冷冻方法

冷冻方法（精选十篇）

冷冻方法 篇1

1 测温原理及其电路

1.1 测温原理

将2种不同材料的导体或半导体A和B焊接起来,焊接的一端称为热端,另一端称为冷端,与仪表相连构成一个闭合回路。当导体A和B的2个执着点之间存在温差时,两者之间便产生电动势,因而在回路中形成一个大小的电流,这种现象称为热电效应。热电偶就是利用这一效应来工作的。

在低温冷冻治疗仪的研究中,常用热电偶冷端补偿方法测量冷冻探头温度,而实际应用中,热电偶输出与温度呈非线性关系,随着计算机性能的提高,通过查表或曲线拟合等方法很容易实时解决热电偶输出的非线性问题,但热电偶的温度补偿引起的误差,极大地影响温度测量的精确。作者尝试使用AD595芯片,解决了上述问题。

1.2 AD595的结构与特点

选用带冷端补偿的单片热电偶放大器AD595, AD595具有热电偶信号放大和冰点补偿双重功能,低阻抗电压温度线性输出(10 mV/℃), AD595适用于K型热电偶,是14脚DIP封装。AD595的原理框图如图1 所示,各脚功能如表1 所示。

1.3 测温电路

温度测量电路的原理框图如图2所示,热电偶封装在冷冻治疗用的探头中,测温探针感知病灶中的治疗温度,通过测温电路把温度变化转化为电压变化,电压经AD595热电偶放大器放大和冷端补偿后,经低通滤波,低通滤波目的是消除外界干扰,并有较好的带负载能力,然后信号接入C8051F020单片机中,利用单片机对信号进行处理、控制,采用液晶显示器(LCD)显示探头温度和温度升降曲线,温度冷冻过程直观明了。AD595与热电偶组成测温电路接线方式如图 3 所示,低温冷冻治疗仪使用二氧化碳作为冷冻制冷剂,测量温度范围是-76～+40 ℃; 分辨率:±0.5 ℃;误差:±1 ℃,电路电源采用±5 V双电源供电。

2 实验结果

为实现10 mV/℃线性输出以及进行准确的补偿,AD595经激光修整预调,能在25 ℃时准确匹配K型热电偶的传输特征,在25 ℃时K型热电偶有40.44 μV/℃的温度系数,因而AD595的增益必须为247.3(10 mV/℃/40.44 μV/℃=247.3)。另外,由于激光修整引入11 μV的静态电位到输出放大器,因此AD595真实输出为:

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从而:

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式中:V0为AD595输出电压;Vk为热电偶输出电压。

由式(1),(2)及K型热电偶分度表所测温度对应的V0,Vk值见表2。表中AD595分度输出电压V0由(1)式计算,AD595实际输出电压V0由AD595第9针输出实测电压值。

用以上方式测量温度时,采用间接试验的方法。因测温必须提供准确的温度环境,但实现任一温度值均恒定,必须有一台专门的设备,使用不方便且设备费用昂贵,而分度量反应了热电偶的外部特性,每一温度值对应一定的电压输出。故实验采用直流电位差计给AD595输入标准电压,模拟热电偶输出以代替实际的被测温度。

3 误差分析

为了提高仪器的温度测量精度,必需分析仪器误差主要来源,通过分析,可知仪器的主要误差来自于热电偶和单片机系统带来的误差,用热电偶测量温度时,一般要经过一段时间才能测得温度,但实事并不是这样,各种各样的因素影响温度测量的准确度,因此引起的误差主要有5个方面:热电偶的分度引起的误差;热电偶固有特性引起的误差;测量过程中引起的误差;环境影响的误差;单片机系统带来的误差。

4 测量数据处理

热电偶的输出并非线性输出,AD595实现热电偶冷端自动补偿与输出信号放大,但并未完成热电偶输出线性校正,故对测温输出采用软件校正的方法进行数据处理。由于实际的热电偶和被测温度之间存在着非线性的关系,因此需要进行非线性校正。

非线性校正又称线性化过程,是智能化测量仪表的一项重要功能。非线性校正的方法有很多,有连续函数拟合、分段直线拟合和查表法等进行非线性校正。本系统的非线性校正采用分段直线拟合法。分段直线拟合是用N条折线来拟合器件的非线性曲线,如图4所示。图中y是被测量,x是测量数据,用三段直线来逼近器件的非线性曲线。

直线由下列方程描述:

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采用分段直线拟合方法,即用几条非常逼近的折线来拟合探头响应曲线的非线性,系数a,b可由下式决定:

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在实际应用中,预先把每段直线方程的系数及测量数据x0,x1,x2,…存于内存储器中。单片机进行校正时,先根据测量值的大小,找到合适的校正直线段,从存储器中取出该直线段的系数,然后计算直线方程式(1),就可获得实际被测量y。

5 讨 论

采用单片机C8051F020控制芯片实现温度实时测量、温度升降曲线显示,线路简单、数值精确。用软件实现非线性校正,并且系统有串行通信接口,可将数据输出,便于统计和数据分析。测量电路结构简单,成本较低,具有较强的实用性。

参考文献

[1]章崧英,王泽时,郑斯涌.实用低温医学[M].北京:科学出版社,1994.

[2]刘金刚,刘作斌.低温医学[M].北京:人民卫生出版社,1993.

[3]Dobak J D,Ryba E,Kovalcheck S.A New Closed-loop Cryo-surgical Device for Endometrial Ablation[J].Am AssocCynecol Laparose,2000,7(2):245-249.

[4]钱进.热电偶温度传感器冷端补偿和信号线性化[J].长江工程职业技术学院学报,2004(2):32-34.

