致病性试验（精选十篇）
致病性试验 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
从盐城地区临诊上有典型鹅大肠杆菌病变的病、死母鹅221只, 发病公鹅83只, 鹅炕坊死胚蛋356枚中分离。经革兰氏染色镜检、生化鉴定为大肠杆菌共256株, 鉴定其O血清型。选用其中分布于不同地区、具有不同代表血清型的51株鹅大肠杆菌分离株做致病性试验。
1.1.2 培养基
营养肉汤参照文献配制 (牛肉浸膏5g, 蛋白胨10g, 氯化钠3g, 水1000mL, pH值为7.6) 。
1.1.3 1日龄健康公鹅320只, 来自建湖大南庄东兴炕坊。
1.2 致病性试验
用定型的51株鹅大肠杆菌作致病性试验。用312只1日龄公鹅随机分为52组, 每组6只, 用上述51株细菌的24h静置肉汤培养物 (每mL约含菌量108CFU) 0.1mL进行气管内注射, 剩余一组注射肉汤作对照。每天上、下午各记录一次鹅的死亡数, 病变情况, 并以心血作细菌分离鉴定, 直到第6d为止。扑杀活鹅, 观察病变, 并作细菌分离鉴定。根据鹅的死亡数和病变程度确定分离株的致病性:50%以上的接种鹅死亡或产生严重病变 (心包炎、肝周炎、气囊炎、肝坏死等) 为高致病株;接种鹅死亡、产生严重病变者不超过50%为中度致病株;接种鹅不死亡、仅在气囊中产生病变的为低致病株。
2 结果
2.1 所测51个鹅大肠杆菌分离株对1日龄公鹅均有致病性
其中35株为高致病株, 占受试菌株的68.6%;11株为中度致病株, 占受试菌株的21.6%;5株为低致病株, 占受试株菌的9.8%。不同血清型菌株的致病性无明显差异。高致病性分离株引起接种1日龄公鹅死亡高峰在36~48h多在3~4只, 病死鹅眼观病主要是心包积液, 气囊混浊和肝脏肿大、淤血, 典型病变出现在接种48h后的死亡鹅, 可见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊上可见多量干酪样渗出物。病程越长病变越典型。对照组鹅均健活, 6日龄扑杀时未见任何肉眼变化, 心肝等处也未分离到细菌。 (见表1)
2.2 不同地区鹅大肠杆菌分离株的致病性无明显差异。 (见表2)
3 讨论
3.1 用1日龄公鹅气管接种来测试51个鹅源大肠杆菌分离株的致病性
对1日龄鹅高度致病者占68.6%, 中度致病者占21.6%。低度致病者占9.8%。据此我们认为所获得的鹅源大肠杆菌分离株均具有不同程度的致病性, 且其中大多数分离株属高、中度致病株 (90.2%) 。
3.2 3个优势血清型分离株
对1日龄鹅高度致病者占77.8%, 中度致病者占16.7%。低度致病者占5.5%。表明我们所分离到的优势血清型分离株均有致病性, 其中94.5%的分离株属高、中度致病株。
3.3 致病性试验
受试分离株来自10个县 (市、区) , 覆盖了21个血清型, 但它们的致病性并无明显差异。表明分离株的致病性并不受地区、血清型的影响。同时说明, 盐城地区的鹅大肠杆菌病比较更复杂。多致病性血清型的存在, 给防制工作增加了难度, 优势血清型的出现, 又为最大限度地控制该病提供了条件。
3.4 试验表明
本研究中我们以1日龄雏鹅作为大肠杆菌致病性试验的实验动物, 试验表明大肠杆菌分离株高、中、低度致病性的差异在实验鹅中表现明显。多数高致病株能引起接种鹅较高死亡率 (致死比例常为3/6~4/6) ;中度致病株可引起较低死亡率 (致死比例常为0/6~2/6) ;而低致病株则不引起死亡。结合死亡鹅及扑杀病鹅的病变程度, 很容易判断其致病性的高低。因而, 1日龄雏鹅与鸡一样可用于大肠杆菌的致病性测定。
3.5 鹅大肠杆菌
鹅大肠杆菌分离株致病性的研究为制定鹅大肠杆菌病的特异性防治措施奠定了基础。
摘要：从盐城地区临诊上有典型鹅大肠杆菌病变的病、死鹅和鹅炕坊的死胚蛋中分离培养出256株大肠杆菌。为了解这些鹅大肠杆菌的致病性情况, 用不同地区、不同血清型的51株分离株做致病性试验。所测分离株对1日龄鹅均有致病性。3个优势血清型分离株中, 对1日龄鹅高度致病者占77.8%, 中度致病者占16.7%。低度致病者占5.5%。试验表明我们所获得的大肠杆菌分离株均为致病性。
关键词：鹅,大肠杆菌,致病性试验
参考文献
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高致病性禽流感应急预案 篇2
为确保在发生高致病性禽流感疫情时，能够及时、高效、有序进行应急处理，最大限度地减轻疫情造成的危害，保障人民群众身体健康和社会的安定团结，保障畜牧业健康有序地发展，根据《中华人民共和国动物防疫法》、《全国高致病性禽流感应急预案》和《★★地区高致病性禽流感应急预案》精神，结合我县实际情况，特制定本预案。
一、应急指挥系统
(一)成立★★防治高致病性禽流感工作领导小组，由县人民政府县长扎西塔杰任组长，以分管农牧副县长吾金才塔为副组长，农牧局、财政局、民政局、交通局、公安局、林业局、卫生局、政府办等有关单位负责同志为成员。领导小组办公室设在农牧局并负责日常工作。
(二)各部门的职责
1、领导小组
制定高致病性禽流感防治的重大政策；组织协调和部署全县高致病性禽流感防治工作；指挥扑灭高致病性禽流感疫情；监督管理全县高致病性禽流感的防治工作，并按照国家、自治区的有关规定上报疫情。
本辖区高致病性禽流感防治应急工作，是在高致病性禽流感防治工作领导小组的指导下进行。县财政局负责落实防治经费以及疫情应急控制所需经费；县农牧局负责组织制定我县高致病性禽流感防治应急预案，做好应急的物资储备。如县域内发生高致病性禽流感时，县人民政府负责发布封锁令，实施应急措施，组织有关部门和单位及时控制、扑灭疫情。
2、领导小组办公室
负责办理领导小组部署的各项高致病性禽流感防治工作，及时收集掌握本县内候鸟及家禽疫病发生情况；并及时调配疫情处理和损失的补贴经费及物资；组织、协调、监督好各部门落实本预案的情况；提出启动、停止(解除)高致病性禽流感疫情的控制应急措施建议：
⑴负责落实禽流感的综合性预防措施；
⑵具体协调、指挥有关部门和单位参加疫情的控制以及扑灭工作；
⑶对疫情做出全面分析，并制定疫情控制和扑灭的技术方案；
⑷规定疫点、疫区和受威胁区，提出封锁建议并参与组织实施；
⑸监督、指导对疫点内禽类的捕杀、死禽和禽产品的无害化处理，疫区(点)内的污染物实行消毒和无害化处理、饲养场所及周围环境的消毒工作；
⑹组织对受威胁区内的易感禽类进行紧急免疫接种；
⑺对易感禽类的饲养、经营及其产品的生产、储藏、运输、销售等活动进行监测、检疫和监督管理；
⑻储备足够的疫苗、药品、诊断试剂、器械、防护用品、交通及通讯工具等；
⑼对封锁、捕杀病禽和同群禽，无害化处理(死)禽和对同群禽(包括污染物)，消毒、紧急免疫接种等所需费用及其补贴所需的资金做出评估，并提出资金的使用计划；
⑽组建突发疫情处理预备队，培训兽医专业技术人员及其他有关人员；
⑾参与并组织疫点、疫区及其周围群众的宣传教育工作；
⑿组建317国道沿线检查站，按《中华人民共和国动物防疫法》的有关规定，加强对进入我县禽类及其产品的监督管理。
3、其他部门职责
财政部门要保证疫病防治所需疫苗、捕杀、监测消毒处理等经费，加强对防疫经费的管理监督；检验检疫部门要加强对进出我县动物、动物产品和其他检疫物的检疫工作，防止疫情传入；公安部门要协助疫区的封锁和强制性捕杀工作，做好疫区的安全保卫和社会治安管理；交通、公安部门协助畜牧兽医行政管理部门在封锁区内设立临时性的动物检疫消毒站；卫生部门负责监测高致病性禽流感在人群中的发生情况；林业部门做好对野生禽类的监测管理工作。
二、疾病的预防
(一)尽快组织相关人员，对辖区内各类养禽场、农贸市场、农户散养的家禽进行全面摸底调查，了解家禽的总量、分布及进货、上市销售情况，了解家禽群间疫病发生情况，做到心中有数；
(二)要严格交通运输检疫工作，禁止从现已发病的区域调入禽类及其产品，凡在我县市场内发现有疫区禽类及其产品或无证禽类及其产品的，要严格按照《中华人民共和国动物防疫法》的有关规定，予以严查；
(三)落实专项资金，购置疫苗，对辖区内各类家禽紧急注射禽流感疫苗，建立牢固的免疫带；
(四)加强疫情检测，严格落实疫情检测制度，提高检测密度，确保及时准确地掌握疫情动态，严格实施每日报告和“零报告”制度；
(五)成立禽流感现场诊断专家组，组建突发禽流感疫情防控的应急预备队。制定高致病性禽流感预防和控制技术方案。开展科技人员培训工作；
(六)建立高致病性禽流感防治应急物资储备库，重点储备疫情处理所需的防护服、眼罩、口罩等防护用品、消毒设施设备、疫苗与诊断试剂、消毒药品等。
三、疫情报告
