型为主。我们的研究显示,杭州余杭地区儿童RV肠炎,以P[4]型为主,占RV阳性标本的60.6%,为本地区的优势基因型;其次为P[8]型,占29.9%。提示本地区疫苗的研究P血清型仍应该以P[4]和P[8]型为主。

3.2 轮状病毒肠炎P血清型临床特征

P[4]和P[8]血清型儿童临床特征比较国内仅有一篇文章报道[10],该研究发现P[4]型患儿的腹泻天数中位数高于P[8]型,而P[8]型患儿的每天呕吐最高次数高于P[4]型,提示两种血清型的临床表现有所差异。值得注意的是,本研究数据还显示P[4]型儿童发生心肌损害和肝功损害的危险性显著高于P[8]型儿童。

摘要：目的:了解杭州余杭地区轮状病毒VP4基因型与轮状病毒肠炎肠道外损伤关系。方法:收集2011年7月-2012年6月杭州市余杭区第二人民医院5岁以下住院腹泻儿童粪便标本进行轮状病毒检测和P血清型分型,同时监测肝功、电解质、心肌酶谱等。结果:共收RV阳性标本137份,其中检出P[4]型83株,P[8]型41株。P[4]血清型患儿腹泻病程和呕吐持续时间显著长于P[8]血清型患儿(P<0.05);P[4]血清型患儿心肌损害和肝功损害的患病率以及谷丙转氨酶和磷酸肌酸激酶同工酶MB水平均显著高于P[8]血清型患儿(P<0.05)。结论:该地区轮状病毒肠炎RV VP4(P)血清型以P[4]和P[8]血清型为主,且P[4]型患儿临床表现较P[8]型患儿重。

关键词：轮状病毒,VP4血清型,婴幼儿,腹泻

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麻疹病毒基因分型 篇6

1 材料和方法

1.1 材料

MV Leningrad-4病毒株由浙江省疾病预防控制中心病毒所保存;病毒RNA提取采用德国QIAGEN公司试剂;Titan One Tube RT-PCR System一步法RT-PCR试剂盒购自Roche公司;胶回收试剂盒购自Qiagen公司;IPTG、X-gal和pGEM-Teasy载体购自Promega公司;内切酶Bam HⅠ和HindⅢ购自Ta Ka Ra公司;质粒DNA提取试剂盒购自申能博采公司;原核表达质粒载体pET28a (+) 、感受态大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 购自北京鼎国生物技术公司并保存于-80℃;His Link蛋白质纯化树脂购自Promega公司;四甲基联苯胺 (TMB) 购自上海泽衡生物技术公司;过氧化物酶标记的兔抗人Ig G购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 主要实验仪器

1.Allegra誖25R低温高速离心机美国Beckman公司

2.Eppendorf Mastercycler gradient梯度PCR仪Eppendorf Company

3.Bio-Rad凝胶成像系统

4.超声波破碎仪宁波新芝JY92型

5.Bio-Rad垂直电泳仪MiniRun GE-100

6.MuLtiskan MK3酶标仪Thermo Electron Company

1.3 方法

1.3.1 麻疹L4株病毒的培养

Vero/Slam细胞[3]由浙江省疾病预防控制中心病毒所提供, 在接种麻疹L4株病毒一般2-5d发生CPE后将细胞管置-80℃冻存, 以备核酸提取。

1.3.2 MV-H基因的扩增

按照QIAGEN试剂盒抽提MV基因组RNA, 总RNA溶于50μl DEPC-ddH2O中。利用SignalP 3.0在线软件对信号肽和跨膜区进行预测, 根据预测结果设计引物序列如下:Mv HF-GGATCCAGACTTCATCGGGCAGCCATC;MVHR-AAGC TTTTATCTGCGATTGGTTCCATCTTCC, 由上海英骏生物工程公司合成, 下划线标记序列为Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点。按照Titan One Tube RT-PCR System一步法RT-PCR试剂盒要求扩增MV-H基因, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查有无特异性条带。