[5]陈浩,邓忠华,余红梅.热电偶测温系统原理及应用[J].制造业自动化,2004(9):68-71.

[6]姜忠良,陈秀云.温度的测量与控制[M].北京:清华大学出版社,2005.

冷冻方法 篇2

现实生活中，我们常见到的用冷库、冰箱处理的食品，冷冻的时间往往要90分钟，叫缓冻食品。

速冻食品和缓冻食品的差别在于速冻食品的细胞更不易变形，食品组织中的水分、汁液不流失。速冻处理避免了缓冻食品长时间冻结过程中造成的食品品质下降。

速冻食品的生产、加工、运输、销售过程对温度有着严格的要求，必须保持在零下18度进行。因为只有在零下18度以下，细菌和各种酶才会处于完全的抑制状态，防止食品变质，保持食品原有的新鲜度和营养成分不流失。

营养专家认为，速冻食品除了保持传统小吃的风味外，在保持营养方面，目前来讲是最好的，与其他储藏食品的方式比较，除蛋白质、脂肪不会有变化外，包括微量元素、常量元素、维生素都会保留。

冷冻方法 篇3

材料与方法

脐带血的采集：无菌条件下，将新生儿已经结扎的脐带进行脐静脉穿刺，取脐带血。

冷冻保护剂：取DMSO缓慢加入1640液中摇匀，配成含20%DMSO的1640保护液。

细胞分离液：①6%右旋糖酐：分子量20～30万。②泛影葡胺聚蔗糖淋巴细胞分离液：比重1.007。

分离：Ⅰ：离心法。Ⅱ：沉降法。Ⅲ：淋巴细胞分离液法。

冻存：样品用程控降温仪降温。降温速率为从4℃到-30℃每分钟1℃，从-30℃到-80℃每分钟3℃。液氮气箱中平衡2小时，放入液氮液箱保存。

复温：40℃水浴快速复温。

检测：单个核细胞计数，台盼兰拒染率，GM-CFUC培养。以上检测均用常规方法。

结 果

3种分离方法分离的脐带血造血干细胞冻前的台盼兰拒据染率及冻存后的核细胞分离液法的有核细胞回收率分别是：90.4±3.8%（Ⅰ），90.6±3.3%（Ⅱ），85.4±3.4%（Ⅲ）。检验表明，Ⅲ组的有核细胞回收率低于Ⅰ组（P<0.05）和Ⅱ组（P＜0.05）。冻存前台盼兰拒染率分别是：Ⅰ组98.2±0.8%、Ⅱ组97.9±0.8%、Ⅲ组98.2±0.9%，3组比较亦无显著差别。

GM-CFU-C回收率分别是：Ⅰ组80.5%，Ⅱ组81.6%，Ⅲ组61.2%。Ⅲ组的GM-CFU-C回收率低于Ⅰ组和Ⅱ组（P＜0.05）。

讨 论

冷冻方法 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

临床各科室送检的新鲜组织标本共425例, 其中乳腺组织168例, 甲状腺组织91例, 皮肤组织72例, 卵巢组织34例, 淋巴结9例, 肺组织5例, 子宫肿瘤36例, 其他10例。

1.2 方法

冰冻切片法, 快速染色法及其观察法。

2 结果

425例切片完好的231例, 占54.36%;出现质量问题的切片194例, 占45.64%。其中, 切片不完整82例, 占19.29%;切片卷缩或皱缩65例, 占15.29%;切片脱落8例, 占1.88%;切片染色质量差39例, 占9.18%。

3 讨论

3.1 切片不完整的原因及其处理方法

切片不完整主要表现有切片形成冰晶、切片破碎、切片组织块脱落以及切片组织块过大或偏位等四种状况。

3.1.1 形成冰晶。

导致形成冰晶的主要原因, 一是切块组织本身含有过多水分, 如组织细胞水肿, 淋巴结, 纵隔肿瘤, 卵巢肿瘤最易形成冰晶;二是送检取材过程中接触水源, 如将送检组织浸入酒精、生理盐水或用湿透的纱布包裹;三是速冻过程中使用的液氮时间控制不好。其解决方法为, 对于本身含有较多水分的切片标本, 要用干纱布吸干表面水分, 再进行冷冻。取材时尽量避开水源, 因冰冻技术只能驱除切片组织表面的热量, 因此切片组织块的厚度不要超过0.3 cm;送检时要将组织放在拧干的盐水纱布内, 以最快速度送达病理科[1]。使用液氮时, 时间一定要严格控制, 保证一次冻透标本, 操作者的动作要做到熟练利落。做好上述三点, 方可避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。

3.1.2 切片破碎或呈粉末状。

切片出现破碎或呈粉末状的问题, 就不能制作出一张完整的切片, 这是由于组织冷冻过度造成的。此外, 在配合使用液氮时, 如果液氮量不足, 或者组织块放入液氮时不能保持水平状态, 也会出现上述情况。解决方法主要是要求病理技术人员工作认真, 仔细观察, 掌握冷冻温度, 将冻头的温度控制在-25~-30℃左右;掌握液氮量在合适的水平, 放入组织块时严格按照操作要求, 保持水平状态。值得注意的是, 在防止过度冷冻的同时, 也要防止冷冻不够, 因为冻头的温度达不到要求时, 组织很快回软, 也不能保证切片的完整。

3.1.3 组织块脱落。

引起组织块脱落的原因一是冻头上的包埋胶冲洗不干净;二是冻头在冷冻机内放置时间过长, 导致包埋胶提前凝固, 不能渗透到冻头的底部, 从而造成包埋胶与冻头粘连不紧, 稍遇外力作用即脱落[2]。技术人员应该针对上述情况, 做好预防工作。

