三七皂甙Rg1（精选三篇）
三七皂甙Rg1 篇1
关键词：肝纤维化,线粒体,三磷酸腺苷酶6亚基,三磷酸腺苷酶8亚基,三七皂甙Rg1,三七皂甙Rb1,Wistar大鼠
肝纤维化是很多慢性肝病的共同病理过程。Arduini[1]认为肝脏线粒体突变可导致线粒体功能下降, 肝纤维化发病可能与此相关。Banasch[2]提出肝脏线粒体氧化磷酸化功能改变是影响肝纤维化发生发展的重要因素。这些重要发现为深入研究肝纤维化机制和开拓新治疗方案带来机遇。线粒 体DNA三磷酸腺苷 ( adenine triphosphate, ATP) 酶6亚基、ATP酶8亚基基因突变与肝纤维化致病的相关性越来越受关注。另外线粒体突变所影响和导致的疾病目前尚无根治方法, 基因治疗虽带来希望, 但由于这些基因片段本身存在细胞通透性、细胞毒性等方面的问题, 因此尚未有治疗的突破性进展[3]。本课题探讨肝纤维化与线粒体突变的时相性关系及突变与ATP含量的关系, 并运用逆向思维, 从疗效入手, 从在临床已经使用的药物入手, 来寻找防治肝脏线粒体突变的抑制剂。课题组调查对比了运用中医“活血化瘀、清热解毒”理论治疗肝纤维化初见疗效的药物, 选用三七皂甙 ( panax notoginseng saponins, PnS) Rg1、PnS Rb1作为研究对象。通过探讨其对四氯化碳 ( carbon tetrachloride, CCl4) 诱导的肝纤维化大鼠ATP酶6亚基、ATP酶8亚基基因突变的影响和线粒体内ATP的影响, 为PnS Rg1、PnS Rb1在肝纤维化上的应用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 动物
健康雄性体重 ( 250±20) g Wistar大鼠购自河北医科大学实验动物中心, 合格证号: 冀医动字第04056号。
1. 2 试剂
PnS Rg1、PnS Rb1购自昆明植物研究所。4-羟乙基哌嗪乙磺酸 ( hepes) 、IV型胶原酶、胰蛋白酶抑制剂、细胞分离液 ( Percoll) 均购于Sigma公司。引物由上海博亚生物公司设计合成。成髓细胞白血病病毒 ( AMV) 逆转录酶、核糖核酸酶 ( RNase) 抑制剂、Taq DNA聚合酶、PUCm-T质粒、Pstl内切酶购自Promega公司。质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物技术有限公司。ATP试剂盒购于Beckman Coulter公司。引物由上海博亚生物公司设计合成。
1. 3 动物造模与分组
Wistar大鼠96只, 随机分为4组, 每组24只。对照组PBS灌胃5天。CCl4肝纤维化动物模型组 ( 简称模型组) 用5% CCl4橄榄油按5 ml/kg灌胃, 每3天1次, 共15次。PnS Rg1组在每次CCl4灌胃同时腹腔注射Rg1 5 mg/kg。PnS Rb1组在每次CCl4灌胃同时腹腔注射Rb1 5 mg/kg。
各组均以普通饲料喂养, 配以5%酒精饮用水。
1. 4 标本采集与检测
1. 4. 1线粒体ATP含量改变的检测各组于实验前、实验开始2、4、6周后每次断头处死6只大鼠, 取新鲜肝组织, 收集线粒体, 用生物发光法测定各组大鼠实验前及实验开始2、4、6周时线粒体内ATP的含量并比较。
1. 4. 2线粒体DNA的提取及基因克隆测序同时进行肝细胞线粒体RNA的分离提取, 逆转录为cDNA用于线粒体DNA ATP酶6亚基、ATP酶8亚基基因序列检测。参照文献将提取的大鼠肝细胞线粒体DNA进行PCR特异扩增ATP酶6基因, 将其与PUCm-T质粒重组, 转入E. coli JM109 ( 大肠杆菌) 、Pstl酶切、纯化后送往上海博亚生物公司测序, 将其结果经基因库查询, 与Rattus norvegicus ( wistar大鼠) 线粒体基因比较分析[4]。大鼠线粒体DNA ATP酶6亚基7904-8584区域和ATP酶8亚基7743-7946区域基因序列检测结果报告, 通过gene Bank与线粒体DNA已知序列进行比较, 研究线粒体DNA ATP酶6亚基、ATP酶8亚基基因的改变。1. 4. 3检测线粒体DNA ATP酶基因mRNA表达
参照文献提取出总RNA, 逆转录为cDNA, PCR特异扩增, 将产物置于1.2%琼脂糖凝胶电压50 V、30分钟进行电泳[5], 检测线粒体DNA ATP酶基因mRNA表达。