1.3.3 重组血凝素基因载体的构建

在紫外下将电泳分离的特异性条带切出, 用QIAGEN胶回收试剂盒纯化PCR产物。将纯化的H基因扩增产物与pGEM-Teasy载体在T4 DNA连接酶的作用下, 24℃水浴1h。将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀, 冰浴30min后, 42℃水浴热击90s, 再冰浴2min, 然后加入900μL LB培养基, 于180r/min 37℃摇床振摇1h。将转化后的菌液200μL均匀涂布于含100μg/m L氨苄青霉素和适量IPTG、X-gal的固体LB培养基平板表面, 在37℃孵箱倒置培养过夜, 然后挑选白色单菌落, 在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中振荡培养, 培养产物用试剂盒提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用Bam HⅠ和HindⅢ内切酶进行双酶切, 电泳观察有无目的条带。对酶切鉴定正确的阳性克隆用T7和SP6引物进一步测序鉴定, 测序由上海英骏生物工程公司完成。

1.3.4 原核表达载体的构建与鉴定

将测序正确质粒DNA的Bam HⅠ和HindⅢ酶切产物与同样双酶切的原核表达载体pET-28a在T4 DNA连接酶的作用下, 24℃水浴1 h。将连接产物按前述方法转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞。转化产物涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板, 37℃孵箱倒置培养过夜, 挑选单菌落, 在含卡那霉素的液体LB培养基中振荡培养, 培养产物用试剂盒提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用BamHⅠ和HindⅢ内切酶进行双酶切鉴定正确的阳性克隆。

1.3.5 重组血凝素蛋白的表达

将鉴定正确的菌株接种于液体LB培养基中37℃过夜培养, 吸取1ml培养液加入100ml新鲜LB中扩增3h后, 加入IPTG (终浓度为1mmol/L) 诱导表达4h。将得到的菌液离心沉淀, 用PBS洗涤。经PBS溶解后, 冰上超声波破碎菌体, 5s 10次, 每次间隔10s。配制SDS-PAGE凝胶, 浓缩胶浓度为5%, 分离胶浓度为10%, 将大肠杆菌破碎产物与加样缓冲液混合后100℃水浴5min, 进行蛋白凝胶电泳验证表达产物。

1.3.6 重组血凝素蛋白的纯化

将离心收集的菌体加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer (20mM Tris-HCl p H7.9, 0.5M Na Cl, 10%Glycerol, 6M Guanidium HCl) 和PMSF, 将细胞悬浮起来并冰上超声破碎细胞。将超声波破碎的大肠杆菌液体离心, 2ml HisLink蛋白质纯化树脂装柱, 用10 ml NTA-0缓冲液平衡后加入离心后的上清液, 用10 ml NTA-20 (GuNTA-0中含20mM Imidazole) 冲洗层析柱, 2 ml NTA-500 (GuNTA-0中含500mM Imidazole) 洗脱目的蛋白。将洗脱液加入透析袋中, 用PBS 4℃过夜透析。

1.3.7 酶联免疫吸附检测

将纯化的血凝素蛋白和对照蛋白 (pET-28a空载体经IPTG诱导后纯化蛋白) 用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被ELISA多孔板并于4℃过夜, 实验孔和对照孔各6个, 另外设置一孔作为空白对照。用含Tween-20的PBS洗涤3次, 每次洗涤后拍干孔中液体。用2%小牛血清封闭多孔板后同上再洗涤3次。将稀释后的麻疹Ig G阳性血清与未感染血清对照分别加于多孔板中, 37℃湿盒中孵育30min, 洗涤3次后加入过氧化物酶标记的兔抗人Ig G (HRP-Rabbit anti human Ig G) , 37℃湿盒中孵育30 min, 洗涤3次后加入TMB和H2O2溶液, 37℃避光反应10min, 加入2mol/L H2SO4终止反应, 用酶标仪检测405nm吸收值。

2 结果

2.1 麻疹L4株病毒的培养和病毒R NA提取

正常生长的Vero/Slam贴壁细胞接种麻疹L4株病毒后, 37℃、5%CO2维持培养, 接种后4d发生CPE后将细胞悬浮后分装于冻存管中-80℃保存。核酸提取时, 在Ⅱ级生物安全柜中取200μl病毒液, 加入β-巯基乙醇和RLT裂解病毒颗粒, 再按照试剂盒要求去除杂质并洗脱于50μl DEPC-dd H2O中, 作为RT-PCR反应的模板。