3.1.4 组织块过大或组织块偏位。

因为冷冻头的大小是固定的, 冷冻切片刀在冷冻机中的移动范围也是有限的, 因此, 如果超出其范围, 切片也会不完整。解决这些问题的方法, 首先是让切片组织块大小适宜, 将切片的长宽和厚度控制在2 cm×2 cm×0.2 cm~0.3 cm为宜;其次, 冷冻组织块一定要平放在冷冻头的正中央, 带有皮肤和包膜的组织, 皮肤和包膜的方向应朝上或与切片刀垂直。

3.2 切片卷缩或皱缩的的原因及其处理方法

造成切片卷缩或皱缩的原因较为复杂, 常见的有:刀锋变钝, 防卷板粘有异物, 防卷板位置不正确, 以及静电或者气流作用、防卷板温度高等。可采用以下方法预防和处理:首先, 操作的病理技术员在切片前要注意检查刀具, 选择锋利的切片刀, 平时则要勤磨刀和勤换刀口, 保持切片刀的锋利。其次, 切片机要勤保养, 保持防卷板的清洁, 每做完1例冷冻切片, 都要做好刀口及防卷板的清洁工作, 防止切片污染和皱缩, 保持切片机的最佳状态[3]。再次, 切片前要观察和调整刀片、防卷板的位置, 将磨面作为与切片的接触面, 其边缘应与切片刀边缘保持平行。此外, 还要采取相应措施去除静电和防止气流影响, 操作者在切片时必须戴上口罩, 不能让呼出的气流直接吹到防卷板上;如果切片时间过长, 则要暂停一会儿, 避免防卷板温度过高。

3.3 切片脱落的原因及其处理方法

冷冻切片能够粘贴在玻片上, 运用的是温度差的原理, 有如下几种情况下可影响切片粘贴的牢固程度, 而导致切片脱落。最常见的原因有固定液浓度太低, 载玻片不清洁, 切片太厚;另外, 组织内含过多的坏死组织, 也容易发生脱落。常用的预防及处理方法: (1) 及时更换固定液, 确保固定液浓度达到需要的指标。一般情况下每周更换1次, 例数较多时, 可增加到每周2~3次。 (2) 保持载玻片清洁或使用免洗玻片, 平时要盖好玻片, 不要让玻片被灰尘或其他异物污染。如果新的玻片上有灰尘, 一定要先洗涤后才使用。 (3) 掌握好切片的厚度, 切片厚度一般在5μm~7μm较为合适 (脂肪组织可稍为厚些) 。 (4) 避免过多的坏死组织, 延长固定时间, 用酒精灯适当烤一烤, 增加组织与玻片的粘贴牢固度。

3.4 切片染色质量差的原因及其处理方法

染色时间过长, 新配制的染色液分化不佳或返蓝时间不够是染色差的常见原因。处理方法:细胞核的染色是切片染色最为关键的环节, 在寒冷的冬季, 室温过低容易影响核的着色, 适当加温可以帮助增色;经常观察染液的p H值, 过碱时应及时更换, 保持染液的酸碱度在适宜范围;盐酸酒精分化也要适度, 控制好时间, 一般分化时间5 s~10 s为宜, 否则易造成核着色不佳, 染色质不清晰, 影响诊断的准确性。

影响冷冻切片质量的因素是多方面的, 要想制作出高质量的冷冻切片, 需要刻苦钻研业务技术, 不断总结和探索, 对技术精益求精, 才能为病理学科的诊断制作出高质量的冷冻切片。

参考文献

[1]陈乐真.手术中病理诊断[M].北京:人民军医出版社, 1994:5.

[2]张建国.一种新冰冻切片制片方法[J].临床与实践病理学杂志, 2008, 98 (23) :54.

冷冻整改方案 篇5

冷冻安全隐患整改方案

荣昌县技术监督局特种设备科：

2013年6月6日贵局特种设备科的各位领导亲临我司进行冷库安全专项检查，对冷库的制冷设备基本情况及现场情况做了详细检查工作，发现我司冷冻制冷设备存在以下重大安全隐患：1.压力容器未到贵局注册；2.压力容器未检验；3.压力管道未注册未检验；4.特种设备操作人员无证；5.压力表、安全阀超期检验。针对贵局提出的问题，我公司于2013年6月22日“关于整改冷库存在严重安全隐患进行了专题讨论”，提出了整改措施并认真细致的分析研究，从本公司实际出发，制定了以下方案并按期实施整改：因本公司现有的冷库是1995年由荣昌县棉麻土产食品公司制造，2003年由我公司接手经过对冷库维修和维护续继使用，但由于制冷设备老化腐蚀严重，维修、改造压力容器及管道经检验各项指标难以达到安全标准，顾我公司决定投资20万元另建一坐约60㎡、库容约50吨用氟代替用氨的冷库。而现有的冷库已于2013年6月22日停止使用并作报废处理，新的冷库预约在下月中旬能完成，希望本公司的制冷系统（制冷设备）能尽快进行正常运转，消除安全隐患，达到安全生产的要求。鉴于本事件的发生给贵局的领导们带来的不便，在此表示深深的歉意。同时也万分感谢各位领导为我司的发展提出了如此宝贵的意见，也希望在今后的日子中，给予我们更多的支持与指导，谢谢！