ATP酶6基因的引物为: 5’-AAACGAATAACCCTTGAGAATC-3’[1A ( bp7879) ], 5’-TGGTGGGTCATTATGTGTTATC-3’[1B ( bp8594C) ]。扩增片段为715bp。ATP酶8基因的引物为5’-ACAATGACATGCCACAAC-3’, 5’-GGGAACATAATAATGGTCAC-3’。扩增片段为248bp。β-actin基因的引物为: 5’-AAATCGTCGGTGACATCAAA-3’ ( β1) , 5’-ATCGTACTCGTGCTTGCTGA-3’ ( β2) 。扩增片段为270bp。
1. 5 统计学分析
统计软件为SPSS 17.0统计软件包。突变率的比较用R×C表资料的Fisher确切概率法。线粒体ATP的含量与CCl4处理时间的相关性分析用pearson相关性检验 ( pearson's r test) 。线粒体内ATP含量与ATP酶6, 8亚基突变的相关性分析用pearson相关性检验。数据资料用均数±标准差 ( x±s) 表示, 并经正态性检验及方差齐性检验。
2 结果
2. 1 基因序列检测结果
6周末大鼠线粒体DNA 7904-8584区域ATP酶6亚基有3处突变:C8294G, T8505G, G8584A。6只大鼠共18个可能突变处, 模型组大鼠线粒体DNA ATP酶6亚基7743-7946区域基因发生突变的为88. 8% , PnS Rg1组大鼠发生突变率为27. 8% , PnS Rb1组大鼠发生突变率为33.3%。经列联表的Fisher确切概率法检验, 差异有统计学意义, P < 0.05。大鼠线粒体DNA ATP酶6亚基基因序列检测结果见表1。
6周末大鼠线粒体DNA 7743-7946区域ATP酶8亚基有2处突变: A7797 non ( 缺失突变) , T7863C。6只大鼠共12个可能突变处, 模型组大鼠线粒体DNA ATP酶8亚基7743-7946区域基因突变率为91. 6% , PnS Rg1组大鼠发生突变率为25. 0% , PnS Rb1组大鼠发生突变率为33.3%。经列联表的Fisher确切概率法检验, 差异有统计学意义, P <0.05。大鼠线粒体DNA ATP酶8亚基基因序列检测见表2。PnS Rg1组、PnS Rb1组与对照组相比突变增加没有显著性意义, P >0.05。
2. 2 线粒体 ATP 的含量与 CCl4处理时间的相关性 分析
检测各组大鼠在肝纤维化形成过程中各时相点ATP的含量, 见表3, 并作单因素多组间方差分析。与对照组相比, 模型组在第2周末开始下降, 差异无统计学意义;第4周末下降明显, 差异有统计学意义 ( P <0.05) , 第6周下降更加显著 ( P <0.01) 。
PnS Rg1组、PnS Rb1组在第2周末ATP的含量略高于模型组, 差异无统计学意义; 第4周末模型组ATP的含量下降明显, PnS Rg1组、PnS Rb1组ATP的含量均下降较慢, 这两组ATP的含量均高于模型组, 经单因素多组间方差分析, 差异有统计学意义 ( P < 0. 05) 。第6周末这种差异更加显著 ( P < 0. 01) 。
用pearson's检验r = -0.935, 各组大鼠在肝纤维化各时相点ATP的含量, 与对照组相比, 呈负相关。
注: 与对照组比较aP < 0. 05, bP < 0. 01; 与模型组比较, cP < 0. 05, dP < 0. 01
2. 3 肝纤维化大鼠线粒体内 ATP 含量与 ATP 酶 6 亚基, ATP 酶 8 亚基突变的相关性
大鼠线粒体DNA 7904-8584区域ATP酶6亚基有3个突变点, 理论上6只大鼠有18个突变点, 为分母;2、4、6周末实际的突变数为分子。同理大鼠线粒体DNA 7743-7946区域ATP酶8亚基的突变点为2个, 6只大鼠理论上突变点为12个, 为分母) , 2、4、6周末实际的突变数为分子。
分析肝纤维化大鼠线粒体内ATP含量与ATP酶6亚基突变的相关性, 经pearson's检验, r = - 0. 943, P <0. 01; 分析肝纤维化大鼠线粒体内ATP含量与ATP酶8亚基突变的相关性, 经pearson's检验, r = -0.961, P <0. 01。肝纤维化大鼠线粒体内ATP含量与ATP酶6亚基、ATP酶8亚基突变呈负相关。见表4。
3 讨论
