淋巴管内皮细胞（精选六篇）
淋巴管内皮细胞 篇1
关键词：人毛细淋巴管内皮细胞,分离,培养,鉴定
近年来研究发现淋巴管是肿瘤浸润转移的重要通路。其作用主要是引流肿瘤来源的淋巴液和肿瘤细胞经淋巴管转移和浸润, 同时还可能给肿瘤提供养料和氧气促进或维持肿瘤细胞的生长。而淋巴管内皮细胞 ( lymphatic endothelial cells, LECs) 是构成淋巴管壁的主要结构, 由于解剖学和结构的特点, LECs的分离培养一直比较困难。原代培养一般多选用牛的胸导管或大鼠的胸导管、肠系膜淋巴管等较粗大的淋巴管[1,2]。但是在淋巴管道中发挥作用的关键部位是毛细淋巴管, 大淋巴管内皮细胞不能等同于毛细淋巴管的内皮细胞的生物学特性。因此, 如何获取和培养微淋巴管的内皮细胞将是更深入地研究淋巴管的关键。本研究从分离人皮肤组织中毛细淋巴管内皮细胞入手, 探寻LECs培养方法, 为肿瘤淋巴管生成及转移的研究提供细胞生物学基础。
1 材料与方法
1.1 材料来源
皮肤取自重庆西南医院泌尿外科行包皮环切术的新鲜幼儿包皮, 约4 cm×3 cm大小。本研究经过医院伦理委员会同意, 幼儿家属有知情权。
1.2 实验试剂
组织胶原酶购自Sigma公司;EGM-2购自Lonza公司;血管内皮生长因子受体-3 (vescular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3) 、鼠抗人单抗、D2-40鼠抗人单抗购自CHEMICON公司;淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan rpceptor-1, LYVE-1) 兔抗人单抗购自Upstate公司;肾小球上皮细胞整合膜蛋白 (Padoplanin) 鼠抗人单抗购自Angiobio公司;山羊抗鼠免疫磁珠购自Miltenyi公司;VEGF-C蛋白购自BD公司;SP 9000免疫组化染色试剂盒由北京中杉公司提供。
1.3 实验仪器
5%CO2培养箱;超净工作台;Miltenyi细胞磁性分离架;Sigma细胞克隆柱;Olympus IX 702SIF2 倒置荧光显微镜;DM 6000 M共聚焦显微镜;JEM-2000 EX型透射电镜。
1.4 实验方法
1.4.1 酶消化及磁珠分选
无菌条件下环形切除新鲜幼儿包皮, 约4 cm×3 cm大小。在超净工作台, 清除皮下脂肪组织后将其反复剪切至1 mm×1 mm左右, 加入0.1%胶原酶30 ml, 37℃水浴箱内消化2小时。收集消化液1000 r/min, 离心5分钟。弃上清, 加入1 ml 0.01 M PBS液混悬细胞沉淀, 加入10 μl鼠抗人VEGFR-3单克隆抗体, 4℃孵育5分钟。加入1 ml山羊抗鼠IgG免疫微珠缓冲液漂洗。300 g, 离心10分钟。弃上清, 加入80 μl缓冲液混悬细胞沉淀, 再加入20 μl免疫微珠, 4℃孵育15分钟。用缓冲液漂洗, 安放磁性分离架和MS磁柱, 将细胞悬液过柱, 收集过滤液。加入EGM-2培养基 (含20%FBS) , 接种于10 cm细胞培养皿内, 置37℃、5% CO2培养箱中培养。
1.4.2 原代及传代培养
培养2天后可见散在卵圆形细胞, 更换培养液。7天后细胞数量明显增多, 形成集落样生长。用细胞克隆柱分离4～6个细胞集落, 加入0.25%的胰蛋白酶和0.02% EDTA室温下消化。收集消化液, 1000 r/min离心10分钟 , 弃上清。用EGM-2培养液混悬细胞沉淀, 按1∶2传代接种培养。
1.4.3 LECs的鉴定
本实验采用免疫荧光染色的方法, 用VEGFR-3抗体、LYVE-1抗体、D2-40抗体、Padoplanin抗体、血管内皮细胞 (blood vascular endothelialcells, BVECs) 标志物Ⅷ因子抗体对LECs进行联合鉴定。