重庆市怀乡食品有限责任公司

冷冻精子，福兮？祸兮？ 篇6

很多的媒体介绍过这样一个特殊事件：20岁的以色列士兵凯文·可汉于2002年不幸阵亡。他死后不到24小时，母亲拉切尔就将其遗体内的精子取出冷藏，试图用亡儿的冷冻精子人工受孕生一名孙子，从而完成儿子的遗愿。然而，这一要求却遭到了以色列司法机构的拒绝。凯文一家的举动甚至惊动了前总理沙龙。今年年初，经过5年漫长的"精子大战"后，法庭终于破天荒批准了这位母亲的请求。慈善机构将会寻找一位合格的女性作为代孕母亲，如一切顺利，这名“冷冻婴儿”有望在2007年底诞生。

作为东北地区最早成立的辅助生殖技术开展的医疗机构，我中心早在1993年就掌握了精子冷冻技术，一般情况下，精子不会放入普通冰柜中冷冻，因为这样精子会在解冻后死亡，其中的基因也会被破坏。目前所使用的冷冻技术都是先将精子浸泡到特殊保存液中，然后放到零下196摄氏度的液氮环境下加以冷冻。

在临床中，更多的患者是以下几种特殊状况才采用自体精子冷冻技术：即将接受辅助生殖技术助孕治疗的患者夫妇（例如夫精自体人工授精、试管婴儿等），因男方在操作当天外出或在国外无法及时就诊的，提前进行精子冷冻；还有一种就是出于生殖保险目的，例如患有白血病等癌症的未育男性，在其接受放、化疗之前，冷冻保存几份精液（放、化疗可能永久损坏生精功能），以期病情稳定后再利用辅助生殖技术解决生育；再有就是重度少精子症的患者可以多次采集精液并冷冻起来，将来可以一起解冻集中后给妻子做人工授精；另外，现在临床上AID（供精人工授精）的精源必须来自国家精子库的冷冻精子，不允许采用新鲜精液给患者治疗（避免性传播疾病的发生）。

在我十多年的临床经历中，有两类状况是难以实施这项手术的，一种是妻子提出请求，要求我们为其刚刚去世的丈夫遗体中提取精子，以便将来实施体外授精技术助孕治疗；另一种是刚刚死亡的单身男性的父母提出申请，要求为儿子提取睾丸内的精子，以期后用。在我们的国家法律明确规定丈夫死亡，夫妻双方的婚姻关系也就自动解除，对于妻子一方就属于单身女性，那么即使是丈夫生前保存的精子也是不可以用来给妻子做人工生殖的。我国的规定是，死亡者可以将精子捐献给他人，供不孕不育的夫妻产生后代，但是却不能给自己的妻子使用。其原因主要是考虑到对出生的孩子的负责。孩子一出生即成长于一个单亲的家庭，对于孩子的健康成长是不利的。另外，使用已故丈夫的冷冻精子获得的子代，从法律上也没有获得父方抚养和继承遗产的权利。至于用亡儿的睾丸精子冷冻，以期将来利用的问题，就像篇头提到的那位母亲的要求，与我国现行的一些法律法规以及伦理也是相悖的。

目前有很多男性从事影响生育力的工作（如接触放射线、有毒物等），即将接受某些损伤生育能力的治疗（如睾丸、附睾手术、放疗、化疗等）有的夫方是遗传患者治病基因携带者；或者男性输精管结扎术后孩子不幸夭折，要恢复生育将有一定的困难。冷冻精子则为我们提供了一项"生殖保险"服务。在冷冻条件下，精液可储存5年、10年或更长的时间，便于随时取用能解决再生育问题，这对计划生育政策的实行起到了促进作用。

但利用冷冻精子完成生殖必须谨慎。因为精子非常敏感，难保存。一般体细胞冷冻后复活，其复活率可达到90%；但精子的复活率最多可达50%。冷冻精子可能会产生这样或那样的问题，或隐含着一些问题。早就有国内外的动物实验提示，冷冻精子孕育的后代会更易受到疾病的困扰。一是精子比较脆弱，二是冷冻过程可能会对精子产生一定的影响或损害。正如一般生物产品，新鲜的肯定比陈旧或冷冻的质量要好。如果不是因为特殊疾病，人类生殖还是应当用自然的方式和新鲜的精子为好。今天我们对冷冻精子形成的生命的认识还刚刚开始，正如克隆动物，的确是成功了，但由于克隆存在的种种问题，致使克隆动物会产生这样或那样的问题，比如早衰。因此，除非特殊情况我们不鼓励人们用这样的方法孕育后代。

冷冻方法 篇7

1 材料与方法

1.1 材料与分组

我院病理科2011年厚度2mm以下的各类囊壁组织40例。每例分别采用传统包埋法 (对照组) 和改良包埋法 (改良组) 制片。

1.2 包埋法

选用普通办公胶水为包埋剂, 甲醇溶液固定, 应用德国原装Leica1950冰冻切片机。传统组将囊壁切成长2 0～3 0 m m, 宽5～1 0 m m条块, 取3～4片置于冷冻头直立包埋。改良组将囊壁组织剪成100mm左右长条状, 用镊子夹住一端, 将囊壁以镊子为中心围成环形, 大头针插入组织固定形状, 取出镊子, 用剪刀将囊壁修剪出合适的高度, 并使组织上下表面平整, 去除大头针后包埋切片。所有切片均由本科副主任医师审阅。制片时间为取材开始至封片结束。