3. 1肝纤维化大鼠线粒体 DNA ATP 酶 6 亚基、 ATP 酶 8 亚基基因序列检测结果的意义
线粒体是能量转换的细胞器, 具有相对独立的遗传系统和生物合成机构, 能产生能量, 促进新陈代谢、掌管细胞死亡和其它重要的信号旁路。线粒体DNA通常与线粒体内膜结合, 周围无组蛋白保护, 处在高氧化还原状态中, 而且聚合酶γ不具有“校读”作用, 缺乏修复机制, 易受毒性物质攻击, 其突变率比核DNA高5 ~17倍[5〗, 已发现多种线粒体DNA突变所致疾病。
Uusimaa[6]报道检测三个未检出有遗传背景的儿童患有Alpers-Huttenlocher-like progressive cerebro hepatic dise, 通过检测线粒体DNA探寻线粒体DNA缺失与线粒体呼吸链缺失的关系。结果证明G352A, C269T的突变与肝损伤有关。本试验支持Uusimaa的观点。模型组大鼠线粒体DNA ATP酶6亚基有3处突变C8294G, T8505G, G8584A。3处突变导致所编码的氨基酸的改变: C8294G使130位氨基酸由谷氨酰胺变为谷氨酸, 使中性氨基酸变为酸性氨基酸; T8505G使200氨基酸由缬氨酸变为甘氨酸; G8584A使226位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。它能显著地影响呼吸链Ⅴ的结构, 减低它的活性。ATP合酶即呼吸链Ⅴ主要由FOF1组成, ATP酶6、8亚基基因是编码FOF1-ATP酶疏水部分FO的两个基因。FO是质子通道, 当H+顺浓度经FO回流时, 催化ADP和Pi生成并释放ATP。有报道ATP酶6亚基基因T8993G突变达到一定阈值时导致Leigh病[7], 该突变引起ATP产量减少并引起FOF1-ATP酶结构的不稳定[8]。
大鼠线粒体DNA 7743-7946区域ATP酶8亚基基因序列检测结果报告: ATP酶8亚基有2处突变A7797 non, T7863C。41位苏氨酸变成丙氨酸。ATP酶8基因7797位点碱基A的缺失, 使阅读框架改变, 转录条件改变并受阻, 是ATP酶8 mRNA表达下调的主要原因, 此位点的缺失突变与研究组前期在失血性休克肠上皮细胞ATP酶8 mRNA的发现改变相同[9]。结果提示缺血及CCl4等毒性物质的攻击都能导致A7797 non的缺失突变。ATP酶6、8基因的突变将导致ATP酶合成减低, 由此导致线粒体功能障碍。高等动物线粒体DNA是共价闭合双链DNA, 编码13条多肽, 与核DNA共同参与氧化磷酸化。因此任何线粒体DNA区域的突变将改变能量的产生。线粒体DNA点突变的产生, 提高了DNA双链的分离机会, 促使线粒体DNA发生进一步突变, 如缺失和重排。缺失的线粒体DNA片断, 既可能形成细胞内的小环, 也可能在线粒体DNA或nDNA上造成重排, 造成更严重的损伤[10]。
线粒体突变所影响和导致的疾病目前尚无根本有效的治疗方法, 基因治疗带来了希望, 包括基因转换, 线粒体转染, 同种异性基因表达和限制性内切酶纠正线粒体DNA的突变等, 但由于这些基因片段本身存在细胞通透性, 细胞毒性, 代谢稳定性等方面的问题, 因此临床应用尚未有突破性进展[3]。本课题运用逆向思维, 从疗效入手, 从在临床已经使用的药物入手, 来寻找防治肝脏线粒体突变的抑制剂。课题组调查对比了运用中医“活血化瘀, 清热解毒”理论治疗肝纤维化初见疗效的药物, 选用PnS Rg1、PnS Rb1作为研究对象。
PnS Rg1、PnS Rb1显著抑制肝纤维化大鼠ATP酶6亚基、8亚基的突变, 与模型组大鼠相比, PnS Rg1组突变率、PnS Rb1组突变率均大幅下降。
3. 2 各组肝纤维化大鼠线粒体 ATP 含量改变意义
检测各组大鼠在肝纤维化形成过程中各时相点ATP的含量, 与对照组相比, 模型组在第二周明显下降, 第四周就有明显差异 ( P <0. 01) 。
ATP酶6、8基因的突变将导致ATP酶合成减低, ATP含量下降, 由此导致线粒体功能障碍。高等动物线粒体DNA是共价闭合双链DNA, 编码13条多肽, 与核DNA共同参与氧化磷酸化。因此任何线粒体DNA区域的突变将改变能量ATP的产生[11]。而ATP酶8基因7797位点碱基A的缺失, 使阅读框架改变, 转录条件改变并受阻, 是ATP酶6, 8 mRNA下调的主要原因。线粒体DNA点突变的产生, 提高了DNA双链的分离机会, 促使线粒体DNA发生进一步突变, 如缺失和重排。缺失的线粒体DNA片断, 既可能形成细胞内的小环, 也可能在线粒体DNA或nDNA上造成重排, 造成更严重的损伤[11]。线粒体内的缺失突变达到一定域值后并继续上升, 使ATP酶活性迅速下降。ATP含量下降, 能量供应不足, 细胞质不能输入并补充线粒体转录翻译所需成分, 此时转录出的ATP酶6、8mRNA的质和量会进一步下调。