任何单位和个人发现禽类出现发病、传播迅速、死亡率高等情况时，应及时向县农牧科技推广站报告，县农牧科技推广站要立即组派技术人员到现场进行调查核实，怀疑是高致病性禽流感的，应在2小时内将疫情逐级上报地区高致病性禽流感领导小组办公室。
四、疫情的确认
(一)县农牧科技推广站在接到疫情报告后，立即派出两名以上具有相关资格的防疫人员到现场进行临床诊断，提出初步诊断意见；
(二)对怀疑高致性禽流感的，由县农牧科技推广站及时采集病料，指定专人专车送自治区畜牧兽医技术推广中心进行血清检测。对疑似病例，由国家指定的实验室做病毒分析与鉴定，进行最终确诊；
(三)人的高致病性禽流感疫情按照自治区卫生行政管理部门颁布的《人的高致病性禽流感诊断标准》确认。
五、疫情的分级
根据《全国高致病性禽流感应急预案》，结合我县实地情况可分为三级：
(一)有下列情况之一的为一级疫情：
1、全县10个乡镇发生疫情的；
2、发生人感染禽流感疫情的。
(二)有下列情况之一的为二级疫情：
1、在5个乡镇发生疫情的；
2、在全县有10个以上疫点的。
(三)有以下情况之一的为三级疫情：
1、全县有3个乡镇发生疫情的；
2、全县有10个以下疫点的。
六、疫病的控制和扑灭
一旦发现疫情，要按照“早、快、严、小”的原则坚决捕杀，彻底消毒，严格隔离，强制免疫，杜绝疫情扩散。
(一)病源分析
由专业技术人员来完成。根据流行病学调查结果，分析病源及其可能扩散、流行情况。对可能存在的传染源以及在疫情潜伏期和发病期间出售的禽类及其产品、可疑污染物(包括粪便、垫料、饲料等)立即开展追踪调查。
(二)划定疫点、疫区、受威胁区
1、疫点：病禽所在禽场(户)或有关屠宰、经营单位为疫点；病禽饲养点及其所在自然村为疫点。
2、疫区：是以疫点为中心，半径3公里以内的区域为疫区。
3、受威胁区：疫区周边5公里以内区域为受威胁区。
(三)疫点应采取的措施
1、捕杀所有的禽类，并对禽类及其产品按国家规定的标准实行无害化处理；
2禽类排泄物、被污染的饲料、垫料、污水等实行无害化处理；
3、对被污染的物品、交通工具、用具、场地等实行彻底消毒，消灭病源。
(四)疫区采取的措施
1、疫区周围设立警示标志，在出入疫区的交通口设置动物检疫消毒站，对出疫区的车辆和有关物品进行消毒。
2、捕杀疫区内所有禽类，并本文来自文秘之音，更多精品免费文章请登陆查看对疫区内禽类产品进行严格排查，对已被污染的禽类产品进行无害化处理。
3、关闭禽类产品交易市场，禁止活禽及禽类产品运出疫区。
4、对禽类排泄物、被污染的饲料、垫料、污水等实行无害化处理。
5、对被污染的物品、交通工具、用具、场地等实行彻底消毒，消灭病源。
6、若有必要，由县人民政府决定对疫区实行封锁。
(五)受威胁区采取的措施
1、对所有禽类采用国家批准的疫苗进行紧急免疫接种，并建立免疫档案。
2、实行疫情监测，掌握疫情动态。
(六)封锁
发生重大动物疫情时，由县人民政府决定对疫区实行封锁，并将疫情逐级上报。
(七)解除封锁
疫区所有的禽类及其产品按规定处理后。经过21天以上的监测，未出现新的传染源，由动物防疫监督人员审验合格后，由当地畜牧兽医行政管理部门向发布封锁令的人民政府申请解除封锁。
(八)处理记录
县农牧局必须完整详实记录疫情应急处理的全过程并保留原始材料。
(九)发生疫情时，必须向临乡(镇)、县等通报疫情。
上述(三)(四)(五)项措施必须在当地动物防疫监督机构的监督下实施。
七、保障措施
(一)提高认识，统一思想
各部门应从讲政治、顾大局的高度认识高致病性禽流感防治工作的重要性和紧迫性，牢固树立加强高致病性禽流感防治工作事关人民群众身体健康和生命安全、事关我县改革发展稳定大局和畜牧业经济健康发展的思想。把思想和行动统一到县委、县政府的部署和要求上来，防止麻痹大意思想和情绪，营造防治高致病性禽流感工作的良好氛围。
(二)加强领导，落实责任
层层落实防治工作责任，实行追溯制度。对因工作不力而造成疫情扩散和导致严重后果的，追究领导责任。
(三)加大投入，保障有力
财政部门要对防治工作予以大力支持，把防治工作所需的疫苗、消毒药品、器械、防护用具、捕杀补助等纳入预算并及时落实，以保障禽流感防控工作的顺利开展。
(四)加强合作，全力推进
各部门要讲大局、讲团结，坚决服从防治禽流感领导小组的统一指挥，搞好协作配合，充分发挥部门职能作用，形成联防联控、齐抓共管，共同推进禽流感防治工作向纵深发展。
八、其它事项
(一)从事禽类饲养、禽类及其产品经营的单位或个人必须履行预案的规定。
(二)在实施本预案的过程中采取的各项措施均是强制性措施，涉及到的单位和个人必须执行。
致病性试验 篇3
关键词：鸡；致病性大肠杆菌；耐药性
中图分类号： S852.61+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0226-03
收稿日期：2013-10-10
基金项目：湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76 号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632）；湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）。
作者简介：李娜（1977—），女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。大肠杆菌为临床上常见的病原菌，在腹泻畜禽的粪便中及各种原因引起的败血症畜禽中都能分离到致病性大肠杆菌。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对养鸡生产的危害极大[1]。国内已有很多关于鸡大肠杆菌病流行病学的研究报道，主要针对我国的主要省（市），而对较小的市、县的研究报道并不多。由于大肠杆菌血清型多、抗原复杂，在小区域间也存在较大差异；同时随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性越来越强。为了能准确防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，并合理用药。目前，国内尚无对湖南省常德地区鸡场大肠杆菌耐药性监测的调查研究报道。为此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区范围内的鸡大肠杆菌病流行情况和耐药情况进行了调查和监测，以了解湖南省常德地区的主要流行菌株的耐药规律，为兽医临床用药提供指导性参考意见。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期间，选取105份湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器。
1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司；普通营养肉汤，自制。
1.1.3试验动物18～25 g/只的小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。
1.1.4药敏纸片试验用药敏纸片共30种，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢氨苄、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、壮观霉素、强力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯洁霉素、呋喃妥因、氨曲南、复方新诺明、利福平等，购于杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1细菌形态与分离培养将采集的新鲜病料分别划线接种于普通培养基、MAC、EMB培养基上，同时分别穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱培养18～24 h后观察；挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌特征的菌株划线接种于普通营养琼脂平板上进行细菌的数次纯化，然后将纯化的细菌接种于普通斜面培养基上，4 ℃保存备用。
1.2.2生化特性鉴定将分离的60个致病菌株接种于普通肉汤中，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后觀察生化反应结果。靛基质发酵管中滴加1滴靛基质试剂、MR发酵管中滴加1滴MR试剂即可观察结果；VP发酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培养2 h即可观察结果。