2 结果

两组制片时间均为15分钟, 不影响冷冻切片报告及时性。两种不同包埋方法对菲薄囊壁组织冷冻切片的影响见表1。

由表1可见, 改良组包埋时的组织正常率、镜下上皮完整率均明显高于对照组, 差异有统计学意义。

3 讨论

冷冻切片诊断工作中经常会遇到厚度在2 m m以下的囊壁组织, 一般需了解囊壁全层结构以及内衬上皮细胞的形态、类别等信息, 但由于囊壁菲薄, 难以包埋, 给制片和诊断带来一定的困难。

冷冻方法 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

实验动物家兔由成都中医药大学实验动物中心提供,选择15只4~5月龄健康性成熟雌性家兔,经麻醉后实施双侧卵巢切除术。获得的30只卵巢随机分成新鲜对照组、添加AFPⅢ玻璃化冷冻组和常规玻璃化冷冻组3组,每组10只卵巢。将取下的卵巢立即置于磷酸盐缓冲液(PBS)溶液(4℃)中,在解剖显微镜下去除卵巢髓质,将卵巢皮质切成1 mm×1 mm×1 mm大小片段[8]。

1.2 主要试剂和设备

二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖(S)、Leibovitz-15(L-15)、胎牛血清(FBS)为美国Sigma公司产品;AFPⅢ为加拿大A/F protein inc公司产品;TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品;Live/Dead-Viability/Cytotoxicity Kit试剂盒为荷兰Molecular Probes公司产品;光学显微镜(OLYMPUS,CX31);透射电镜(日立,H7650);荧光显微镜(Leica,DM1000)。

1.3 卵巢组织玻璃化冷冻和解冻

玻璃化冷冻和解冻方法采用Hasegawa报道的方法[9],将备好的卵巢片段放入预冷(4℃)的玻璃化冷冻平衡液(7.5%EG+7.5%DMSO+20%FBS)中平衡15分钟,再置入玻璃化冷冻保护剂中(常规玻璃化冷冻组:15%EG+15%DMSO+20%FBS+0.5 mol/L S;添加AFPⅢ玻璃化冷冻组:在以上基础上添加500 ng/ml AFPⅢ,冷冻30分钟,将卵巢片段转入含有冷冻保护剂的冷冻管中,迅速投入液氮中。1周后解冻卵巢组织,将冷冻管从液氮中取出,室温停留1分钟气融后,置入37℃的水浴中轻摇至冰融解(约2~3分钟),将片段从冷冻管中取出,依次经过含蔗糖浓度梯度递减的解融液。

1.4 卵巢组织的组织学检测

采用4%的多聚甲醛固定,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明、石蜡包埋,5μm切片,苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察卵巢组织结构,卵泡形态,计数正常卵泡和形态改变卵泡比例。按照Gougeon[10]的卵泡分级标准进行分级。卵泡形态学缺陷分型按照Neto等[11]的分型标准进行判定。

1.5 卵巢组织超微结构分析

卵巢组织采用2.5%戊二醛固定,按照电镜标本制备切片,透射电镜下观察卵母细胞、颗粒细胞、间质细胞等细胞结构和形态,并观察细胞内线粒体、内质网、高尔基体等细胞器的变化情况。

1.6 卵巢组织内卵母细胞凋亡情况

采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法—TUNEL法来观察卵母细胞的凋亡情况。卵巢组织采用4%多聚甲醛固定,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明及石蜡包埋,5μm切片,常规脱蜡。实验步骤严格按照TUNEL试剂盒的说明书操作,切片在光学显微镜下观察,凋亡卵泡为卵母细胞核呈棕黄色或棕褐色,背景呈紫蓝色,按照常规方法进行卵泡计数,为避免重复计数,以卵母细胞核为标记,分别记录卵母细胞总数和凋亡卵母细胞数,并计算卵母细胞凋亡率。

1.7 卵泡分离及活力测试

采用酶-机械法分离出窦前卵泡,孵育后利用卵泡活力测试试剂盒测定卵泡活力,计数复苏后卵泡总数及存活卵泡数,计算卵泡存活百分比。实验步骤严格按照Live/Dead-Viability/Cytotoxicity Kit(L-3224)说明书操作,染色后在共聚焦显微镜下观察并拍照。卵泡活力判定,根据死亡颗粒细胞的比例将卵泡分为4类[12]:完全正常卵泡、轻度损伤卵泡、中重度损伤卵泡和死亡卵泡。结果判定,将前两类认为活卵泡,余为死亡卵泡。

1.8 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析,各组率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组卵巢组织形态学变化

新鲜卵巢组(见图1A)皮质内可见间质细胞紧密包裹大量卵泡,卵泡结构完整、形态规则,颗粒细胞形态大小规则,与基底膜连接紧密,间质细胞排列规整。添加AFPⅢ玻璃化冷冻组(见图1B)卵巢组织间质细胞排列较规则,有少许裂隙形成,可见形态正常的各级卵泡和少许形态异常的卵泡。常规玻璃化冷冻组(见图1C)卵巢组织间质细胞排列紊乱,连接疏松,明显裂隙形成。可见较多形态异常的卵泡,主要表现为卵泡形态不规则,颗粒细胞与基底膜分离、卵泡皱缩、核深染和胞浆空泡等变化。

2.2 不同冷冻方法对卵巢组织的组织学结构影响

新鲜卵巢组卵巢组织的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡形态正常率均显著高于添加AFPⅢ玻璃化冷冻组和常规玻璃化冷冻组(P<0.01);添加AFPⅢ玻璃化冷冻组各级卵泡形态正常率均显著高于常规玻璃化冷冻组(P<0.01)。新鲜卵巢组组内比较各级卵泡形态正常率无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05);添加AFPⅢ玻璃化冷冻组内次级卵泡形态正常率低于原始卵泡和初级卵泡,差异有统计学意义(P<0.01),而原始卵泡与初级卵泡形态正常率比较,差异无统计学意义(P>0.05);常规玻璃化冷冻组原始卵泡形态正常率高于初级卵泡和次级卵泡形态正常率,差异有统计学意义(P<0.01),而初级卵泡与次级卵泡形态正常率无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