2.2 麻疹血凝素蛋白信号肽和跨膜区的预测

由于信号肽和蛋白跨膜区的存在通常对大肠杆菌表达外源蛋白不利, 所以本实验首先对麻疹血凝素蛋白的信号肽和跨膜区进行了预测。通过SignalP 3.0对血凝素617个氨基酸全序列的分析, 其信号肽和跨膜区集中于血凝素蛋白N端的1~58位氨基酸中。

2.3 MV血凝素蛋白基因 (H) 获得

以MV (L4株) 病毒基因组RNA为模板, RT-PCR扩增MV-H基因片段。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 通过与标准的DL 2000 DNA Marker比较, RT-PCR产物的大小约为1 700 bp, 与预期扩增基因片段的长度相符。扩增产物特异性好, 未见其他杂带。扩增产物用胶回收试剂盒纯化, 纯化后的H基因与p GEM-Teasy载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 培养后挑选白色单菌落, 提取质粒DNA后用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切, 电泳时除有一条分子量较大的pGEM-Teasy载体条带外, 还有一条大小约为1 700 bp的条带, 说明MV-H基因已克隆至T载体。MV-H基因是通过基因组RNA抽提以及RT-PCR扩增的方法获得的, 由于逆转录及PCR过程可能会出现的错配, 对鉴定正确的阳性克隆用T7和SP6引物进一步测序, 将双向测序的结果拼接, 编码序列中无插入与缺失突变, 与麻疹Leningrad-4株血凝素基因同源性为99.8%。测序结果表明成功地扩增了麻疹血凝素基因并构建了重组血凝素基因的质粒。

2.4 大肠杆菌原核表达载体的构建与重组蛋白表达

BamHⅠ和HindⅢ酶切测序正确质粒DNA并与同样双酶切的载体pET-28a进行连接并转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 原核表达载体的构建示意图 (图1) 。挑取单菌落在含卡那霉素的液体LB培养基中振荡培养后吸取培养液转接到新鲜LB中, 3h后, 加入IPTG (终浓度为1 mmol/L) 诱导表达4 h。同时用未克隆麻疹H基因的p ET-28a进行同样诱导以作为对照, 但即使延长IPTG的诱导时间, 也未能明显增加表达量。经PBS溶解并在冰上超声波破碎后, 菌液基本澄清。沸水浴变性后的菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳, 通过与10 kD标准蛋白Ladder比较, 在66 kD处有表达的重组血凝素蛋白条带, 与预计表达的融合蛋白相符。

2.5 重组蛋白的纯化

将盐酸胍变性后超声波破碎的大肠杆菌液体离心, 2 ml His Link蛋白质纯化树脂装柱, 用10 ml NTA-0缓冲液平衡后加入离心后的上清液, 用10 ml NTA-20冲洗层析柱, 此时大部分与镍柱非特异性结合的大肠杆菌菌体蛋白被洗脱下来, 用2 ml NTA-500洗脱时, 与镍柱螯合的重组血凝素蛋白被洗脱, 将收集的洗脱液加入透析袋中, 用PBS 4℃过夜透析以去除咪唑和其他高盐成分, 透析复性后的重组蛋白于-20℃保存。

2.6 利用重组血凝素蛋白检测Ig G的ELISA方法建立

4℃过夜包被后的ELISA多孔板洗涤、封闭后, 加入50倍稀释的麻疹Ig G阳性血清与未感染血清作为对照, 37℃抗原抗体反应后洗涤, 加入酶标抗体 (HRP-Rabbit anti human Ig G) 使结合于固相的人抗麻疹Ig G与酶标二抗继续反应, 洗涤去除未结合的酶标二抗后加入底物四甲基联苯胺 (TMB) 和H2O2溶液, 37℃避光反应10 min, 此时阳性反应孔变为蓝色, 加入2 mol/L H2SO4终止反应后阳性反应孔变为黄色, 酶标仪检测空白孔405 nm吸收值为0.05, 对照孔阳性和阴性血清平均OD值分别为0.08和0.064;实验孔阳性和阴性血清平均OD值分别为0.760和0.09。ELISA结果说明表达的血凝素蛋白具有抗原性, 可以与人麻疹Ig G抗体发生特异性反应。