1.2.3大肠杆菌致病性试验取已鉴定的、生化反应符合大肠杆菌的各个菌株于37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为3.0×109 CFU/mL），经纯粹检验合格后分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的剂量接种，每个菌株接种6只；对照组按相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，共接种6只。接种后饲养观察120 h小白鼠的存活情况，记录小白鼠的死亡时间并对死亡小白鼠进行剖检取肝脏、心脏，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。
1.2.4分离菌药物敏感性试验采用WHO推荐的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]对分离鉴定的75株大肠杆菌进行耐药性监测，判断标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的M100-S15药敏试验纸片扩散法法规[2]和相关文献[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。先将菌株接种到普通营养琼脂斜面培养基上，37 ℃ 恒温箱培养18 h，用生理盐水洗下菌苔；将菌悬液稀释到麦氏比浊管中，相当于终浓度5×107～1×108 CFU/mL；将普通营养琼脂倾注于直径为10 cm的平皿上，制成厚4 mm的营养琼脂平板，15 min内用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁挤去多余菌液后在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转70°，最后沿平板内缘涂抹1周；室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于营养琼脂平板表面，各纸片中心的距离应大于24 mm，纸片距平板内缘的距离应大于 15 mm；37 ℃恒温箱培养16～18 h后观察结果，记录各纸片的抑菌圈直径。
nlc202309012234
2结果与分析
2.1细菌形态及生长情况
由细菌培养结果可知，在普通营养琼脂平板上的菌落生长良好、湿润，呈现半透明状态与灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上的细菌形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上的细菌长出圆形粉红色、表面光滑圆形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培养的细菌均变黄色，产气而不产硫化氢；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。
2.2分离菌的生化特性
分别对分离出的60株致病细菌进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性，详见表1。
2.3大肠杆菌致病性试验
小白鼠在接种分离菌12 h后，均表现出精神不振，18 h后开始出现死亡，48 h后全部死亡；而对照组小白鼠健康活泼。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大瘀血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。综合试验结果可知，分离菌株的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性，确定为致病性大肠杆菌。
2.4分离菌药物敏感性试验结果
以抑菌圈直径大小作为判定药物敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径≥21 mm为高度敏感；在15.1～20.0 mm范围内为中度敏感；≤14 mm 为低敏或耐药。抑菌圈直径的测定结果见表2。研究表明，虽然常德地区3个不同养鸡场的大肠杆菌菌株对30种藥物的敏感性存在一定差异，但是同一养鸡场的大肠杆菌菌株对抗生素的敏感性几乎一致。
养殖户把药物防治作为控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率很低，用药盲目性非常大，且在实际生产中有时用药不合理，如低剂量长时间使用，随意加大剂量或根据个人经验感觉盲目添加等，均会造成大肠杆菌严重耐药，从而导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大，耐药菌株增多。75 株受试大肠杆菌均对除头孢曲松外的29种抗菌药物有多重耐药性，表现为对4种或4种以上药物耐药，8耐菌株所占比例最大，为14.67%；其次是5耐、9耐，分别占10.67%、9.33%。因此在临床用药方面或作为饲料添加药物时，有条件的应该进行药敏试验，尽量选择高效敏感的药物，尽量避免长期大量使用同一种药物，也可以几种药物交替使用，要足量、按疗程给药，以免产生耐药性。
参考文献：
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致病性试验 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 猪场选择
随机选择两个中小型规模猪场, 其中一个为以前免疫过猪蓝耳病疫苗的猪场, 另一个为没有免疫过猪蓝耳病疫苗的猪场;并对生产规模、免疫程序、生产性能、近期病史等内容作相关调查。每个猪场随机选择健康仔猪各30头, 且没有免疫过猪蓝耳病疫苗, 基本情况见表1。
1.1.2 疫苗
中牧股份成都药械厂生产, 批准文号:农医药便函【2009】208号, 生产批号为0906002。
1.1.3 试验耗材
运用法国LSIVET公司的ELISA试剂盒进行抗体检测, 运用北京世纪元亨动物防疫有限公司的PRRSV和HPRRSV RT-PCR试剂盒进行蓝耳病病毒检测。
1.2 方法
1.2.1 分组
将每个猪场30头仔猪随机分为3组, 其中20头为试验组, 每头注射1头份疫苗;5头为安全性试验组, 每头注射10头份疫苗;5头为空白对照组, 每头注射1 m L生理盐水。
1.2.2 体温测量与临床观察
试验前进行直肠测温和临床观察, 试验后再连续3 d测温和观察, 观察内容包括全身 (皮肤、被毛、眼结膜、食欲、呼吸等) 和局部反应 (接种部位有无红肿) 。详细记录试验前后体温变化和临床观察情况。
1.2.3 血清采集
分别于免前1周和免后4周前腔静脉采血, 分离血清, 每头不少于1 m L, 采集的血清编号与采样猪一一对应。
2 试验结果
2.1 免疫副反应
疫苗注射后, 两个猪场试验组40头中有5头、安全组10头中有2头出现精神、食欲有所下降, 第2~3天基本恢复正常;其他未见明显的全身或局部反应。
体温变化幅度不大, 平均体温仍在正常范围内, 见表2。
2.2 实验室检测情况 (安微省动物疫控中心)
2.2.1 高致病性蓝耳病病毒
运用RT-PCR方法, 对2个试验猪场免疫前后的血清样品进行高致病性蓝耳病病毒检测, 试验组和对照组均为阴性。
2.2.2 经典蓝耳病病毒
运用RT-PCR方法, 对
2个试验猪场免疫前后的血清样品进行经典蓝耳病病毒检测, 试验前有3份阳性, 试验后均为阴性。
2.2.3 抗体检测
试验前两个猪场抗体阳性率均为0;免疫28 d后, 两猪场抗体阳性率分别为80%、100%。
3 结果分析
3.1 应激反应
从临床观察和体温测量结果可以看出, 高致病性蓝耳病活疫苗免疫后, 第1天有部分猪体温一过性升高, 2~3 d基本恢复正常, 精神食欲均未见异常, 猪只生长发育正常。体温变化应属注射过程或疫苗中所含异源物质的应激反应。
3.2 使用剂量的安全性
两个猪场的安全性试验组10头猪, 以10倍剂量接种后, 体温变化、临床表现与试验组相比未见异常, 说明该疫苗在临床上应用常规剂量是安全的。
3.3 抗体变化
从抗体检测结果看, 高致病性蓝耳病活疫苗免疫28 d后两个猪场抗体阳性率分别为80%、100%, 平均阳性率为90%, 说明该疫苗免疫原性较好。
3.4 临床应用观察
人感染高致病性禽流感（推荐） 篇5
【定义及流行病学】
(一)概述