取对数期生长的细胞, 用酶消化后制成细胞悬液, 接种于涂有2%明胶的盖玻片上置6孔板内培养。待细胞生长至近融合状态时取出盖玻片, 用0.01 M的PBS漂洗5分钟, 共3次, 滴加封闭血清37℃孵育15分钟。分别加入适当比例稀释的一抗 (Padoplanin、D2-40、VEGFR-3、LYVE-1、Ⅷ因子) 4℃过夜。PBS漂洗5分钟, 共3次, 加入FITC标记的二抗37℃孵育1小时, PBS漂洗5分钟, 共3次。滴加细胞核荧光染色剂Hoechst室温下15分钟, PBS漂洗5分钟, 共3次, 用抗荧光淬灭封片液封片。DM 6000M共聚焦显微镜下观察、照相。用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
1.4.4 LECs电镜观察
将原代培养的内皮细胞消化, 1000 r/min离心10分钟, 弃上清液, 加入3%戊二醛磷酸缓冲液预固定, 1%锇酸后固定30分钟, 梯度丙酮逐级脱水, 每次10分钟。环氧树脂18浸泡、包埋, 半薄切片定位, LKB Ⅲ型超薄切片机切片, 醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色, JGM-2000 EX透射电镜观察、照像。
1.4.5 VEGF-C对LECs的生长增殖影响
取生长良好的内皮细胞, 消化后制成细胞悬液, 按1.0×104/ml的浓度接种于细胞培养板。对照组用EGM-2培养基 (含20%FBS) 进行培养。实验组用EGM-2培养基 (含20%FBS和10ng/ml的VEGF-C) 进行培养。每天各取3个孔的细胞进行计数, 计算均值, 连续观察7天。以培养时间为横轴, 细胞数为纵轴, 描绘细胞生长曲线。
2 结 果
2.1 形态学观察
原代细胞培养12～24小时后, 大部分细胞已经贴壁。有聚集生长的特点, 形成细胞群。1周后细胞分裂旺盛, 生长密集并汇合形成单层。光镜下LECs呈扁平的卵圆形、短梭形或多角形, 大小均匀。胞核清晰, 有核的区域较无核区域突出。呈特征性“鹅卵石状”或“铺路石状”镶嵌排列生长, 并有接触抑制现象, 见图1 (见插页3-1) 。当LECs形成单层时进行传代培养, 接种30分钟后细胞开始贴壁生长。分离培养的LECs可传7代, 经细胞免疫组化染色鉴定, 细胞表型未发生改变。我们利用细胞克隆柱, 有选择地将所需细胞在柱内进行消化后传代, 极大地提高了细胞纯度, 可达100%。
2.2 LECs的鉴定
Padoplanin抗体、D2-40抗体、VEGFR-3抗体、LYVE-1抗体:细胞呈短梭形或多角形, 轮廓清楚, 胞浆、胞膜有绿色或红色荧光, 胞核呈蓝色荧光。VIII因子抗体和用PBS作一抗的阴性对照组只见胞核呈蓝色荧光染色, 胞浆、胞膜中均未见荧光。
2.3 LECs的透射电镜观察
透射电镜观察, 内皮细胞呈卵圆形、短梭形、多角形或不规则形。细胞表面伸出大量的短指状突起, 胞浆丰富。有的细胞内含有体积较大的空泡。细胞核大, 形态各异, 染色质聚集。高倍镜下, 线粒体、内质网丰富, 见图2 (见插页3-1) 。
2.4 VEGF-C对LECs的生长增殖影响
由所示的细胞生长曲线可知, 细胞在第3～6天呈指数生长, 此期间细胞活力最旺盛, 融合度约为30%～90%。培养基中添加了VEGF-C的实验组细胞生长活力明显较对照组高, 见图3。根据统计学分析, 它们之间的差异具有高度统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨 论
淋巴管内皮细胞作为淋巴管系统的重要功能细胞, 多数学者主要通过对其离体的分离培养来作为淋巴管研究的突破口。但是因为缺乏特异性的细胞分子标志物, LECs的原代分离和体外培养非常困难。目前已知的淋巴管特异性分子标志物有VEGFR-3、LYVE-1、podoplanin、D2-40等[3]。Hu等[4]用Podoplanin抗体与免疫磁珠结合后分选LECs没有获得成功, 通过CD34-/CD31+分选的方法获得了LECs, 但是细胞要进行两次抗体磁珠分选, 实验步骤烦琐, 而且对细胞损伤大。