3 讨论

本实验采用Roche一步法RT-PCR[4、5], 该试剂盒中采用Taq和Tgo DNA聚合酶, 因为Tgo DNA聚合酶具有校对功能, 是一种高保真聚合酶, 所以在保证了扩增效率的同时也增加了扩增产物的保真性, 有利于下一步基因表达工作。测序结果证实了扩增产物的忠实性, 也证实了扩增产物与麻疹Leningrad-4病毒株血凝素基因同源性极高。

自从70年代分子克隆技术建立以来, 在大肠杆菌中表达外源基因[6]已成为生物化学、细胞生物学以及蛋白质结构研究中的一个重要技术, 虽然它不能像真核系统一样进行翻译后加工, 但由于其遗传背景相对清楚、操作简便、周期短等而成为使用最为广泛的外源蛋白表达系统。利用该技术可以方便地得到一些从自然界中难以得到甚至不能纯化的蛋白质。pET系统[7]是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。本实验中, 麻疹血凝素基因被克隆到p ET-28a质粒载体上, 受噬菌体T7强转录及翻译信号控制, 在非诱导条件下, 目的基因完全处于沉默状态而不转录, 通过在细菌培养基中加入IPTG可以启动外源蛋白的表达。表达的重组血凝素蛋白在其N端融合有一个6×His的组氨酸标签 (His·Tag) , His·Tag是最常用的纯化蛋白的融合标签, 特别是那些以包涵体形式表达的蛋白, 可以将蛋白在完全变性条件下溶解, 继而进行亲和纯化。

近几年, 浙江省麻疹发病率较高, 非常有必要对人群麻疹抗体水平进行监测, 以掌握人群免疫背景数据, 为提高免疫接种率、防控麻疹暴发提供依据。本实验建立的利用重组血凝素蛋白检测Ig G的ELISA方法为快速、廉价地进行人群Ig G抗体水平监测提供了一条新的途径。

本研究获得的重组质粒p ET28a-Mv H能够在大肠杆菌中表达融合蛋白以降低麻疹血凝素蛋白抗原的生产成本。根据外源蛋白的性质以及表达载体的特点还可以在培养液成分、温度、诱导与培养时间等表达条件上进行优化, 以期增加重组蛋白表达量, 为建立更为廉价的临床检测和研制血凝素蛋白亚单位疫苗奠定基础。

参考文献

[1]谢正德, 申昆玲.麻疹病毒感染的研究现状[J].国外医学儿科学分册, 2002.3 (2) :91-93.

[2]杨月峰, 骆东辉, 贾红宇, 等.麻疹病毒Edmonston疫苗株血凝素基因克隆及表达[J].中国感染控制杂志, 2005, 4 (2) :101-104.

[3]刘冷, 郑焕英.Vero/Slam细胞在麻疹病毒分离中的应用[J].中国计划免疫杂志, 2006, 12 (5) :353-356.

[4]陈伟红, 刘卫民.用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白 (H) 基因[J].中国公共卫生杂志, 2003, 19 (1) :49-50.

[5]卢亦愚, 严菊英, 冯燕, 等.实时荧光定量PCR技术快速检测麻疹病毒核酸的研究[J].浙江预防医学杂志, 2004, 16 (11) :1-2, 7.

[6]廖美德, 谢秋玲, 林剑, 等.外源基因在大肠杆菌中的高效表达[J].生命科学杂志, 2002, 14 (5) :284-287.

麻疹病毒基因分型 篇7

随着HPV与宫颈癌关系的明确,全球宫颈癌的防治研究出现了重要的两大突破:一方面,高危型HPV检测成为宫颈癌初筛的最佳手段[5];另一方面,HPV预防性疫苗的诞生使得宫颈癌的预防成为可能[6]。新疆部分地区文化水平落后,生活条件差,早婚早孕多产,故宫颈癌发病率明显高于全国[7]。但目前以较大城市为人群基础的HPV感染状况调查资料仍然较少。本研究采用HPV基因分型检测试剂盒,利用导流杂交技术检测新疆乌鲁木齐新市区人群HPV感染情况、型别分布,包括与年龄相关的HPV型别、与宫颈病变的相关性分析。为确定适合新疆地区的宫颈癌筛查方案及积极推进HPV疫苗的开发奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2013年1月~2014年1月采用机会抽样方法选择新疆乌鲁木齐市新市区19~69岁有性生活史的智力正常的女性作为研究对象,纳入研究对象共1989名,平均年龄为(35.4±7.3)岁。汉族1044名,维吾尔族945名。所有对象均为智力正常的非月经期妇女,检查前3 d内没有阴道用药及24 h内无性生活。所有研究对象均为自愿接受宫颈癌筛查。合格对象签署知情同意书。