人感染高致病性禽流感是由甲型流感病毒引起的一种人、禽、畜共患急性传染病。全球首例人类禽流感发生于1997年5月的香港，是一名3岁儿童。目前已知感染人类的禽流感病毒血清亚型有H5N1、H7N7和H9N2三种。人感染高致病性禽流感临床主要表现为发热和流感样症状，小儿和老人易并发肺炎，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征，最终发展为全身多脏器功能衰竭而死亡。
(二)病原学
根据禽流感病毒株致病性强弱可分为非致病性、低致病性和高致病性甲型流感病毒。H5NI血清亚型属于高致病性甲型流感病毒。
禽流感病毒在22℃时或在水中存活时间较长，在4℃能保存数月，在中性和弱酸性环境中能保持致病性。对紫外线非常敏感，日光直接照射下容易灭活。对热、酸和有机溶剂的抵抗力弱，常用消毒剂如甲醛溶液、脂溶剂、漂白粉、稀酸、碘剂等能迅速破坏其致病力。
(三)流行病学
1．传染源：传染源主要是病禽或带病毒禽类，以产蛋鸡群多发。病毒随病禽分泌物和排泄物污染空气、水和食物等。人类因接触病禽或带病毒禽类分泌物和排泄物污染的空气、水和食物而被感染。目前尚无人传人的确切证据。2．传播途径：人感染高致病性禽流感主要通过呼吸道传播，亦可经过消化道和皮肤伤口而感染。
3．人群易感性：人群普遍易感，与病禽密切接触者为高危人群。
4．发病季节：一年四季均可发生，但冬春季节多发。
【发病机理与病理解剖】
目前发病机理尚不清楚。新近研究表明，甲型流感病毒能直接侵犯人类呼吸道上皮细胞而致病。致病性强的病毒还能造成病毒性肺炎，甚至危及患者生命；而致病性弱的病毒仅侵犯上呼吸道引起流涕、喷嚏、咳嗽等症状。
病理解剖仅限于禽类。病变可累及肝、肾、脾、肺、心、胰、脑等多个器官。
【临床表现】
潜伏期为7天，一般为1至3天。
急性起病，初起发热，体温一般在39℃以上，伴有全身酸痛、鼻塞、流涕、咽痛、咳嗽等上感样症状。约半数病例出现肺部感染，查体可发现双肺干湿性罗音。少数患者病情进展迅速，导致肺出血、呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、心力衰竭、肾功能衰竭等，最终因出现全身多脏器功能衰竭而死亡。
大多数患者病情较轻，少数患者病情较重。病情恶化的主要危险因素有：感染病毒亚型；年龄较大或较小；治疗较晚；出现肺炎、肝损害、肾损害等多种并发症。
【实验室检查】
1．血象：白细胞总数正常、降低或略有升高，淋巴细胞减少。
2。x线检查：显示单侧或双侧肺部实质炎性改变，部分伴有胸腔积液。
3．血清抗体检测：特异性抗体检测，即双份血清（发病头三天和发病后2～3周）抗体滴度呈4倍增长可确诊；H5特异性单克隆抗体检测阴性可以除外H5Nl亚型禽流感病毒感染。
4．病原学检查：取患者早期呼吸道分泌物分离病毒或应用RT—PCR法检测病毒核酸。
5．肝功能检查：以丙氨酸转氨酶升高为主。
【诊断与鉴别诊断】
(一)诊断
1．明确病禽接触史或到过禽流感疫区，约一周内出现高热、流感样症状，应高度怀疑禽流感并及时转送上级医院。2病例分类：
(1)医学观察病例：有流行病学史，与人禽流感患者密切接触史，一周内出现临床症状。
（2）疑似病例：有流行病学史及临床表现，患者呼吸道分泌物标本中甲型流感病毒抗原(核酸)检测阳性。(3)确诊病例：有流行病学史及临床表现，患者呼吸道分泌物标本中分离出甲型流感病毒或检测到病毒核酸，发病初期与恢复期双份血清抗禽流感病毒抗体滴度有4倍或以上升高。
(二)鉴别诊断
1．流行性感冒：单从临床上不易区分，流行病学史中是否与病禽密切接触有助于鉴别诊断．病毒分离鉴定是确诊的唯一依据。
2．感染性肺炎：起病急骤，寒战高热，咳嗽咳痰，x线检查表现为肺部浸润性阴影。感染性肺炎病原复杂，可由细菌、病毒、衣原体、支原体等微生物引起，最终确诊要靠病原分离。
【治疗】(一)一般治疗
住院治疗，单间隔离，卧床休息，输液，退热。儿童禁用阿司匹林，以防止发生Reye综台征。密切观察病情变化，警惕出现各种并发症，例如肺炎。
(二)抗病毒治疗
金刚烷胺，有明显抑制人感染高致病性禽流感病毒复制的作用，早期应用可以降低病毒含量、减轻病情并且缩短病程。在发病两日内使用效果更好。成人每日100mg，分两次口服，疗程5天。幼儿及儿童每日每公斤体重5mg，分两次口服，疗程5天。金刚烷胺的副作用主要有胃肠道反应和神经系统表现。前者包括食欲不振、恶心呕吐等，后者包括注意力不集中、焦虑、眩晕、嗜睡等，重者可出现谵妄、抽搐和运动失调。
(三)抗生素的应用
对于免疫力低下、病情严重的患者可以考虑应用，主要目的是防止继发性细菌感染。
【预防】(一)管理传染源
严格封锁疫区，疫点周围三公里内捕杀病禽，焚烧和掩埋病禽尸体及其污染物，疫点周围五公里内对禽类进行强制性免疫接种。彻底消毒污染的禽舍及其周围环境，严禁活禽流通。
(二)切断传播途径
发生疫情时，应尽量减少与禽类接触，接触病禽时应戴口罩、护目镜和橡胶手套，穿隔离服，接触病禽或其分泌物后应立即洗手。
(三)保护易感人群
对人民群众进行广泛宣教，注意卫生，注意休息，注意营养，加强锻炼，少去公共场所，保持室内空气清新。
【疫情报告】 我国《传染病防治法》规定：人感染高致病性禽流感是乙类传染病，可采取甲类传染病的预防、控制措施，即按照甲类传染病进行管理。
医疗机构实行首诊医师负责制，医务人员是责任报告人，无沦患者是否本地户籍、是否本地常驻人口，都要认真填写《传染病疫情报告卡》，不得空项或漏项，并且同时城镇于发现后2小时内、农村于发现后6小时内通过电话、传真、网上直报或专人传送的方式向当地所属区县疾病预防控制机构报告。
【思考题】
1．禽类发生禽流感疫情时，人类因接触病禽只是极少数被感染，为什么还要引起如此高度的重视? 2．简述人感染高致病性禽流感的鉴别诊断? 3人感染高致病性禽流感的主要临床表现有那些?
【选择题】
1．全世界第一例人禽流感病例在何年何地确诊? A 1999年在香港 B 1997年在香港 C 1999年在中国 D 2003年在越南 2．人感染高致病性禽流感的主要传播途径? A消化道B呼吸道C皮肤D血液
3．人感染高致病性禽流感是属于哪类法定传染病，发生流行时按哪类传染病管理? A属于乙类传染病，流行是按甲类传染病管理 B属于乙类传染病，流行是按乙类传染病管理 C属于甲类传染病，流行是按甲类传染病管理 D属于丙类传染病，流行是按乙类传染病管理
4．以下哪项不是人感染高致病性禽流感患者应用抗病毒药物的目的? A预防再次感染 B抑制病毒复制 C减轻病情 D缩短病程
致病性试验 篇6
近年来, 随着集约化养禽业的迅速发展, 该病已成为困扰养禽业健康发展的主要因素之一。目前我国已分离到的鸡致病性大肠杆菌血清型多达50多个, 各地分离到的菌株的血清型不尽相同[3~7], 鸡源大肠杆菌 (E.coli) 常见的致病性血清型是01、02、035和078, 但在同发病地区或鸡场也有其他血清型为优势致病性血清型[8~10]。
该病的防治主要使用抗菌药, 但是基层缺乏实验室化验的条件, 在生产上盲目滥用药物, 造成大肠杆菌耐药菌株不断产生, 致使该病治疗效果下降, 给养鸡业造成了严重的经济损失, 同时, 抗菌药物在畜禽体内的残留给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害[11,12]。因此, 分离鉴定鸡大肠杆菌血清型及耐药性现状, 以期为临床防治本病提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源:
样品来自大同市周边几个肉鸡养殖场, 共采样18份, 经临床诊断为鸡大肠杆菌病, 无菌操作采取典型病料, 以备检验。
1.1.2 培养基:
营养琼脂、麦康凯琼脂、普通肉汤、伊红美蓝琼脂和细菌微量生化反应管均购于杭州天和微生物试剂公司;M.R.、V-P、靛基质试验用培养基等均按照常规方法配制。细菌生化微量鉴定管由杭州天和微生物试剂有限公司生产。
1.1.3 大肠杆菌O抗原定型血清诊断液:
大肠杆菌O抗原定型血清诊断液购于中国兽医药品监察所。
1.1.4 实验动物:
体重20~25g小白鼠20只, 健康活泼, 购自山西医科大学动物实验中心。
1.1.5 药敏试验:
采用纸片法进行, 选择硫酸阿米卡星、盐酸左旋氧氟沙星、盐酸沙拉沙星、头孢曲松钠、头孢噻噁钠、卡那霉素、头孢噻呋钠、庆大霉素、氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、磷霉素、先锋Ⅴ号等药物进行。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌分离培养:
无菌取肝、心组织, 划线接种于营养琼脂、麦康凯琼脂上, 置37℃恒温箱培养24 h, 观察细菌生长及菌落特征, 选取典型菌落进行革兰氏染色。
1.2.2 生化试验[13]:
将分离纯化的细菌在无菌条件下进行糖发酵试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验、硫化氢试验、尿素酶试验、枸橼酸盐利用试验检测。