ATP含量与对照组相比, 模型组在第二周明显下降, 第四周就有明显差异 ( P <0.05) , 第六周有显著性差异 ( P <0.01) 。ATP酶6, 8亚基的突变与ATP含量呈明显负相关的趋势, 而对照组无改变。
ATP含量的下降, 肝细胞内缺乏维持细胞进行正常生理功能的能力, 致使肝细胞发生炎症、坏死、增生, 诱导肝纤维化的发生。
三七皂甙Rg1 篇2
1三七皂甙Rb1对急性呼吸衰竭作用机制的研究
急性呼吸衰竭是由某些突发因素引起的肺通气和肺换气功能的严重障碍, 以致在静息状态下亦不能维持足够的气体交换, 导致低氧血症伴或不伴二氧化碳潴留, 从而引起一系列生理功能和代谢紊乱的综合征, 主要表现为呼吸困难、发绀、神经、精神等方面的症状。病理表现为肺毛细血管通透性增强、弥漫障碍、肺水肿形成和肺不张, 严重缺氧抑制了三羧酸循环、氧化磷酸化作用和有关酶的活动, 降低了产能效率, 还因无氧酵解增加、乳酸堆积引起代谢性酸中毒反应, 进而使组织二氧化碳分压增高, 以难治性低氧血症及进行性呼吸困难为临床特征的疾病[3]。
1. 1三七皂甙Rb1对急性呼吸衰竭膜电位的影响
李忆兰等[4]证明在急性呼吸衰竭大鼠体内, 线粒体膜电位是评价线粒体膜非常敏感的指标, 急性呼吸衰竭后, 可使大鼠肺脏线粒体膜损伤, 破坏膜磷脂层。线粒体肿胀, 膜流动性降低, 膜的微黏度增加。试验证明急性呼吸衰竭组大鼠肺脏线粒体人分泌型磷脂酶A2 ( secretory phospholipase A2, s PLA2) 于1小时内迅速增加, 其活性为172. 55U / L, 于第3小时达高峰, 其活性为214. 22U / L, 自此平缓下降, 第5小时活性最低, 为162. 77 U/L。研究检测到高剂量三七皂甙Rbl可明显提高线粒体膜流动性, 降低膜的微粘度。因此, 在急性呼吸衰竭时对肺膜电位起到了重要作用。
1. 2三七皂甙Rb1对急性呼吸衰竭肺线粒体的影响
Maniatis等[5]研究报道, 磷脂酰丝氨酸 ( phos- phatidylserine, PS) 在位于磷脂双分子层的内侧不容易被s PLA2水解。当线粒体受到损害时, 导致线粒体膜分子重排, PS暴露于胞膜外侧, 而s PLA2水解物为PS, s PLA2迅速水解PS所产生并释放的溶血卵磷脂和花生四烯酸, 加重了肺脏线粒体的损害, 而肺脏线粒体的损害使s PLA2活性增高。刘鹏年等[6]研究也发现, 低剂量和高剂量的三七皂甙Rb1均可使s PLA2活性下降, 并且高剂量的三七皂甙Rb1对s PLA2活性有显著降低作用, 因此, 在治疗急性呼吸衰竭时对肺线粒体起到了保护作用。
1. 3三七皂甙Rb1可减少炎症介质的释放
大量研究表明, 三七皂苷Rb1药理性保护机制可能是综合的[7], 三七皂甙有良好的抗炎活性, 它可抑制烫伤后巨噬细胞TNF2α 的生成, 抑制NF2- κB的活性。干预NF2-κB的通路, 从而降低了TNF2αmRNA的表达。同时, 三七皂甙Rb1对炎性介质有一定的对抗作用, 三七总皂苷 ( panax notog- inseng saponins, PNS) 能使体内血流有重新分布的趋势, 提高血小板内的CAMP含量从而抑制血小板聚集, 增加血小板膜流动, 降低血黏度, 延长凝血酶原的时间, 重新分布体内血液, 改善高凝和高黏状态的血液流变学, 保证组织血流量, 减少组织缺氧, 从而改善异常微环境。张杰根等[8]研究显示, 三七总皂甙明显降低呼吸衰竭患者血清COX-2、前列腺素E2 ( prostaglandin E2, PGE2) 和PLA-2的水平, 通过抑制PLA-2和COX-2的活性, 从而减少PGE2合成, 减少炎性介质的释放, 这可能是三七总皂甙改善呼吸衰竭的作用机制。
2三七皂甙Rb1对慢性阻塞性肺疾病的作用机制
慢性阻塞性肺疾病是临床上常见的慢性肺系疾病之一, 也是中老年人群体中的高发疾病之一, 它的特征主要表现为呼吸道不完全可逆气流受限。 该病患病时间较长, 严重时可导致死亡。因此, 及时有效的诊治才能够保障患者的病情得到有效的控制, 从而减轻疾病为家庭所带来的经济和心理方面的负担[9]。