排除标准:(1)急性生殖道炎症及妊娠的妇女;(2)既往宫颈上皮内瘤变病史、接受过治疗;(3)近期阴道用药及用过激素类药物。

1.2 方法

1.2.1 取样步骤与要求

先用棉拭子将阴道或子宫颈口过多的分泌物擦拭干净,再用宫颈刷紧贴子宫颈口稍用力顺时针旋转5圈,然后放入专用细胞保存液的试管中。以上标本于4℃保存,1周内测定。

1.2.2 宫颈液基细胞学检查方法(TCT)

TCT诊断标准采用2001年TBS(the 2001 Bethesda system)分级系统进行细胞学诊断[8]。

1.2.3 HPV分型检测

使用凯普HPV 21分型检测试剂盒,以组织病理学诊断结果为最终确诊结果。

1.3 统计学方法

所有原始数据均需反复核对,录入后复查。所有数据经SPSS 17.0统计软件进行处理,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新疆乌鲁木齐市新市区妇女生殖道感染HPV基因型分布情况

1989名妇女HPV总阳性率为27.95%(556/1989),单一感染435例,多重感染121例。高危型HPV感染率为19.36%(385/1989),低危型HPV感染率为2.51%(50/1989),高危型HPV阳性人群中以16、18、58和56亚型HPV阳性者最多,占高危型HPV阳性者总数的百分比依次为45.71%(172/385)、17.14%(66/385)、11.69%(45/385)和6.23%(24/385),4种型别占高危型阳性人数的百分比为79.74%。见表1。

注:HPV:人乳头瘤状病毒

2.2 新疆乌鲁木齐市新市区妇女不同年龄段HPV亚型感染情况

将1989名妇女按年龄分组,分为≤30岁、>30~40岁、>40~50岁、>50岁4个年龄段。各年龄段患者HPV、高危型HPV(HR-HPV)感染情况及多重HPV感染情况见表2。各年龄段HPV检出率分别是21.98%、38.47%、24.27%、12.44%。经检验≤30岁、>30~40岁、>40~50岁及>50岁以上四组的HPV阳性率差异有高度统计学意义(χ2=77.57,P<0.01),>30~40岁年龄组HPV感染率明显高于≤30岁、>40~50岁及>50岁组,统计学比较差异有统计学意义(χ2=30.21,P<0.01;χ2=34.73,P<0.01;χ2=48.70,P<0.01)。而≤30岁、>40~50岁的患者HPV感染率比较差异无统计学意义(χ2=0.49,P>0.05),这两组HPV感染率均高于>50岁以上人群,差异均有统计学意义(χ2=7.79,P<0.05,χ2=12.14,P<0.05)。>40~50岁年龄段患者感染HR-HPV的构成比最高,差异有高度统计学意义(χ2=16.65,P<0.01)。4个年龄段患者感染HPV多重感染率差异无统计学意义(χ2=3.46,P>0.05)。

注:HR-HPV:高危型人乳头瘤状病毒

2.3 新疆乌鲁木齐市新市区妇女不同程度宫颈病变HPV亚型感染情况

556例HPV阳性患者中,宫颈正常/炎症组313例,ASCUS/LSIL组217例,HSIL/宫颈癌组26例。ASCUS/LSIL组高危HPV感染率为49.77%,HSIL/宫颈癌组的高危HPV感染率为100%,两组比较,差异有高度统计学意义(χ2=23.68,P<0.01)。正常或宫颈炎前3位HPV基因型依次为HPV-16、18、58;AS-CUS/LSIL前3位HPV基因型依次为HPV-16、31、58;HSIL/宫颈癌组前3位HPV基因型依次为HPV-16、18、58。HSIL/宫颈癌组的HPV-16感染率高于ASCUS/LSIL组,差异有统计学意义(χ2=5.00,P<0.05)。其他各型的检出率与宫颈病变严重程度均不相关(P>0.05)。ASCUS/LSIL组多重HPV感染率为30.87%,HSIL/宫颈癌组的多重HPV感染率为3.84%,两组比较差异无统计学意义(χ2=0.557,P>0.05)。见表3。