(AT:卵巢组织中白膜;E:卵巢上皮;CT:卵巢皮质;OM:卵巢髓质;POF:原始卵泡;PF:初级卵泡;SOF:次级卵泡;GC:卵泡的颗粒细胞;BM:基底膜;TC:卵泡膜细胞;O:卵母细胞;ZP:透明带;白色箭头:异常卵泡)

2.3 各组卵巢组织的超微结构变化

新鲜卵巢组卵巢组织内可见卵母细胞被颗粒细胞包围,颗粒细胞胞膜清晰,细胞间连接紧密;卵母细胞形态规则、边界清楚,核内染色质均匀,核仁明显,核膜间隙规整,胞内线粒体丰富,形态正常,内质网及高尔基体形态正常(见图2A)。添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵巢组织内颗粒细胞稍显肿胀,但胞膜仍清晰完整,细胞间连接较紧密,卵母细胞形态较规则,边界清楚,核仁清晰,核内染色质较均匀,核膜间隙增宽不明显,线粒体数目较多,形态较规则,可见少量空泡变性及肿胀(见图2B)。常规玻璃化冷冻组颗粒细胞肿胀明显,细胞间连接松散;卵母细胞形态不规则,边界不清,胞质结构混乱,核膜间隙明显增宽,胞内线粒体数量减少,线粒体被推向边缘,明显肿胀,空泡变性,内质网及高尔基体形态不规则,明显肿胀(见图2C)。

2.4 各组卵巢组织中卵母细胞凋亡情况

采用TUNEL分别观察3组卵巢组织中卵母细胞凋亡情况,计算卵母细胞凋亡率。结果新鲜卵巢组卵母细胞凋亡率(12.0%,43/358)显著低于添加AFPⅢ玻璃化冷冻组(25.8%,86/333)和常规玻璃化冷冻组(41.2%,140/340)(P<0.01);添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵母细胞凋亡率低于常规玻璃化冷冻组(P<0.01)。

2.5 各组卵巢组织中卵泡存活率

两冷冻组较新鲜卵巢组所分离出的窦前卵泡数明显减少。将分离出的窦前卵泡经细胞活力鉴别染色后观察各组卵泡活力情况,根据不同损伤程度的卵泡,判定卵泡活力,计算卵泡存活率。结果新鲜卵巢组卵泡存活率明显高于两冷冻组(P<0.01);添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵泡存活率高于常规玻璃化冷冻组(P<0.01)。见表2。

(IT:卵巢间质;POF:原始卵泡;PF:初级卵泡;TC:内卵泡膜细胞;GC:颗粒细胞;BM:基底膜;MI:细胞内线粒体;S:滑面内质网;N:细胞核;K:核膜;L:脂滴)

3 讨论

目前卵巢组织的冷冻方法主要有慢速程序化和玻璃化冷冻法,两种方法用于卵巢组织冷冻均有良好效果[13,14],但无论哪种方法,冷冻过程中造成的细胞内外冰晶形成、渗透压改变、冷冻保护剂毒性等均可导致卵巢组织内部分卵母细胞、颗粒细胞坏死或凋亡,影响复苏后卵泡的发育能力[3]。本研究显示,冷冻组的各级卵泡形态正常率均明显低于新鲜卵巢组,组织学观察发现颗粒细胞排列分散,尤其是常规玻璃化冷冻组中出现明显卵母细胞核深染及胞浆内空泡变性。进一步行卵泡超微结构分析发现,冷冻组卵母细胞和颗粒细胞结构均有不同程度的损伤,细胞内线粒体明显减少。由此说明冷冻过程中对卵巢组织形态学有影响,存在冷冻损伤;而添加AFPⅢ玻璃化冷冻组的各级卵泡形态正常率均明显高于常规玻璃化冷冻组,从形态学方面证明了AFPⅢ可减少各级卵泡的冷冻损伤。此外,本次实验还发现常规玻璃化冷冻组内原始卵泡形态正常率高于初级卵泡和次级卵泡形态正常率,而初级卵泡与次级卵泡形态正常率无明显差别。说明原始卵泡更耐受冷冻过程。这与前人的研究结果一致,可能与大卵泡体积较大、代谢率高,在冷冻过程中脱水不充分,周围颗粒细胞较多且有透明带围绕不利于冷冻保护剂渗透等因素有关[15]。而添加AFPⅢ玻璃化冷冻组内原始卵泡与初级卵泡形态正常率无明显差异,次级卵泡形态正常率低于原始卵泡和初级卵泡。由此说明AFPⅢ可增强初级卵泡冷冻耐受力,提高初级卵泡形态正常率从而增加卵巢储备。