根据慢性阻塞性肺疾病的临床表现和病程演变, 可将其归属于中医学肺胀范畴。临床上针对该病主要采用对症治疗, 但其效果并不明显, 而中医辨证分型治疗则包含了痰热壅肺型和痰湿壅肺型[10]。中医学上认为该病症的诱因为肺在上焦, 主气, 而心则主血, 导致患者的气血不舒畅而出现瘀证。传统认为, 在慢阻肺急性加重期, 患者表现咳、 痰、喘症状明显, 辨证以邪实为主, 稳定期的患者咳嗽、咳痰、气短症状稳定或轻微, 则以正虚为主。正气亏虚, 则津聚为痰, 血停为瘀。痰瘀互结, 则阻于气道, 不但使疾病缠绵, 更易耗损正气。故气阳亏虚是COPD产生的前提; 痰瘀是COPD的病理因素, 痰瘀互结是COPD加重的主要病机。李伟国[11]证明采用中医辨证治疗慢性阻塞性肺疾病合并呼吸衰竭患者的临床效果显著, 值得推广及应用。
2. 1三七皂甙Rb1对COPD可抑制炎症反应并改善通气功能
张杰根等[12]研究证明三七总皂苷可改善慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者的临床症状。三七皂甙有良好的抑制炎性反应和抗感染治疗作用; 亦能改善低氧, 减轻二氧化碳潴留, 从而改善患者气道通气功能。
2. 2 COPD患者的病理生理变化
De-Luca等[13]研究发现COPD患者典型的病理表现为小叶中央型肺气肿, 肺脏线粒体结构破坏的主要机制被认为是炎症介质导致的肺脏线粒体的结构和功能的改变以及细胞因子网络紊乱的重要因素。肺脏线粒体呼吸链的电子传递是由5个酶复合体组成的, 呼吸链复合体Ⅰ ~ Ⅳ被称为线粒体电子的传递体, 并进行电子传递到线粒体内膜外的功能。呼吸链复合体Ⅳ是线粒体电子传递链的末端转移酶, 也是氧化磷酸化的限速酶[14]。当质子顺梯度经复合体Ⅴ ( ATP合酶) F0部分回流时, 其F1部分催化ADP和Pi并生成ATP, 因此得出ATP合酶可直接反应线粒体的呼吸功能[15]。巨噬细胞激活是炎症反应的重要环节, 脂多糖 ( lipopolysaccharide, LPS) 等激活巨噬细胞后在酶的催化下产生过量的NO, 可介导炎症反应, 促进肺组织的炎性渗出及肺泡的损伤[16]。
2. 3 COPD肺线粒体的损害
刘鹏年等[5]观察到COPD大鼠线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性明显下降, 这表明COPD不仅对以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物的呼吸链起始端有作用, 还对呼吸链的限速酶复合物Ⅳ 亦有明显影响作用 ( P < 0. 01) 。由于线粒体电子传递体的功能下降, 不能建立有效的质子跨膜梯度, 因此ATP的生成减少; 同时也观察到直接反应线粒体呼吸功能的ATP合酶活性的下降, 可进一步使ATP生成减少, 从而加重了肺脏线粒体的损害。
2. 4三七皂甙Rb1对COPD的保护作用
研究发现, 应用三七皂甙Rb1可以明显增高 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ呼吸链复合物的活性, 对COPD肺线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ起到显著的保护作用, 加有利于肺线粒体结构和功能的恢复[5]。 因此, 三七皂甙Rb1可通过保护大鼠肺脏线粒体结构与功能而起到防治COPD的作用。祁燕等[2]研究证实三七总皂甙通过下调一氧化碳、转化生长因子、基质金属蛋白酶-9的表达, 抑制巨噬细胞的炎症反应, 对慢性阻塞性肺疾病起到了预防和保护的作用。
3三七皂甙Rb1对肺纤维化的作用机制
肺纤维化是以肺纤维细胞增殖为特征的病变, 病理改变为弥漫性肺间质性疾病, 可导致呼吸功能永久性丧失。有关数据显示, 特发性肺纤维化患者的5年存活率不超过50%[17]。确切发病机制不详, 随着人们生活环境的改变, 肺纤维化的发病率呈逐年升高的趋势。研究证实肺部炎症的各种损伤可出现肺纤维化、肺功能丧失, 患者可表现为缺氧、酸中毒等症状, 随着病情的恶化患者最终因呼吸功能的丧失而导致死亡。临床治疗多以糖皮质激素作为肺纤维化的常规疗法, 因糖皮质激素长期使用不良反应较大, 且目前临床无理想的药物及治疗方法, 更多的临床医师认为中医治疗肺纤维化有较好的疗效。