1.2.3 致病性试验:
20只小白鼠分成2组, 每组10只。Ⅰ组为试验组, 用鸡大肠杆菌肉汤培养物接种, 腹腔注射0.3 m L/只;Ⅱ组为对照组, 腹腔注射灭菌生理盐水0.3 m L/只。注射后每天观察2次, 连续观察7 d。剖检病、死鼠, 取死鼠的肝脏进行涂片染色镜检, 再将其接种于麦康凯琼脂, 挑取可疑菌落进行分离培养, 进行观察。
1.2.4 血清型鉴定[13,14]:
按大肠杆菌O抗原定型血清诊断液使用说明书操作。首先将分离的细菌进行玻板凝集反应, 初步筛选疑似O血清型菌株, 然后通过试管凝集反应进一步确定其血清型。
1.2.5 药敏实验:
采用纸片法, 贴上纸片后置于37℃培养24 h后观察结果并测量抑菌圈大小。判定标准:抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感;抑菌圈直径在10~20 mm之间为中度敏感;抑菌圈直径小于10 mm为耐药。
2 结果与分析
2.1 细菌的分离培养
从18份病料中, 分离出大肠杆菌11株, 分离率为61.11%。分离菌在营养琼脂上生长24 h后, 形成圆形、边缘整齐、隆起、光滑、湿润、灰白色的菌落, 直径为2~3 mm;在麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的小菌落;在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落;在普通肉汤中呈均匀浑浊, 管底有灰白色沉淀, 振荡呈云雾状散开。革兰染色镜检可见革兰阴性、无芽胞、短小、两端钝园的短杆菌。
2.2 生化试验
11株分离菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇产酸产气;M.R.、吲哚实验结果阳性;对枸橼酸盐、明胶、V-P反应阴性;符合大肠杆菌生化特性。
2.3 致病性试验
Ⅰ组2只小鼠5 h内死亡, 5只24 h内死亡。3只36 h内死亡, 病理剖检可见肝脏肿大, 有坏死灶及出血点;肠严重鼓气, 心包淤血, 肺出血, 脾脏淤血。采取死亡小鼠肝和脾接种在麦康凯琼脂平板及普通肉汤, 37℃培养24 h, 有细菌生长。革兰氏染色及生化鉴定表明此菌与接种细菌为同种细菌。说明该菌对小鼠具有较强的致病力。Ⅱ组饲养7 d后全部存活, 剖检未见明显病变。
2.5 血清型鉴定
18株大肠杆菌中主要是O781种血清型。
2.6 药敏实验结果
18株大肠杆菌对14种抗生素有不同程度的耐药。具体结果见表1。
mm
注:d≧20mm, 高度敏感;10mm≦d﹤20mm, 中度敏感;d﹤10mm, 耐药
3 结论与讨论
3.1 分离株鉴定及发生感染的原因
经过细菌分离培养、生物学特性的鉴定, 可以得知引发该地区肉鸡发病死亡的致病菌为致病性大肠杆菌, 且其血清型为O78。大肠杆菌为条件性致病菌, 而现在肉鸡饲养主要采用网上平养的方式, 饲养密度大, 鸡舍空气污浊, 通风不良, 光线照射不足, 肉鸡生长速度快, 耗氧量大以及环境卫生与饲养管理不善等因素常可导致机体抵抗力下降, 肠道正常菌群的微生态平衡被破坏, 致使细菌大量繁殖而发病。因此, 平时应加强饲养管理, 搞好鸡舍及周围环境的卫生;发病时, 应及时采取隔离措施, 并对鸡舍及污染场地进行清理消毒。
3.2 耐药菌株产生的原因
从药敏试验结果可见.该地区的大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、磷霉素、先锋Ⅴ号等有耐药性, 对盐酸左旋氧氟沙星、头孢曲松钠、头孢噻噁钠、头孢噻呋钠、卡那霉素、庆大霉素等中度敏感、盐酸沙拉沙星、硫酸阿米卡星高度敏感。结果表明前几次治疗使用的敏感药物这次药敏试验结果就不理想, 主要是临床上长期大量和不规范的使用抗菌药物, 致使大肠杆菌耐药菌株不断产生, 耐药谱也越来越广泛。很多养殖户为了达到治疗的效果, 盲目加大用药剂量, 不仅破坏鸡肠道的正常菌群, 而且间接影响人体健康, 最后会导致药物残留。因此, 加强生物安全措施, 合理使用疫苗, 选择有效的抗生素, 才是控制大肠杆菌最经济有效的方法。
致病性试验 篇7
本试验从吉林省大安龙沼地区临床发病的部分鹅只分离了鹅致病性大肠杆菌, 并进行了初步的鉴定及药敏试验, 为该地区本病的预防和控制提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 原始病料
2013年6月从吉林省大安龙沼新风村采集发病鹅和病死鹅, 40日龄左右, 主要剖检病变为心包炎、气囊炎及肝周炎。
1.2 实验材料
麦康凯培养基购自鼎国化学试剂有限公司;LB液体、固体和半固体培养基按照常规方法配制、革兰氏染色液按常规方法配制;药敏纸片均购于北京天坛药品生物技术开发公司。
1.3 方法
1.3.1 细菌的分离
采取经临床诊断和病理剖检初步诊断为大肠杆菌病的心脏、肝脏、脾脏等器官。先用液体LB培养基37℃增菌培养18~24 h, 若培养基呈均匀混浊, 则用白金耳挑取一环菌液, 转接到LB琼脂平板上, 37℃培养18~24 h, 挑取单个、直径约2㎜的圆形、光滑、隆起、湿润、半透明淡灰色的菌落转接到液体LB培养基中, 作进一步鉴定。
1.3.2 细菌的初步鉴定
1.3.2. 1 菌落形态观察
用纯培养物接种鉴别培养基-麦康克琼脂平板, 观察菌落形态。形成中等大小、砖头红色、光滑、隆起、湿润、边缘整齐不透明的菌落, 为疑似致病性大肠杆菌。
1.3.2. 2 从肉汤中挑取纯培养的菌液, 涂片, 用革兰氏染色液染色, 镜检观察细菌形态。
1.3.3 生化试验
无菌操作, 用接种针取纯培养的待检菌接种于不同糖类的糖发酵培养基和U形管中的半固体培养基, 观察糖发酵情况和细菌动力情况。糖发酵包括:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。置于37℃温箱内培养18~24 h, 观察结果。
1.3.4 动物致病性试验
取8只30日龄非免疫健康雏鹅, 其中实验组共有6只, 对照组2只。试验组用细菌的纯培养18 h的菌悬液, 按0.2 m L/只腹腔注射, 对照组注射灭菌生理盐水0.2 m L/只。分别隔离饲养, 与注射后6 h、12 h、24 h、48 h观察发病及死亡情况, 详细记录发病与死亡情况, 并将死亡鹅雏放4℃冰箱保存。采取病死雏鹅心血、肝、脾进行细菌的分离鉴定。
1.3.5 药敏试验
采用纸片法进行药敏试验, 抗生素类药物包括氨苄西林 (AM) 、头孢唑啉 (CZ) 、庆大霉素 (GM) 、链霉素 (S) 、四环素 (TC) 、磺胺 (SMX) 、氟苯尼考 (F) 、氧氟沙星 (OFL) 、环丙沙星 (CIP) 、阿莫西林/克拉维酸 (AMX/CA) 。按照抑菌圈的大小判定该菌对抗生素类药物的敏感性, 其判定标准见表1。
2 结果
2.1 细菌的分离与镜检结果
麦康凯培养基划线培养后, 可见有表面光滑、边缘整齐、圆形、隆起的砖红色菌落 (见图1) 。分离纯化后的细菌经革兰氏染色镜检后观察, 视野中可见有大量散在排列整齐、形态均一、中等大小革兰氏阴性杆菌 (见图2) 。符合大肠杆菌的细菌培养和形态特点。接种了菌落的LB肉汤培养基24 h后浑浊, 并有絮状物沉淀 (见图3) 。
2.2 生化试验鉴定结果
分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气;乳糖只产酸, 不产气;不发酵蔗糖;动力为阳性, 说明细菌具有鞭毛。上述特点符合大肠杆菌的生化特性。具体结果见表2。
注:“⊕”产酸产气;“+”产酸和动力阳性;“-”阴性, 既不产酸不产气;“±”疑似。
2.3 动物致病性试验结果
实验组雏鹅均在16 h后开始发病, 表现羽毛蓬乱, 呆立, 厌食, 粪便粘稠呈白色, 24 h后发生死亡, 26 h死亡1只, 32 h死亡2只, 42 h死亡1只, 其余2只在48 h内全部死亡。而对照组雏鹅全部存活。解剖死亡雏鹅, 其剖检病变为:有2只其腹腔具有黄色或黄绿色积液, 其余4只无积液;有3只出现肝脏稍肿大, 边缘钝圆;有1只出现脾脏稍肿大;5只试验鹅出现心包炎。从解剖鹅重新分离细菌, 经增菌培养后, 接种麦康凯琼脂平板, 37℃培养18~24 h, 在培养基上形成圆形、光滑、砖红色、边缘整齐中等大小菌落。经LB肉汤培养后, 涂片, 经革兰氏染色, 镜检并做生化试验其结果与自然发病分离到的细菌结果相同。
2.4 药敏试验结果
对确认的分离大肠杆菌进行药敏试验, 结果该菌株对氟苯尼考高度敏感, 对环丙沙星、氨苄西林、氧氟沙星等耐药性都很高。
3 讨论