本实验先期用温和的胶原酶对组织进行消化, 再选用VEGFR-3抗体与免疫微珠结合, 通过阳性分选获得微淋巴管内皮细胞。由于这些细胞标记物各有优劣, 单独使用时特异性低, 因此磁珠分离得到的LECs往往掺杂有许多间质细胞。为进一步纯化LECs, 我们利用细胞克隆柱, 有选择地将所需细胞在柱内进行消化后传代, 极大地提高了细胞纯度, 可达100%。我们分离的LECs在形态上呈扁平的卵圆形, 胞核清晰, 具有内皮细胞的典型“铺路石”征, 单层生长并有接触抑制现象。通过免疫学染色方法进行鉴定, 表明LECs其分子标志物表达均为阳性, 但BVE标志物VIII因子表达阳性, 这与报道的微淋巴管来源LECs鉴定相一致[5]。
VEGF-C是迄今为止发现的最重要的淋巴管生成因子之一, 它与VEGFR-3结合后可保护LECs免于血清来源诱导的凋亡, 促进其增殖、迁移和管样结构形成, 从而发挥促淋巴管新生的作用而倡导肿瘤淋巴管生成和转移[6]。因此在本实验中, 我们用10ng/ml的VEGF-C加入培养基中培养LECs的实验组, 与未加VEGF-C的对照组相比, 细胞增殖速度明显增加。
LECs由内皮祖细胞分化而来, 属于锚着依存性细胞, 呈贴壁性生长, 因此体外培养的LECs需要在培养器底部覆盖贴粘剂以增加细胞的贴壁性[7]。研究表明, LECs在体内能直接与ECM作用, 在含基质的培养基中LEC的贴壁和增殖效率均高, 并且能顺利传代。因此体外培养LECs也需要基质来支持。Sironi等[8]首次以明胶为粘贴剂成功建立了小鼠LECs系。目前商品化的粘贴剂还有基质胶、多聚赖氨酸基质胶或纤维蛋白等。王俊等[9]将消化法分离的小鼠LECs, 分别置于明胶、鼠尾胶、基质胶或纤维蛋白凝胶包被的培养板中生长, 结果显示MLEC在明胶、鼠尾胶支持物上生长良好, 其群体倍增时间均短于在基质胶和纤维蛋白凝胶上生长的MLEC。说明明胶和鼠尾胶是MLEC生长的较好支持物。鼠尾胶虽然成本低廉, 但需要自己制作、程序复杂、花费时间长。在本实验中, 我们使用了2%明胶铺底进行细胞培养, 其价格低廉、使用方便, 成功培养了LECs。
总之, 通过联合应用酶消化、抗体免疫微珠和细胞克隆柱纯化的方法获得了人皮肤毛细淋巴管内皮细胞, 细胞数量、分离效率和纯度均较高。建立了一个简便、实用和稳定的LECs培养方法, 为进一步研究淋巴管生成在肿瘤转移扩散中的作用奠定基础。
参考文献
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淋巴管内皮细胞 篇2
[关键词] 复方丹参滴丸；冠心病；血管内皮生长因子；内皮抑素
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2011）23-96-02
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）有刺激血管形成、内皮再生和调节血管通透性的作用，而内皮抑素（endostatin,ES）是一种内源性的强效血管生成抑制剂，具有拮抗VEGF的作用，两者的动态平衡影响血管内皮功能，对冠心病（coronary heart disease，CHD）的发生发展起到重要作用。复方丹参滴丸是在复方丹参片的基础上，利用现代药学新技术研制成的一种纯中药制剂，在药理学方面有抗氧化损伤、清除自由基、疏通微循环、改善血液流变性、抗凝、抗血栓的作用，能够增加冠脉流量，抗心肌缺血，但其对VEGF及ES的影响尚不清楚，本研究旨在观察冠心病患者使用复方丹参滴丸前后VEGF及ES水平的变化。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年6月～2011年6月笔者所在医院住院患者86例，男46例，女40例，平均年龄（56.5±16.5）岁，平均病程（2.2±1.5）年。均经冠状动脉造影确诊为CHD，入选患者随机分为观察组及对照组，其中观察组43例，男24例，女19例；对照组43例，男22例，女21例。排除标准：并发急性冠脉综合征、脑卒中、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤等。