3. 1肺间质纤维化病理特点
肺间质性纤维化病变早期的病理特点为肺泡炎、肺泡上皮细胞破坏以及基底膜的损伤, 其发病可能涉及肺泡上皮细胞损伤、免疫系统机制以及细胞因子的网络失调。细胞间黏附分子-1 ( intercellu- lar cell adhesion molecule-1, ICAM-1 ) 为重要的促炎症因子, ICAM-1能促进炎性细胞由血循环进入炎症病变区域, 与T淋巴细胞上的淋巴细胞功能相关抗原-1相结合, 为T淋巴细胞活化提供所需要的刺激信号, 从而加重炎症反应[18]。研究表明, MMP为组织重塑的关键酶, 肺间质性纤维化早期MMP-9的作用较为显著, 是由中性粒细胞、巨噬细胞以及支气管上皮细胞发生炎症变化而渗出的, 可引起肺泡上皮细胞以及基底膜的损伤, 以利于成纤维细胞浸入肺泡间隔[19]。TGF-β1是目前最重要的致纤维化因子, 它的激活介导了多种组织纤维化。TGF-β1主要作用于胶原的转录和翻译过程, 能够促进细胞外基质的形成和沉积; 同时还能够促进肺成纤维细胞增殖, 上调MMP-9水平可导致弥漫性肺纤维化, 而MMP-9能够水解剪切TGF-β1潜在的非活性形式, 激活TGF-β1。因而, 细胞因子、生长因子和MMP的互相活化、相互作用是肺泡炎与肺间质纤维化形成的中心环节。李丽娜等[20]认为气虚血瘀是肺纤维化的重要发病机制。
3. 2三七皂甙Rb1具有抗纤维化作用
三七是中国名贵的中药材之一, 其味甘, 性温, 归肝、胃经, 主要功效为止血化瘀、活血定痛。 古代多用于治疗各种出血及跌打损伤, 现代临床多用于心、脑血管疾病的治疗。三七总皂甙是三七的主要有效成分, 三七皂甙Rb1是三七总皂甙的代表成分之一, 具有抗肺纤维化等作用, 可抑制肺纤维化大鼠肺组织中胶原沉积以及TGF-β1的异常升高、结缔组织生长因子的增多, 抑制Smad2 / 3的表达[21]。黄成亮等[22]研究发现肺纤维化大鼠模型在应用三七总皂甙和甲基波尼松龙治疗后显示, 两组大鼠肺纤维化程度明显减轻, 肺组织胶原含量明显降低、单核细胞趋化蛋白含量恢复至正常水平。孙晓芳等[23]研究发现三七总皂甙对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化有一定防治作用, 机制可能与上调肺组织蛋白酶K表达有关。动物试验也已证实三七能够改善肝脏的微循环, 减轻炎症反应, 抑制肝星状细胞的增殖以及I、Ⅲ型胶原的合成, 对抗肝纤维化具有一定的作用[24]; 三七皂甙抗肺纤维化作用机理可能与通过调节肺组织蛋白酶的活性, 抑制肺上皮的凋亡, 促进成纤维细胞凋亡的作用来实现的[25,26]。因此, 三七皂甙Rb1可以作为临床上治疗和防治肺纤维化的新方法, 值得进一步深入研究。
3. 3肺纤维化的中医病机及治疗
张炜等[27]认为, 肺纤维化多因“重亡津液”, 伤津则阴虚, 阴虚则生内热, 内热灼上焦, 气逆则咳, 久咳则肺气痿弱不振, 形成肺痿; 宋建平等[28]认为, 该病与风湿邪气痹阻肺络有关, 肺肾虚弱, 风湿等邪入中, 邪气痹阻胸中, 肺因痹而痿。治疗以清肺、 养阴、润肺燥、止咳为主, 三七皂甙具有抗脂质过氧化作用, 改善肺部微循环; 抑制炎症细胞的渗出, 减少细胞因子的产生和释放; 抑制肺纤维细胞增殖, 减少胶原的合成, 抑制肺纤维化的作用。
4三七皂甙Rb1对肺动脉高压的作用机制
肺动脉高压是以肺血管阻力进行性升高以及血管重构为特征的心肺血管疾病, 是慢性阻塞性肺病发病过程的中心环节, 其主要病理改变为肺血管收缩和肺血管结构的重塑, 进而导致右心功能衰竭甚至死亡, 其严重影响慢性阻塞性肺疾病和肺心病的病程变化及预后。
4. 1肺动脉高压与神经体液的关系
杨小晖等[29]用自制的常压低氧舱, 模拟了慢性低氧状态。成功制造出慢性低氧性肺动脉高压动物模型。研究证实缺氧性肺动脉高压发病与许多神经体液因素调节有关。PNS是钙离子拮抗剂。研究显示, PNS对动脉损伤后血管平滑肌细胞增生具有抑制作用, 并能够通过抑制ERKl/2和p38MAPK通路活性从而减轻肺动脉高压的程度[30]。
4. 2三七皂甙Rb1对肺动脉高压的作用