AFPs是一类具有抗冷冻作用的蛋白质,其抗冻特性表现在以下方面:一是通过吸附在冰晶表面,与冰水界面层的水分子相互作用,通过非共价键结合在冰晶表面降低溶液冰点,不改变熔点,导致熔点与冰点之间的差值增大,防止热冲击,从而抑制冰晶生长和重结晶[4]。二是AFPs通过改变冰晶的生长习性和速率。将抗冷冻蛋白溶液中形成的冰晶与纯水中形成的冰晶相比,发现AFPs结合冰晶后,改变了冰晶生长习惯,使冰晶的形状和大小发生了改变。近年来,AF-Ps越来越多地应用于组织细胞的冷冻保存中。在精子冷冻中,AFPs(尤其是AFPⅢ)可稳定精子膜的组成,增加其渗透压抗性,提高精子冷冻保存效果[16,17];在卵母细胞冷冻中,AFPⅢ有助于保持卵母细胞的染色体和纺锤体的正常形态及卵母细胞膜完整性,提高对未成熟卵母细胞冷冻的保护作用[6];在胚胎冷冻中,AFPⅢ对细胞骨架结构微丝有很好的保护作用,提高了小鼠2-细胞期胚胎冷冻后复苏率和囊胚形成率[7]。本实验研究也发现了AFPⅢ与上述报道一致的效果,冷冻复苏后卵泡的超微结构显示:与常规玻璃化冷冻相比,AFPⅢ组卵泡内的颗粒细胞膜、卵母细胞膜及核膜保存更完整,卵母细胞内线粒体、内质网、高尔基体等重要细胞器结构更清晰,保存完好,从组织学上证实了AFPⅢ对冷冻卵巢组织内细胞膜和细胞器有保护作用,可减轻卵巢组织冷冻损伤。

卵泡结构的组织学评价不能完全证明它们实际的生理状态[14]。因此本研究中我们评估了玻璃化冷冻对卵母细胞凋亡的影响。细胞凋亡后,染色体DNA链断裂产生大量的黏性3’-OH末端,可在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下进行检测(TUNEL法)。本实验中新鲜卵巢组卵母细胞凋亡率明显低于两冷冻组,而其中添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵母细胞的凋亡率明显低于常规玻璃化冷冻组,进一步说明冷冻过程会引起一部分卵泡损伤导致卵母细胞凋亡,影响冷冻效果,而AFPⅢ可减轻冷冻损伤所致的卵母细胞凋亡。但TUNEL法存在一定缺陷:对于那些卵母细胞核内DNA片段缺失或已经失去细胞核的这类卵泡是不能被TUNEL法染色标记的。因此此法只用于对卵巢组织细胞凋亡进行初步判定。随后我们进一步采用卵母细胞和颗粒细胞联合评价的方法(卵泡活力鉴定)来全面测试卵泡存活率,结果显示新鲜组卵泡存活率显著高于冷冻组,同时添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵泡存活率明显高于常规玻璃化冷冻组。因此进一步证实AFPⅢ可减少卵巢组织的冷冻损伤,提高卵巢组织冷冻保护作用。

目前,有关AFPs的抗冻机制还不明确,最新研究认为AFPs的冰结合位点的疏水作用可以使水分子排列成有序的冰状晶格,有序水域可通过与特定的冰面结合而促进AFPs与冰的相互作用,抑制冰晶生成[18]。另外,还有研究认为AFPs的抗冷冻活性与其接触的冰面有关,能与冰晶基面结合或与基面和棱面多面结合的AFPs具有更高的抗冻活性[19]。有关AFPⅢ对玻璃化冷冻兔卵巢组织移植后生殖功能影响的效果评价,以及AFPⅢ抗冷冻作用的机制还有待进行深入研究。

综上所述,尽管冷冻过程仍然会造成卵巢组织不同程度的损伤,但在冷冻保护剂中加入AFPⅢ能显著降低卵母细胞凋亡率,提高玻璃化冷冻家兔卵巢组织的卵泡活力从而增加卵泡存活率,提高卵巢组织冷冻保存效率,为AFPs成功应用于卵巢组织的冷冻保存提供了实验依据。

摘要：目的:评价抗冷冻蛋白Ⅲ(AFPⅢ)对玻璃化冷冻家兔卵巢组织的影响。方法:收集家兔卵巢30只,随机分为新鲜卵巢组、添加AFPⅢ玻璃化冷冻组(AFPⅢ终浓度为500 ng/ml)和常规玻璃化冷冻组,各组10只,解冻后分析各组卵巢的组织学结构、卵泡形态正常率、卵巢组织超微结构、卵母细胞凋亡率及卵泡存活率。结果:新鲜卵巢组的卵泡形态正常率(91.6%)、卵泡存活率(81.75%)显著高于两冷冻组(P<0.01),卵母细胞凋亡率(12.0%)显著低于两冷冻组(P<0.01);添加AFPⅢ玻璃化冷冻组卵泡形态正常率(77.5%)、卵泡存活率(45.31%)显著高于常规玻璃化冷冻组(分别为62.1%、37.25%)(P<0.01),卵母细胞凋亡率(25.8%)显著低于常规玻璃化冷冻组(41.2%)(P<0.01)。结论:家兔冷冻卵巢组织的卵泡形态正常率、卵泡存活率显著低于新鲜组织,冷冻保护剂中加入AFPⅢ可减少家兔卵巢组织冷冻损伤。

冷冻方法 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

人脐带血由医院妇产科提供。妇产科采用密闭式收集法采集产妇的新生儿脐带血。要求孕妇均为足月生产, 无产科、内科并发症或其他疾病。在无菌条件下抽取脐带血, 脐带血采集完成后放置于4℃冰箱保存, 后置于脐血库。脐带血干细胞的分离采用HES (6%) 沉降后一次离心的方法。操作均在采集袋中进行。

1.2 方法

在冰水浴中, 脐带血MNC悬液中加入等体积的冷冻保护液, 混匀, 分装与冻存管内, 直接放入-80℃冰箱内保存。第一组10例采用5%的DMSO外加HES作为冷冻保护剂;第二组10例只采用10%DMSO作为冷冻保护剂。样品分别与冻存后1w、1个月、3个月、6个月复苏, 之后对两组实验结果进行对比和分析。