1.2 方法
观察组给予复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司，Z10950111)，10粒/次，3次/d；对照组给予硝酸异山梨酯片（天津太平洋制药有限公司，H12020816），每次5～10 mg，3次/d，连续用药8周。
1.3 VEGF及ES检测方法
两组受试者均于用药前及用药8周后清晨抽取空腹静脉血6 mL，3 000转/min，离心10 min，分离血清，-70 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA），试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供(变异系数＜9.5%)。
1.4 统计学处理
所有数据用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料经正态性及方差齐性检验，分别进行t检验及重复测量的方差分析，组间比较采用q检验。计数资料用x2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者基线情况
两组患者年龄、性别、糖尿病。高血压、血脂等一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。
2.2 两组患者VEGF和ES变化
两组患者在治疗前VEGF和ES差异无统计学意义（P＞0.05）。同对照组相比，观察组用药后VEGF水平明显降低，而ES升高（P＜0.05）；同用药前相比观察组用药后VEGF水平同样明显降低，ES升高（P＜0.05）；对照组虽在用药后VEGF水平也有下降，ES同样显示出升高趋势，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。
3 讨论
本研究结果提示，冠心病患者使用复方丹参滴丸可使VEGF水平降低，而ES水平升高。VEGF是富含半胱氨酸的糖蛋白家族，以二聚体作为活性形式存在，是一类特异性促内皮细胞增殖并增加血管通透性的细胞因子。由内皮细胞和单核巨噬细胞合成和分泌，VEGF具有特异地与其受体结合，增加微血管与小静脉血管的通透性，诱导血管内皮细胞的形态学变化并促进血管内皮细胞分裂增殖以及诱导血管生成等作用，促进动脉粥样硬化的发生发展[1]。已有研究证实VEGF在CHD的全过程，即动脉粥样硬化的发生、发展到最后斑块破裂并发血栓形成，侧支循环建立以及冠脉介入术后再狭窄的所有阶段中发挥了一定的作用。Inoue等[2]发现VEGF及其受体在斑块形成处表达明显增加，而正常动脉则无VEGF mRNA表达。ES的主要作用为拮抗VEGF对内皮的作用，选择性调节内皮细胞功能，特异性抑制内皮细胞增殖，有效抑制血管生成[3]。ES的作用机制较为复杂，迄今未被明确阐明。目前多种实验都能证实内皮抑素对生长的血管产生抑制作用，而对静止的血管组织不起作用，故ES具有抑制内膜血管新生的作用，该作用从理论上推测能抑制冠状动脉粥样硬化斑块内血管新生，从而增强斑块稳定性，对急性冠脉综合征有防治作用。
复方丹参滴丸是基层医院常用中成药，从中医理论上讲复方丹参滴丸具有活血化瘀、理气止痛之功效，临床用于气滞血瘀所致的胸痹、胸闷、心前区刺痛等。其主要成分是丹参、三七、冰片。丹参味苦性微寒，清而兼补，活血祛瘀；三七味苦甘而温，具有良好的止血、止痛和活血化瘀的功效；冰片辛香寒凉，善于开窍醒神、清热止痛。3药合用对心血管疾病有很好的强心、活血、止痛的功效。经现代药理学研究，复方丹参滴丸对血管内皮细胞具有明显保护作用，能够平衡NO生成，显著增高细胞活性，对过氧化物所致内皮损伤有明显拮抗作用；同时具有抗氧化、抗炎、抑制动脉粥样斑块形成及抑制血管内膜增生，维持血管稳定性的作用[4]。本研究证实在干预VEGF及ES方面该药起到了良好的心血管保护作用，但复方丹参滴丸通过何种机制调节VEGF及ES水平尚不清楚，需进一步进行深入研究。