中医治疗原发性肺动脉高压症时“重在治肺、 兼调心肝”, 治法以泻肺开郁、消痰化瘀为主, 并辅以通阳化气、疏肝理气。三七具有散瘀止血, 消肿定痛的作用, 其具有止血不留瘀的特征, 为活血化瘀的圣药之一。研究发现, 三七皂甙主要成分单体Rb1, 具有相似或相近作用[31]。宋张娟等[32]研究证明三七皂甙单体Rb1, 可能通过抑制ERK 1 /2通路减轻低氧高二氧化碳性肺动脉收缩。刘晓静等[33]研究发现, 在西医治疗的基础上, 联合中药气血并调、痰瘀同治的方法, 能够提高治疗肺动脉高压的疗效, 改善临床症状, 降低肺动脉高压, 提高患者的生活质量的。
5结语
肺系疾病是一种可防、可治的临床常见病及多发病, 目前临床治疗多选用糖皮质激素、免疫抑制剂、支气管舒张药等药物, 但长期使用可能引起毒副作用, 对患者的生存率及生活质量无明显改善。 鉴于中药的疗效稳定, 不良反应小, 且不容易产生药物依赖, 因此被临床医师广泛应用。三七皂甙Rb1作为中药在肺纤维化、肺癌、慢性阻塞性肺病等肺系疾病的治疗中发挥了重要作用。三七皂甙Rb1影响肺系疾病发生发展的作用机制主要与肺线粒体膜的流动性、PLA2和COX-2、s PLA2的活性等有关, 因而能够抑制炎性细胞渗出与趋化, 减少细胞因子产生和释放。综上, 三七皂甙Rb1可作为药物治疗肺系疾病的潜在靶点, 这为肺系疾病的治疗提供了新的思路, 但其作用机制仍需要进一步的实验研究, 作用效果也需要继续优化, 以期为今后在临床治疗上提供更加有力的理论依据。
摘要：三七总皂甙是中药三七的主要成分之一, 三七皂甙Rb1又是其代表成分。大量研究证实, 三七皂甙Rb1表达的高低与呼吸衰竭、慢性阻塞性肺病、肺纤维化等肺系疾病的发生及发展密切相关, 其作用机理多为三七皂甙Rbl通过抑制分泌性磷脂酶A2 (secretory phospholipase A2, s PLA2) 、磷脂酶A2 (phospholipase A2, PLA2) 、细胞色素氧化酶 (eytochrome oxi-dase, COX-2) 的活性, 对呼吸衰竭起到保护作用。三七皂甙Rb1还可以通过保护肺脏线粒体结构与功能而起到防治慢性阻塞性肺病 (chronic obstructive pulmonary diseases, COPD) 的作用。同时, 有研究显示, 三七皂甙Rb1抗肺纤维化作用机理可能与抑制肺组织蛋白酶的活性有关。由此可见, 三七皂甙Rb1在临床治疗中具有广阔的前景, 值得进一步研究, 以便为中医治疗肺系疾病提供更好的临床思路。
三七皂甙Rg1 篇3
1 仪器与试药
1.1 仪器
DIONEX SUMMIT高效液相色谱仪(配有PDA-100检测器、UVD170U检测器、STH585柱温箱、P680 HPLC泵、ASI-100自动进样器),Chromeleon色谱工作站,KQ3200DE型医用数控超声仪(300W,昆山市超声仪有限公司),实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)。
1.2 材料
复方消脂胶囊3批(批号为20100712、20100714、20100716),由湛江市妇幼保健院药剂科制剂室提供。三七皂苷R1(批号:110745-200313)、人参皂苷Rg1(批号:110703-200322)、人参皂苷Re(批号:0754-9911)、人参皂苷Rb1(批号:110704-200318),由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯试剂,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Phenomenex Luna C18(2) (4.6mm×250mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表1进行梯度洗脱;柱温:27℃(70min时降为20℃);检测波长:203nm;流速:1.0mL·min-1,理论塔板数都应不低于6 000。
2.2 对照品溶液的制备
分别称取三七皂苷R1对照品1.88mg、人参皂苷Rg1对照品9.4mg、人参皂苷Re对照品1.47mg、人参皂苷Rb1对照品8.8mg,置10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得每1mL含三七皂苷R10.188mg、人参皂苷Rg10.94mg、人参皂苷Re 0.147mg、人参皂苷Rb1 0.88mg的混合溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取复方消脂胶囊(批号:20100712)内容物,研细,取约1.0 