血单个核细胞的制备:ACD￣B液抗凝的脐血稀释后, 将其置于Ficoll淋巴细胞分离液的液面上, 离心30min之后弃去上清液, 吸取界面层白细胞, 用稀释培养液洗涤2次后, 加入含10%AB型血清的培养液中, 制成所需浓度的MNC悬液。采用实验室常规方法计数冻存前后脐血的有核细胞数。

集落培养:以浓度为0.5～1.0×105/ml接种于24孔板中, 每孔0.5ml, 复种3孔。37℃, 5%CO2和饱和湿度的条件下培养10d。于倒置显微镜下计数CFU￣GM集落, 并计算CFU￣GM回收率。

1.3 统计学分析

用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析, 两组数据间差异比较采用卡方检验。剂量资料采用平均数标准差表示。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

实验结果表明, 第一组细胞活率 (96.3±1.2%) 与第二组细胞活率 (92.2±3.8%) 相比组间差异无显著性 (P>0.05) 。但两组间CFU￣GM回收率有统计学差异 (P<0.05) 。DMSO+HES低温联合保护体系在冻存6个月后CFU￣GM回收率仍达到 (90.2±1.7%) , 明显优于目前通用的单用冻存保护剂DMSO (77.4±1.1%) 。

3 讨论

脐带血可以重建骨髓造血和人体免疫, 多用来治疗骨髓衰竭以及严重的血液疾病, 在一些遗传病和严重的免疫缺陷疾病中也被广泛应用, 并且获得了一定的成功。因此脐带血造血干细胞正确合理的冷冻保存非常重要, 其与骨髓造血干细胞的冷冻保存方法基本相同, 但对冷冻条件的要求更为严格。脐带血造血干细胞冻存的关键主要在于选择合适的冻存保护剂、合适的冻存方法等。其中保护剂的使用多联合使用穿透性和非穿透性保护剂, 以发挥两者的协同作用, 从而可以长期保存脐带血造血干细胞的造血潜能[1]。有研究表明, 用5%的DMSO融冻后1h不会对造血干细胞有毒性的影响。HES作为非穿透性的冷冻保护剂, 不仅可以在冷冻过程中减少细胞内的冰晶形成, 而且还可以降低DMSO的浓度, 减少对细胞的损伤。本研究结果表明, HES对脐血造血干细胞具有明显的冷冻保护作用, 与DMSO合用后具有协同效果, 低温联合保护体系在冻存6个月后CFU￣GM回收率仍达到 (90.2±1.7) %, 明显优于目前通用的单用冻存保护剂DMSO (P<0.05) 。但作为长期保存用的方法, 其长期效果及冻存保护机制还需要加以讨论和验证[2]。本次实验同时表明, 该保护体系适用-80℃非程控的降温方法, 因而避免了程控降温的时间损耗和其他复杂的操作步骤, 节省了程控降温设备的费用。与采用低温冰箱直接冷冻的方法相比较, 避免了因为电力供应带来的不便。但作为长期保存用的方法, 其长期效果及冻存保护机制还需要加以讨论和验证。该研究领域也成为近年来脐带血干细胞的研究热点, 也是其进一步发挥于临床应用所要面对的重要挑战, 相信在不久的将来, 会有更多的研究成果被发表和应用。

摘要：目的 探讨脐带血造血干细胞的冷冻保存方法, 建立一个简便、快捷的方法保存脐带血造血干细胞。方法 第一组采用5%的DMSO+HES作为冷冻保护剂, 将脐带血造血干细胞放置于-80℃的环境中保存;第二组只采用10%的DMSO作为冷冻保护剂。对两组试验结果进行对比和分析。结果 实验证明-80℃条件下, DMSO联合HES对脐带血造血干细胞具有明显的细胞保护作用, 尽管两组实验细胞存活率的组间差异无显著性, 但两组间的CFU-GM回收率有统计学差异 (P<0.05) 。结论 DMSO联合HES共同使用, 可以有效地低温保存脐带血造血干细胞, 造血干细胞的造血潜能可以得到有效的保护。同时该保护体系适用-80℃非程控的降温方法, 避免了时间损耗和节省费用。

关键词：二甲基亚砜,冷冻保存,脐带血造血干细胞

参考文献

[1]蔡永国, 张翼军.F68及其联合DMSO对脐血造血细胞的低温保护作用[J].第三军医大学学报, 2002, 24:1293-1295.

家居必备的冷冻疗法 篇10

1、冷水冲洗浸泡

最简单的冷疗方法, 适用于肢体远端损伤, 但效果欠佳, 只适用于简易处理过程中。这种方法的好处在于方便, 只要能找到一个有自来水供应的地方就行, 而且操作起来也十分简便:把没有伤口的患肢直接置入水龙头下开放自来水冲洗即可, 或则将其泡于水中。

但不足的地方也很明显:水温容易随环境温度波动不易控制, 而且受体位限制, 躯干及肢体近端等处不方便使用, 操作中不可避免地将患肢摆低放置, 不太符合此类损伤需抬高治疗的原则。

2、冷喷雾

最快速的制冷方法, 多用现成的冷镇痛喷雾剂 (氯己烷等) 做局部喷射, 这种器材目前在很多体育用品店或药店均可买到。操作方法是将喷雾剂与皮肤垂直, 距离30～40cm, 喷射8～10s, 至皮肤出现一层“白霜”, 根据病情停止喷射20s后可再喷射, 建议现场处理时使用不超过3次。喷雾完成后, 如能配合进行局部加压包扎效果将更好。

3、冰按摩和冰袋冷敷