[参考文献]
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淋巴管内皮细胞 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
63例胰腺癌标本来自2005年1月～2009年12月邯郸市第一医院及邯郸市中心医院肝胆外科行胰头十二指肠切除的胰腺癌病例并均经病理证实,其中,男43例,女20例,年龄37～79岁,平均59.7岁;有淋巴结转移者25例,占39.7%。按照国际抗癌联盟(UICC)胰腺癌TNM(T指原发肿瘤情况,N指淋巴转移情况,M指远处转移情况)分期(2002年)诊断标准[3]:Ⅰ～Ⅱ期33例,Ⅲ～Ⅳ期30例,所有患者术前均未行任何抗癌治疗。癌周组织为距肿瘤边缘0.3～0.5 cm无癌细胞浸润处。正常胰腺标本共13例,来自邯郸市第一医院病理科非胰腺疾病死亡者尸检存档蜡块,病理学检查证实全部为正常胰腺组织。
1.2 方法
兔抗人VEGF-C、VEGF-D及CD31单克隆抗体购自北京中杉生物技术有限公司,Envision二抗等购自上海长岛公司。切片常规脱蜡,微波抗原修复,Envision法免疫组化染色,常规复染封片。用已知的乳腺癌阳性切片作阳性对照,以磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替VEGF-C、VEGF-D单克隆抗体作阴性对照。结果判定:VEGF-C、VEGF-D以癌细胞胞浆呈现棕黄色颗粒为阳性细胞,每例切片至少计数10个400倍视野,评分标准按Shimizu方法[4]:≥3分为阳性。毛细血管淋巴管的记数参照Weidner等[5]报道的方法:先在低倍视野下观察切片,选取癌周毛细血管淋巴管数量最丰富的区域,在200倍视野下记数5个视野毛细血管淋巴管数,取其平均值。所有镜检及计数均由两名不了解患者临床病理特征的病理医师完成。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间对比采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胰腺癌组织中VEGF-C和VEGF-D蛋白的表达
VEGF-C和VEGF-D阳性物质呈棕黄色细颗粒状,主要位于癌细胞胞浆。VEGF-C和VEGF-D表达具有异质性,以肿瘤边缘的癌组织表达相对较强。63例标本中VEGF-C阳性率为60.3%(38/63),与正常胰腺组织23.1%(3/13)比较差异有统计学意义(P<0.05);VEGF-D阳性率为63.5%(40/63),与正常胰腺组织23.1%(3/13)比较差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF-C与VEGF-D在胰腺癌中的表达无相关性(χ2=2.361,P>0.05)。见表1。
2.2 胰腺癌组织中VEGF-C和VEGF-D与微血管淋巴管密度(MVD/MLVD)及淋巴结转移的关系
在胰腺癌周组织及正常胰腺组织中MVD/MLVD的均值分别为(14.83±4.32)、(8.08±3.07),差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF-C阳性组中的癌周MVD/MLVD(16.84±3.25)显著高于阴性组的(11.76±3.97),差异有统计学意义(P<0.05);VEGF-C阳性组淋巴结转移率[55.26%(21/38)]高于阴性组的16%(4/25),差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF-D阳性组中的癌周MVD/MLVD(16.95±3.21)显著高于阴性组的(11.13±3.45),差异有统计学意义(P<0.05);VEGF-D阳性组淋巴结转移率[57.5%(23/40)]高于阴性的8.7%(2/23),二者差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