3.1 根据流行病学、病史、临床症状以及病理剖检变化, 即可作出初步诊断为鹅大肠杆菌病。再通过病原分离及纯培养, 麦康凯培养基上菌落形态;革兰氏染色;生化试验;细菌动力试验以及细菌的致病性试验, 确诊为致病性大肠杆菌。
3.2 鹅大肠杆菌为条件性致病菌, 在正常情况下, 健康禽类具有完整的防御系统, 足以抵挡大肠杆菌甚至致病性菌株的自然感染。鉴于大安市肉鹅养殖基地基本是露天饲养, 为简易棚舍, 条件较差、加之气候潮湿、卫生状况不良, 因此发病且发病率和死亡率较高。2013年4月天气寒冷, 5月中旬入雏, 入雏较每年晚一个月左右, 加之6月雨水较大, 气候潮湿。天气阴冷, 鹅的抵抗力降低, 鹅群在放牧期间饮用不洁水, 故导致该地区大肠杆菌病发生。
3.3 根据药敏试验结果, 购买了由农业部GMP认证企业生产的氟苯尼考可溶性粉, 按照说明书的用法兑水给鹅群饮用, 取得了良好的预防和治疗效果。
3.4 吉林省大安地区是养鹅的重点地区之一, 目前养鹅发展势头良好。但随着规模养殖的不断增加和产品流通的日益频繁, 疫病的预防和治疗也变得越来越重要。鹅大肠杆菌病虽然不是影响养鹅业发展的主要疫病, 但在气候条件异常和饲养环境不好的条件下, 也会对养鹅业的发展造成不良的后果, 应该引起我们足够的重视。对该地区肉鹅的大肠杆菌进行分离鉴定的意义在于, 不但可以了解该地区大肠杆菌的优势血清型, 还可以通过药敏试验有针对性的施药, 从而采取切实有效的预防控制措施。
摘要：采取临床疑似大肠杆菌感染的病死鹅的肝、脾进行病原菌的分离培养, 经过培养特性、形态、染色特性、生化试验、动物致病性实验, 鉴定为致病性大肠杆菌。选用多种临床常用的抗菌药物进行药敏试验。结果表明分离菌株对氯霉素高度敏感, 对环丙沙星、氨苄西林、氧氟沙星等耐药性都很高。
致病性试验 篇8
陕西省关中地区2个规模化养鸡场产蛋鸡群中大肠杆菌病的发病率较高, 表现为腹膜炎、输卵管炎、气囊炎等, 病死率也较高, 并对产蛋量和种蛋的质量产生了较大的影响, 损失严重。试验对疑似大肠杆菌病的病例进行了病原的分离、鉴定, 并用20种常用抗生素对分离菌株做药物敏感性试验, 筛选出了敏感的药物, 为临床防治大肠杆菌病提供了依据。
1 材料
1.1 病料
分别于2008年12月份和2009年3月份在陕西省关中地区的2个养鸡场 (分别编号为A场和B场) 剖检具有典型腹膜炎、肝周炎、气囊炎等症状的病死鸡, 无菌采集鸡肝脏共40份, 做标记, 4 ℃保存, 备用。
1.2 试剂
普通营养琼脂、麦康凯琼脂等, 均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;细菌微量生化反应管、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管、抗生素类药敏纸片, 购自杭州天和微生物试剂有限公司;染色液、常规试剂, 西北农林科技大学动物医学院动物性食品卫生实验室提供。
1.3 试验动物
1日龄罗曼商品代公雏鸡, 购自杨凌示范区孵化场。
2 方法
2.1 细菌分离
将无菌采集的病料在麦康凯平板上划线接种, 置37 ℃温箱培养18 ～24 h, 观察细菌的生长特性。挑选麦康凯平板上的可疑菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基和麦康凯培养基上, 置37 ℃温箱中培养18 ～24 h, 观察其生长特性。挑取麦康凯培养基中的光滑、砖红色单个菌落在麦康凯琼脂培养基上进一步纯化。
2.2 涂片、染色、镜检
对病料和分离、纯化的单个菌落进行革兰染色、镜检, 观察病料中细菌的染色特性。
2.3 细菌纯培养物的获得
将菌落接种到普通营养琼脂斜面上, 37 ℃培养24 h, 4 ℃保存, 备用。
2.4 生化试验
将纯化细菌分别接种于靛基质试验、M.R.试验、V-P试验、枸椽酸盐利用试验、三糖铁试验、尿素分解试验、硝酸盐还原试验及葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇的微量生化试验培养基, 37 ℃培养18～24 h。
2.5 动物致病性试验
取1日龄健康雏鸡75只, 饲养至5日龄, 每株菌接种3只雏鸡并做标记, 每只雏鸡皮下接种10倍稀释的不同分离株大肠杆菌肉汤培养物0.2 mL, 隔离饲养;对照组雏鸡每只皮下接种等量的灭菌生理盐水, 隔离饲养。接种后3 d内每天观察并记录雏鸡的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况。
2.6 药敏试验
按参考文献[2]进行。
3 结果
3.1 细菌分离结果
在麦康凯培养基上可见圆形、凸起、光滑、湿润、边缘整齐的粉红色菌落;在伊红美蓝琼脂培养基上可见圆形、凸起、光滑、湿润、边缘整齐、带紫黑色金属光泽的菌落。
3.2 镜检结果
镜检可见两端钝圆、 多数散在排列、 偶尔有2～3个连在一起的革兰阴性短杆菌。培养物经革兰染色、镜检可见革兰阴性、中等大小的直杆菌, 两端钝圆, 单个或成对分布, 不形成芽孢, 无荚膜。
3.3 纯培养结果
A场共分离到大肠杆菌12株, 依次编号为TU-1、TU-2、TU-3、TU-4、TU-5、TU-6、TU-7、TE1-1、TE1-2、TE2-1、TE2-2、TE2-3;B场分离到大肠杆菌12株, 依次编号为X1-1、X1-2、X1-3、X2-1、X2-2、X3-1、X3-2、X3-3、X4-1、X4-2、X4-3、X4-4。
3.4 生化试验结果
生化试验结果表明:全部菌株均发酵葡萄糖, 产酸、产气。其中有9株不发酵蔗糖;9株发酵蔗糖, 产酸、产气;6株发酵蔗糖, 产酸、不产气。17株发酵乳糖, 产酸、产气;7株发酵乳糖, 产酸、不产气。全部菌发酵麦芽糖, 产酸、产气。18株发酵甘露醇, 产酸、产气;6株发酵甘露醇, 产酸、不产气。三糖铁试验斜面和底层均为黄色, 底部有气泡产生, 不产生硫化氢;靛基质、M.R.和硝酸盐还原试验均为阳性;V-P试验、枸椽酸盐利用试验和尿素分解试验结果均为阴性。分离菌符合大肠杆菌的生化反应特征。
3.5 动物致病性试验结果
接种后72小时, X3-2、X4-2组未出现发病和死亡情况;TE1-1、TU-6和X4-3组各有1只发病但未死亡; X1-2组死亡2只, 1只发病但未死亡;其余各组雏鸡全部死亡。对照组雏鸡生长良好, 未出现发病及死亡现象。说明此次分离出的24株鸡大肠杆菌中, 除X3-2、X4-2、X4-3、 TE1-1和TU-6菌株外, 其余19株均对雏鸡有较强的致病性。
无菌采取感染发病死亡鸡的肝脏进行细菌分离培养及生化鉴定, 回收到与接种菌同种的细菌。
3.6 药敏试验结果
药敏试验判断标准依据美国临床实验室标准委员会 (NCCLS) 药敏试验纸片扩散法法规 (2001年版) 的判定标准。19株蛋鸡致病性大肠杆菌药敏试验结果见表1。
药敏试验结果表明:分离到的鸡致病性大肠杆菌对菌必治、氟哌酸、呋喃妥因、氧氟沙星、环丙沙星的敏感率最高;对链霉素、阿莫西林和氨苄西林的耐药率最高, 对其他药物中度敏感。
4 小结与讨论
试验对从2个鸡场采集的病料进行分离培养, 对分离菌进行生化试验及动物致病性试验, 结果表明分离到的菌株为大肠杆菌。本次分离的19株鸡致病性大肠杆菌对蔗糖、乳糖和甘露醇的发酵结果不尽相同, 表明这些菌株在生化特性上有一定差异, 这可能与大肠杆菌分离株的血清型有关。
本次所做药敏试验的结果与其他报道不尽相同, 分析原因可能与不同地区用药习惯不同进而产生的耐药性不同有关。临床应用药物防治该病时必须结合药敏试验结果, 同时将2～3种敏感药进行交替使用, 用药时一定要按疗程并注意使用剂量。
防治鸡大肠杆菌病时应防重于治, 把重点放在强化生物安全措施、改善饲养管理条件和提高检疫净化水平上[3]。在日常管理中应做到以下几点:①平时要加强饲养管理, 保持饲料和饮水的清洁卫生, 饲喂全价优质饲料, 增强机体抵抗力;②搞好鸡舍及周围环境卫生, 对鸡舍及污染场地进行清理、消毒, 尽量减少致病性大肠杆菌和支原体等有害病原;③保证鸡舍内良好的通风换气和适宜的饲养密度, 防止鸡舍内温度、湿度的变化引起鸡体应激反应, 抵抗力下降;④不同日龄的鸡群不能混养, 实行全进全出的饲养制度, 每进一批鸡之前必须对鸡舍进行严格的清扫和消毒;⑤种蛋要在产后2 h 内进行熏蒸消毒, 淘汰破损和明显有粪便污染的种蛋, 防止垂直传播;⑥发病时及时采取隔离措施, 加强对鸡舍的消毒;⑦饲喂易消化、吸收的全价饲料, 加倍供给多种维生素[3]。
参考文献
[1]邹玲.2008年山东省胶东地区鸡场疑似大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].浙江畜牧兽医, 2009 (2) :1-3.