注:ASCUS/LSIL:非典型鳞状上皮细胞/低度鳞状上皮内病变;HSIL:高度鳞状上皮内病变

3 讨论

宫颈癌是可以预防及治愈的癌症,宫颈癌前病变的早期筛查及早期干预是有效降低宫颈癌发病率的重要措施[9]。1943年Papanicoaou提出的宫颈巴氏涂片五级分类法不足之处是假阴性率及误诊率过高[10]。1988年50位病理学家在美国马里兰州Bethesda城召开会议提出采用描述性诊断报告,1991年修改,2001年再次讨论并推出2001 TBS诊断法。目前我国广泛采用薄层液基细胞涂片进行宫颈癌的筛查[11]。

2005年,HPV检测被推荐作为子宫颈癌筛查手段[12]。研究HPV区域流行情况、感染特点及其与子宫颈病变的关系,对于HPV临床数据长期监控、疫苗研发及子宫颈癌防治相关政策制订有重大意义。

3.1 乌鲁木齐市新市区女性HPV感染率及亚型分布特征

HPV感染因地理位置及种族的不同,型别感染有明显的差异[13]。本次调查结果显示,新疆城市新市区HPV感染率为27.95%。周艳秋等[14]研究报道筛查人群中HPV感染率为14%~28%。新疆是我国宫颈癌高发地区,可能与新疆女性人群HPV感染逐年升高有关。HPV的感染可能受多因素的影响,除了种族因素,地域因素、经济、社会、收入等因素也可能产生重要的作用。

HPV感染亚型通常呈现地域性差异,比如中国人群感染率较高的HPV-52和HPV-58,在欧洲、美国和非洲国家则属于低感染亚型[15,16]。在我国HPV-16、18占据了所有亚型的69.9%[17,18]。本次研究发现HPV-16及HPV-18仍然是新疆乌鲁木齐市女性感染的常见类型,与上述文献结论一致。但同时发现HPV-58及56亚型阳性率较高,可能与新疆独特的生活背景及地域存在一定的关系。仅仅针对HPV-16及18的疫苗能否预防新疆大部分人群的感染,仍待考察,对于HPV-58及56的感染仍然不能忽视,这在新疆疫苗的制备上仍然有特殊及重大的意义。

3.2 新疆乌鲁木齐市女性HPV感染的年龄特征

HPV感染在年龄的分布上有一定的规律及差异。有研究发现,通常在青春期有较大比例的感染,在中年时期出现高峰,不同的地区随年龄的变化感染率不同[19]。本研究结果中,不同年龄段的HPV阳性率差异显著,>30~50岁年龄组HPV感染率明显高于其余各年龄组,各组的多重感染率相比无显著区别。可能由于该年龄段妇女处于性生活活跃期,且此阶段的女性容易出现再婚及多个性伴侣等情况,极易导致HPV感染率上升。新疆乌鲁木齐市女性HPV感染的年龄出现的单峰分布具体原因,还需扩大研究人群进一步进行论证。

3.3 HPV与新疆乌鲁木齐市新市区女性宫颈病变的关系

本研究结果显示,HSIL/宫颈癌组高危HPV感染率较ASCUS/LSIL组高。高危HPV基因亚型感染与宫颈病变的关系即随着宫颈病变级别的升高,高危型HPV亚型感染阳性率增加;在乌鲁木齐市新市区女性宫颈病变中常见的高危HPV基因亚型依次是HPV-16、18、58。目前临床上对于多个基因型的HPV同时感染可使宫颈病变程度增加仍存在着较大争议。HSIL/宫颈癌组患者两种以上HPV亚型感染率低于其他两组,多重感染率随着宫颈病变的级别增高并未出现上升趋势,此结果与Munoz等[20]的研究结果相同,与Smith等[19]的研究结果不同。这与不同地域及不同种族的多重感染率不同有关,所以HPV多重感染促进宫颈癌的发展及病变进展的机制可能较为复杂,尚需多地区、大样本的调查才能得出一定的结论。