3 讨论
相关研究发现无论是良性还是恶性肿瘤,都存在瘤内淋巴管;在良性肿瘤内淋巴管密度与肿瘤大小相关,恶性肿瘤的淋巴管密度与肝转移发生率相关[6],但与淋巴管转移发生率无关[7];近年来随着淋巴管标记物以及淋巴管生成因子的发现,对淋巴管生成性肿瘤转移的关注很多。肿瘤细胞VEGF-C的高表达和乏氧无明确联系[8]。肿瘤细胞VEGF-D的高表达cadherin似乎有联系,而肿瘤细胞VEGF-C的高表达可能是同样道理。这些发现证实,肿瘤中存在淋巴管新生,VEGF-C的表达与淋巴管侵袭及转移的发生相关[9,10]。
VEGFR-3:血管内皮生长因子-C的受体之一,以往认为它在正常成人组织和胚胎组织中特异的表达淋巴管,也是培养的淋巴管内皮细胞中保持特异性表达的唯一标志物。并且是一个淋巴管发生的调节因子。但最近有研究者认为它并非具有特异性,除存在淋巴管上皮细胞外,在正常组织的有孔血管、视网膜、伤口、肿瘤血管中亦有表达。肿瘤细胞表达VEGF-C,其中21%(4/19)良性肿瘤为阳性,而67%(6/9)的交界瘤与82%(9/11)的恶性瘤呈阳性表达。Onogawa等[11,12]发现在人结肠癌VEGF-C、VEGF-D高表达,且与结肠癌的淋巴管侵犯及淋巴结转移密切相关。笔者研究表明,在63例胰腺癌组织中,VEGF-C阳性率60.3%(38/63),VEGF-D为63.5%(40/63),且以肿瘤边缘部分及肿瘤与正常组织交界处表达最高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);在胰腺癌周组织中MVD/MLVD的均值为(14.83±4.32),明显高于正常胰腺中的(8.08±3.0),差异有统计学意义(P<0.05);且VEGF-C及VEGF-D阳性组淋巴结转移率均高于阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示胰腺癌中VEGF-C和VEGF-D蛋白表达升高,具有促进胰腺癌周血管淋巴生成、促进淋巴道转移的作用。此外,VEGF-C、VEGF-D蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤的大小及分化程度无关,与肿瘤的TNM分期有关,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期。
在肿瘤或VEGF-C诱导的新生淋巴管模型中,笔者发现在肿瘤周边区域,淋巴管新生的程度与淋巴管密度有相关性。研究显示[13,14]:在肿瘤淋巴管新生和肿瘤细胞经淋巴管转移的过程中,新形成的淋巴管是从即存的淋巴管网通过发芽方式产生的,而来源于骨髓的内皮祖细胞在其中只起很小或不起作用。VEGF-C、VEGF-D蛋白阳性组中胰腺癌周血管淋巴管密度明显增加,且与VEGF-C、VEGF-D的高表达明显正相关(P<0.05)。可能是促进淋巴管,导致肿瘤细胞进入淋巴管引起胰腺癌淋巴管侵袭和转移有关[15]。笔者推测VEGF-C、D促进胰腺癌淋巴道转移机制是:胰腺癌癌细胞分泌的VEGF-C、D作为促血管淋巴管增生的始动因素,上调癌周组织内血管淋巴管内皮细胞膜上VEGFR的表达,二者互作用,使癌周血管淋巴管数目增多,内皮细胞增生,管壁结构通透性增加,增大了瘤细胞与淋巴管内皮接触的面积,改变了淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达[16],再加上癌组织对淋巴管内皮细胞的破坏溶解作用,为癌细胞进入淋巴管提供了更加便利的通道[17]。