g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇100mL,加热索氏提取回流4h,用少量甲醇分次洗涤药渣及容器,合并提取液与洗液,蒸干,残渣加水30mL使溶解,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm,柱高8cm),用水150mL洗脱,弃去洗脱液,再用0.1%氢氧化钠溶液150mL洗脱,弃去洗脱液,继用水150mL洗至中性,最后用90%乙醇100mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
2.4 专属性考察试验
按处方比例制成三七阴性样品,照“2.3”项下方法制备三七阴性对照溶液,精密吸取阴性对照溶液10μL,测定,结果阴性对照液在三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品相同保留时间位置上均未见干扰,见图1。
2.5 线性范围的考察
精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12μL进行色谱测定,按上述色谱条件测定峰面积,并以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归。结果见表2、表3。
2.6 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液10μL重复进样6次,测得峰面积积分值RSD<2%,结果见表4,结果表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
取上述供试品溶液10μL,按上述色谱条件间隔一定时间测定6次,结果见表5,结果表明样品在24h内稳定。
2.8 重复性试验
按拟定的含量测定方法,对同一批样品(批号:20100712)平行制备6份供试品溶液,测得峰面积并计算含量,RSD<3%,结果见表6。
2.9 回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品(批号:20100712)0.5g,分别精密加入一定量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品,按供试品溶液制备项下操作,平行操作6份,按上述色谱条件测定含量,计算回收率,结果见表7。
2.10 样品测定
取批号为(20100712,20100714,20100716)样品,按供试品溶液制备项下方法制得供试品溶液。分别吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μL,依次注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,结果见表8。
3讨论
3.1分离纯化方法的选择
据文献报道,刘中秋等[3]研究了大孔吸附树脂富集纯化三七总皂苷的工艺,结果表明D101型大孔吸附树脂对三七中皂苷类成分具有吸附快,解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、再生简便特点。经过预试验,该法能较好分离出三七中的皂苷类成分。进一步用高效液相色谱法对其进行含量测定,结果表明该法可富集样品中的三七皂苷类成分,且可使其与复方消脂胶囊中的其他成分有效分离。
3.2高效液相色谱条件的选择
人参皂苷Rg1和人参皂苷Re结构相似,极性相当,C18柱对二者吸附能力相当,先后以邸峰等[4,5,6,7]报道的三七总皂苷高效液相色谱法含量测定的色谱条件进行检测,结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Re未能达到基线分离。以药典法的色谱条件测定复方消脂胶囊中人参皂苷Rg1、Rb1、Re及三七皂苷R1成分,结果人参皂苷Rg1、Re分离效果良好,分离度大于1.5,但人参皂苷Re和三七皂苷R1未能达到基线分离。参考相关文献[8,9],在人参皂苷Re和三七皂苷R1出峰时间附近降低洗脱陡度而改进色谱条件,经多次改进,以本方法中的色谱条件进行检测,人参皂苷Rg1、Rb1、Re及三七皂苷R1均得到良好分离,分离度均大于1.5。
参考文献
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