[2]王双山, 欧阳素贞, 段书月, 等.豫北地区肉鸡大肠杆菌分离鉴定及其蜂胶灭活苗的研究[J].中国预防兽医学报, 2006 (5) :351-355.
致病性试验 篇9
1 材料
1.1 试验动物
供试鸡为商丘利民禽业孵化厂提供的罗曼公雏鸡, 出壳后即在无球虫的环境中分笼单独饲养, 每次饲喂前将无抗球虫成分的饲料经蒸气熏蒸处理15 min, 并合理添加多种维生素、氨基酸, 试验期间饮用煮沸10 min后晾凉的开水。饲养室做到防虫、防蝇、防鼠、保温和干燥。人工感染前每天检查粪便, 连续3 d, 粪便中确认无球虫卵囊的鸡供试验用。
1.2 供试虫种的来源
收集商丘职业技术学院禽病研究所确诊患有柔嫩艾美耳球虫病 (盲肠球虫病) 病死鸡的盲肠内容物及盲肠黏膜于研钵内, 置4 ℃冰箱中保存, 备用。
1.3 主要试剂
重铬酸钾、氯化钠、生理盐水 (国产分析纯) , 均购自商丘市动物疫病防控中心。
2 方法
2.1 球虫卵囊的分离与培养
将收集的盲肠内容物及盲肠黏膜于研钵内轻轻研磨后加适量生理盐水搅匀, 分别置于40目铜丝筛和260目尼龙筛中过滤, 将滤液以3 000 r/min离心10 min;弃去上清液, 在沉淀物中加入饱和食盐水, 充分搅匀后以3 000 r/min离心漂浮10 min;吸取上层液体加入约10倍量清水, 充分搅匀后再以3 000 r/min离心10 min;弃去上清液, 沉淀中加入等量的2.5%重铬酸钾溶液并移入平皿中, 置27～29 ℃生化培养箱中培养72 h;80%以上卵囊孢子化后, 置4 ℃冰箱中保存, 备用。期间每天用吸管反复吹打培养液3～4次, 并视情况滴加2.5%重铬酸钾溶液防止干涸, 但培养液深度不超过2 cm。
2.2 球虫卵囊的继代培养
将孢子化卵囊按3.0×104个/只 (0.3 mL/只) 经口一次性感染1周龄雏鸡进行卵囊继代增数[1], 攻毒后从第72小时开始, 每天用饱和食盐水漂浮法检查粪便中有无卵囊出现, 并观察血便和死亡情况。攻毒1周后逐只剖杀, 取盲肠内容物及盲肠黏膜用上法收集卵囊并孢子化, 之后置2.5%重铬酸钾溶液中, 放入4 ℃冰箱保存, 备用。
2.3 地方虫株的致病性试验
2.3.1 试验设计
试验鸡共分4组, 每组15只:1～3组为试验组, 第4组为不感染对照组。攻毒前2天逐只称重, 并按体重排序, 然后采用从前到后再从后到前的交叉法分为4组, 使各组鸡的平均体重几乎相等 (相差0.1 g以内) [1]。在鸡13日龄时, 除不感染对照组外, 每组每只的攻毒剂量分别为5.0×103 (0.05 mL) 、2.0×104 (0.2 mL) 、8.0×104 (0.8 mL) 个卵囊。感染后每日观察雏鸡精神状况、食欲、粪便等临床症状, 对死亡鸡随时称重、剖检并记录。感染后第8天逐只称重并剖杀全部试验鸡。
2.3.2 致病力的判定方法和标准
按J.Johnson和W.M.Reid [2]所述方法进行盲肠病变记分:试验组个别鸡只盲肠肿大或稍肿大, 盲肠壁呈粉红至暗红, 浆膜面可见针尖大出血点, 表示致病力较强, 病变记分为2分;若试验组多数鸡只盲肠肿大, 盲肠壁增厚呈暗红色, 表示致病力强, 病变记分为3分;若试验组鸡只盲肠高度肿大, 其内充满新鲜的或凝固的暗红色血液, 盲肠黏膜坏死、脱落, 与血凝块混合形成肠芯, 表示致病力极强, 病变记分为4分;若试验组鸡只盲肠无病变, 病变记分为0分。
3 结果 (见表1)
3.1 临床表现
试验观察到攻毒后第4天, 除不感染对照组外, 各试验组鸡相继出现临床症状。病初食欲减退, 翅膀下垂, 羽毛松乱, 缩头闭眼, 呆立或伏卧, 呈昏睡状, 随病情发展至排血便时采食量明显减少, 严重者死亡。第1组鸡在攻毒后的第5天出现血便, 到第7天共有6只排血便 (其中3只相继死亡) , 其余9只精神和食欲无明显变化;第2组鸡在攻毒后的第4天出现血便, 到第7天共有12只排血便 (其中10只相继死亡) , 其余3只精神高度沉郁, 采食量明显减少甚至废绝;第3组鸡在攻毒后的第4天出现血便症状并相继死亡, 到第8天15只鸡全部死亡;第4组临床表现未见明显变化, 粪便中没有发现卵囊, 无死亡。
3.2 增重
试验开始和结束时分别对鸡只进行称重, 试验过程中死亡的鸡只以死亡时作为终末体重计算。各试验组鸡在攻毒后7 d内的平均增重量不一, 均低于第4组, 各试验组间的体重随着攻毒剂量的增加而明显减少, 可见鸡柔嫩艾美耳球虫对增重的影响比较明显。
3.3 盲肠病变记分
剖检死亡鸡只发现, 盲肠高度肿胀, 盲肠壁增厚并呈暗红色, 盲肠内充满血性内容物。第8天, 对所有鸡只称重、剖杀并进行盲肠病变记分, 第1组鸡病变记分为2分, 肠道病变不明显, 个别鸡只盲肠肿大或稍肿大, 盲肠壁呈粉红至暗红, 盲肠浆膜面可见针尖大出血点;第2组鸡病变记分为3分, 多数鸡只盲肠肿大, 盲肠壁增厚呈暗红色;第3组鸡病变记分为4分, 病变最为典型, 表现为盲肠高度肿大, 盲肠壁增厚呈暗红色, 其内充满大量血液, 盲肠黏膜坏死、脱落, 与血凝块混合形成肠芯, 部分鸡只直肠内也充满血液;第4组鸡无病变, 记分为0分。
4 讨论
4.1 鸡柔嫩艾美耳球虫的分离培养
根据鸡柔嫩艾美耳球虫寄生部位的特殊性, 直接采取盲肠内容物及黏膜分离球虫卵囊比采用饱和食盐水漂浮粪便得到的球虫卵囊纯净。将分离的球虫卵囊置2.5%重铬酸钾溶液中培养效果最好, 这是因为重铬酸钾既能抑制其他微生物的繁殖, 又可持久地保持球虫卵囊形态的完整和生命力。而在饱和食盐水中培养的球虫卵囊, 由于溶液浓度高, 1～2 d后球虫卵囊皱缩变形, 影响球虫卵囊的致病性。
4.2 鸡柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定
寄生于鸡体内的球虫有柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、哈氏艾美耳球虫、变位艾美耳球虫、和缓艾美尔球虫和早熟艾美耳球虫9种[3]。其种类不同, 形态特征和寄生部位也各不相同。因此, 很早就有学者对寄生于鸡体内的各种球虫进行形态描述和寄生部位的研究, 并以此来区分它们。尤其是形态学方法一直是国内外学者进行鸡球虫种类鉴定常用的方法, 但是, 由于鸡柔嫩艾美耳球虫寄生部位的特殊性有助于纯种的分离鉴定。鸡柔嫩艾美耳球虫的显著特征是寄生在盲肠, 轻度感染时盲肠稍肿大, 盲肠浆膜面可见针尖大出血点, 严重感染时病变可以发展到小肠下段和直肠, 盲肠高度肿胀并大量出血, 肠浆膜面和黏膜面有大量出血点, 肠腔中充满凝血和肠黏膜碎片, 后期盲肠内容物逐渐变硬形成干酪样肠芯, 内混有大量球虫卵囊。本试验根据鸡柔嫩艾美耳球虫寄生部位的特殊性, 再结合感染雏鸡试验过程的病理变化并对照国内外相关文献[4,5], 初步确定分离的球虫种为柔嫩艾美耳球虫。
4.3 柔嫩艾美耳球虫商丘地方株的致病性
在本试验过程中, 潜伏期3 d, 感染后第4天开始出现明显的临床症状, 攻毒剂量为5.0×103个/只 (0.05 mL/只) 卵囊以上时, 第6天出现鸡只死亡, 盲肠呈典型病变, 而且血便率和死亡率均随着攻毒剂量的增加而升高, 试验结果与有关报道一致。相关资料还表明, 鸡柔嫩艾美耳球虫的致病力存在地理上的差异[7]。本次分离到的商丘株致病性试验结果表明:当感染量达到5.0×103个/只 (0.05 mL) 卵囊时, 致死率为20.0%;每只鸡感染2.0×104个/只 (0.2 mL) 卵囊时, 致死率为66.7%;当每只鸡感染量达8.0×104个 (0.8 mL) 卵囊时, 致死率为100%, 说明本次分离到的商丘株致病力较强。
参考文献
[1]宁长申, 张龙现, 菅复春, 等.中药防治人工感染鸡柔嫩艾美尔球虫病药敏试验[J].中兽医医药杂志, 2006, 25 (3) :31-33.