摘要：目的 探讨人胰腺癌组织中血管内皮生长因子C(VEGF-C)及血管内皮生长因子D(VEGF-D)的表达与血管淋巴管生成的关系。方法 选用63例根治性手术切除的胰腺癌组织及13例正常胰腺组织,用免疫组织化学(Envi-sion法)检测VEGF-C及VEGF-D在胰腺癌中的表达,并免疫组织化学染色CD31显示计数癌周微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLVD),进行统计学分析比较胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D表达和癌周MVD/MLVD的关系。结果 VEGF-C及VEGF-D阳性表达产物主要见于癌细胞胞浆,胰腺癌周围组织中MVD/MLVD明显升高;胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D表达与癌周MVD/MLVD升高呈正相关(P<0.05)。结论 胰腺癌中VEGF-C与VEGF-D的表达增高,均具有促进胰腺癌的血管淋巴管增生、促进癌细胞转移的能力。选择性阻断VEGF-C或VEGF-D的促血管生成作用,对控制胰腺癌的淋巴道转移可能是一个有效的选择。
淋巴细胞威震敌胆 篇4
淋巴细胞“自幼”在专门的“学校”（如胸腺、骨髓等器官）里“习武”，接受严格的“训练”，学会了杀伤“敌人”的本领。“毕业”以后，通过血液和淋巴周游全身，从一处组织到另一处组织，从一个器官到另一个器官，不断巡视，时刻待命。一旦有外来的病原物（如细菌、病毒等）入侵，或机体某部位发生“内乱”（细胞突变，发生肿瘤），它们在接到“侦察部队”传来的信息后，就会立即分裂、增生，形成一支更庞大的部队，以不同的方式歼灭“敌人”。此时，身体内局部淋巴结发生肿胀，这也预示着机体内将要发生一场你死我活的恶战。
淋巴细胞是一个大家族，种类繁多，分工各异。你也许听说过T淋巴细胞、B淋巴细胞吧。前者又可分为很多亚型，如效应T细胞、辅助T细胞、抑制T细胞等。效应T细胞是英勇无比的“敢死队”，它们与“敌人”（靶细胞）直接展开“肉搏战”，并将一种叫“穿孔素”的有毒物质注入敌人体内，使其溶解、死亡。辅助T细胞能识别敌人，并能分泌多种因子促使效应T细胞活化，增强免疫反应的能力。然而，抑制T细胞则可以减弱或抑制机体的免疫反应，因为任何战争都不能任其无休止地发展，都有个偃旗息鼓鸣金收兵的时候。与T淋巴细胞不同，B淋巴细胞受抗原刺激后，可转化为浆细胞，分泌一些特殊的武器——抗体，以中和清除相应对机体有害的抗原。
淋巴管内皮细胞 篇5
1 试验
1.1 钛片的制备和碱活化
均匀剪出1 cm×1 cm的钛箔片若干;配制5 mol氢氧化钠溶液:分析天平称取200 g氢氧化钠, 溶解倒入容量瓶定容至1 L, 摇匀。钛片的碱活化处理:采用碱活化的方法在钛表面形成多孔结构, 取部分干燥清洁的钛片浸没在5 mol氢氧化钠溶液中, 60℃反应24 h, 用去离子水超声清洗后在80℃去离子水中再反应24 h, 最后用去离子水超声清洗, 干燥。
1.2 人脐静脉内皮细胞的培养
无菌条件下取健康剖宫产产妇的新鲜脐带 (长度约20 cm) ;将切去针尖的不锈钢注射器针头插入脐静脉一端, 用止血钳固定;注入生理盐水冲洗脐静脉直至冲洗液清亮;在脐静脉的另一端用同样的方法固定另一个注射器针头;两端用一次性注射器封闭。脐静脉内注入适量的0.1%II型胶原酶 (约10 m L/20 cm) , 37℃消化15~20 min后收集消化液;用含15%新生牛血清的F12培养液冲洗脐静脉1次, 收集冲洗液, 同消化液一起离心 (1 200 r/min, 8 min) 。弃上清, 加入F12完全培养液 (含20%FBS、20μg/m L ECGS、2 mmol/L-谷氨酰胺) 4 m L, 反复吹打重悬细胞, 移入塑料细胞培养瓶, 37℃、5%CO2条件下静置培养。隔日换液, 直至细胞融合度达80%~90%即可传代。
1.3 人脐静脉内皮细胞外基质的构建
抛光钛片和碱活化的钛片经高温高压灭菌后置于24孔板中, 每孔中加入1 m L密度为1×106cells/m L的HUVECs细胞悬液, 该接种密度基本可以保证HUVECs在钛片形成融合的单层。37℃、5%CO2条件下继续静置培养7 d后, 加入含20 mmol氨水和0.5%Triton X—100的PBS缓冲液, 脱去细胞成分, 暴露细胞外基质。20 min后用PBS冲洗5次, 每次3 min。