[2]JOHNSON J, REID W M.Anticoccidial drugs:Lesion scoring tech-niques in batery and floor-pen experiments with chickens[J].ExpParasitol, 1970, 28:30-36.
[3]谢拥军, 崔平.动物寄生虫病防治技术[M].北京:化学工业出版社, 2009:172-177.
[4]韩玲, 李培英, 顾有方, 等.柔嫩艾美耳球虫合肥株的分离与鉴定[J].安徽科技学院学报, 2006, 20 (1) :1-4.
致病性试验 篇10
1 材料与方法
1.1. 材料
自青岛农业大学禽病中心采集青岛地区多个肉鸡场的疑似大肠杆菌病的病、死鸡内脏器官;麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基、柠檬酸盐琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水;五糖微量发酵管 (葡、乳、麦、甘、蔗) 、药敏纸片 (购自杭州天和微生物试剂有限公司) ;E.coli标准抗“O”血清、标准菌株均购自中国兽医药品监察所。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养及形态学观察
将病料无菌划线接种于麦康凯平板上, 37℃培养24h。挑取麦康凯平板上的红色单菌落进行革兰氏染色, 镜检。
1.2.2生化试验
挑取经革兰氏染色后呈阴性短杆菌的麦康凯平板上的红色单菌落在普通营养琼脂培养基上进行纯培养后, 按常规方法进行TSI、IMViC、糖发酵试验[1]。
1.2.3 血清型测定
用大肠杆菌单因子血清对大肠杆菌分离株进行“O”血清型鉴定。首先将大肠埃希氏菌因子血清溶解于5ml 0.5%石炭酸生理盐水。用0.5%石炭酸生理盐水2 ml洗下普通琼脂斜面小管培养物, 置小圆底试管中, 制成浓稠菌悬液, 然后121.3℃高压2h, 破坏其“K”抗原, 制成高压抗原, 以进行“O”抗原的鉴定。方法如下:
取洁净玻板, 用蜡笔划成方格, 并注明相应血清标号, 每板4种血清, 每格用微量加样器加一种血清8µl, 再用微量移液器滴加一种被检菌“O”抗原8µl于血清附近, 但不与血清接触, 用火柴棒将抗原与血清混匀。
对照:每次试验同时以高压抗原与0.5%苯酚生理盐水混合物作对照, 观察有无自凝现象。
判定:3min内出现凝集者为阳性反应。
1.2.4 药敏试验
将分离得到的25株大肠杆菌和标准菌株在无菌条件下分别接种于肉汤中, 然后放入摇床中培养12h后计数, 调节菌液的含菌量为108个/mL。按常规操作贴好纸片置于37℃温箱中培养12h后观察结果
2 结果与分析
2.1 细菌的分离培养
经37℃培养24 h后在麦康凯琼脂平板上形成中等大小的红色菌落。挑取麦康凯平板上的红色单菌落划线接种于在普通琼脂平板上纯培养后, 形成表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起, 中等大小的菌落。
2.2 细菌形态学观察
革兰氏染色镜检均可见两端纯圆, 多数散在排列, 革兰氏阴性短杆菌。
2.3 生化试验
三糖铁斜面、底层均为黄色, 底层产气;分离菌株全部发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇, 对蔗糖的发酵因菌株而异, IMViC结果为++--, 均符合大肠杆菌的特性, 由此可以看出, 所分离培养出的25种菌株全为大肠杆菌。
2.4 血清型的鉴定结果 (见表1)
注:有10种菌株未定型
分离出的25株大肠杆菌, 除10株因未出现玻板凝集反应或自凝而未能定型外, 鉴定出15个分离菌株的O血清型, 共计11种。血清型鉴定结果表明, O22血清型的菌株最多, 有3株, 占定型菌株的12%, 为优势血清型。
2.5 药敏试验结果
根据2000年6月由中国药品生物制品检定所国家抗菌药物细菌耐药性检测中心颁布的《抗菌药物药敏纸片判断标准》判定, 统计结果见表2。
从表3中可以看出庆大霉素、阿米卡星对所分离出的25株致病性大肠杆菌抑菌作用最强, 高敏菌比例分别为88%和56%, 卡那霉素、猎户星、硫酸安普霉素的抑菌作用次之, 敏感菌株比例在20%～48%之间, 丙氟哌酸、乳酸环丙沙星抑菌作用低, 敏感菌株比例低于10%。更需要注意的是, 氟哌酸、杆痢停、百病清、复方磺胺类对所分离的菌株几乎无抑制作用。由表3可以看出, 致病性大肠杆菌的耐药菌株越来越多并日趋严重。在饲养管理中, 要严格控制滥用抗菌药, 应选择合适的药物进行大肠杆菌病的预防和治疗。
3 讨论
3.1 致病性大肠杆菌血清型的特点
对青岛地区致病性大肠杆菌的血清型鉴定结果表明, 鸡场中致病性大肠杆菌的主要血清型是O22、O1、O24a和O157, 分别占鉴定菌株的12%、8%、8%和8%, 这一结果与国内部分地区的调查结果相似。有关致病性大肠杆菌血清型鉴定国内外报道较多, 各地区流行的优势血清型所占的比例相差比较大, 但优势血清型均为O22、O1和O78[2]。在本地区不同场分离到2株O24a血清型的致病性大肠杆菌, 这在其他地区是比较少见的, 可能与引种范围比较广有关, 因此在大肠杆菌的防治上应引起重视。本次试验中血清型为O22的菌株最多, 有3株, 占定型菌株的20%, 为优势血清型。国外有研究报道, 禽致病性大肠杆菌常见血清型为O1、O2、O35、O78[8]。本次试验所得4个主要血清型中O1为常见血清型, 而O22、O24a和O157则不在此列, 国内也少有报道, 因此对其进行深入研究将有助于探讨禽大肠杆菌的致病机理、免疫保护机理和防治措施。本次试验中未发现O2血清型, O1也只有2株, 所占比例较低, 与国内已报道的结果存在差异, 说明我国鸡大肠杆菌血清型分布存在着地区性和多样性。
致病性血清型的广泛分布, 给防治工作增加了难度, 而优势血清型的出现, 又为通过疫苗预防控制该病提供了条件[3]。而本试验对25株大肠杆菌血清型的鉴定为青岛地区大肠杆菌病的防制提供了参考。
3.2 青岛地区肉鸡致病性大肠杆菌耐药谱的变化
药谱差异较大, 从分离的25株大肠杆菌药敏结果就可以看出。本试验结果再次表明, 高敏抗生素的长期使用, 终将导致耐药菌株的产生。临床常用的丙氟哌酸、乳酸环丙沙星抑菌作用大大降低, 而氟哌酸、杆痢停、百病清、复方磺胺类对所分离的菌株几乎无抑制作用。细菌耐药性的发生和发展正是抗菌药物广泛应用, 特别是无指征滥用的结果[4]。因此在治疗鸡大肠杆菌病时必须注意用药问题, 加强抗菌药物的质量监督, 注意进行细菌耐药性的监测, 在有限的条件下尽量避免耐药菌株的产生;另外可在实践中探索一些有效的抗耐药菌措施, 如不同类的抗生素联合使用, 在体外通常呈相加或协同作用, 联合用药可能抑制某些细菌对某类药物耐药性的产生。总之, 耐药菌的产生将是养殖业今后面临的一大难题。
参考文献
[1]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社.2002:36-39.
[2]张春荣, 苏亚拉图.我国流行的鸡致病性大肠杆菌血清型[J].中国动物检疫, 1996, (1) :2-8.
[3]窦大庆, 彩尼瓦尔, 古丽巴哈尔等.喀什地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及多价灭活苗的研制[J].中国兽医杂志, 2002 (3) :19-20.