1.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的表征
脱去细胞外基质的样品在3%的戊二醛溶液常温固定30 min, PBS清洗后经过梯度酒精脱水 (50%、70%、80%、90%、100%两次, 每次15 min) , 醋酸异戊酯脱醇 (不少于1 h) , 临界点干燥后喷金, 扫描电镜 (SEM, QUANTA 200, FTI, Holland) 观察。测定细胞外基质改性前后钛表面的水接触角来反映材料的亲疏水性。碱腐蚀前后的钛片表面通过漫反射红外光谱 (DR-FTIR, IR 550, Nicolet, Madison, USA) 表征钛表面的基团变化情况。千万分之一天平 (Sartorius ME5, German, Sartorius AG) 称量细胞外基质改性前后样品的质量。
1.5 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的细胞相容性
无菌的碱活化钛片及HUVECs细胞外基质改性后的钛片置于24孔板中, 加入300μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HU-VECs (2×104cells/m L的HUASMCs) 细胞悬液, 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 贴壁8 h后将样品转移至新的培养板, 加入1 m L新F12完全培养液。分别培养1 d, 3 d后各取出三个样品, PBS清洗后用2.5%戊二醛固定。细胞骨架蛋白F-actin免疫荧光染色的方法来定位和观察细胞, 荧光显微镜下观察。
将各组无菌的样品置于24孔板中, 加入400μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HUVECs细胞悬液 (2×104cells/m L的HUASMCs) , 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 分别在培养1 d和3 d后弃去旧的培养液, 然后每孔加入CCK-8反应液400μL (含有15%FBS和10%CCK-8试剂的F12培养基) , 37℃孵育4 h, 轻轻摇匀后吸出200μL反应液于新的96孔板中, 450 nm测光密度值 (OD值) , OD值大小可以反映样品上黏附的HUVECs (HUASMCs) 的数目。
1.6 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的血液相容性
富血小板血浆 (PRP) 的制备:志愿者的新鲜静脉全血, 加入含3.8wt%枸掾酸钠 (Na3C6H5O7·2H2O) 的抗凝剂, 全血与抗凝剂的体积比为9∶1, 充分混匀后离心 (1 500 r/min, 15 min) , 取上层淡黄色的液体即为PRP。
血小板在材料上的黏附和SEM检测:将光滑钛片 (Ti) 和碱活化后的多孔钛片 (Ti-OH) , 以及HU-VECs细胞外基质改性后的钛片 (Ti-ECM和Ti-OH-ECM) 分别置于干净24孔聚苯乙烯的细胞培养板中, 每孔加入200μL PRP覆盖实验样品, 37℃, 5%CO2条件下孵育1 h后吸出PRP, 加入PBS后轻轻震荡, 3次洗涤以排除非特异性吸附的血小板。黏附血小板的样品用3%的戊二醛溶液室温固定30 min, PBS洗涤, 然后常规脱水脱醇处理, 临界点干燥后喷金, SEM观察。
2 结果与讨论
2.1 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的SEM形态学观察
高密度接种的HUVECs在抛光钛片及碱活化钛片上连续培养7 d后, 加入脱细胞液后, 样品表面已无可见细胞成分, 细胞外基质得以暴露。光滑钛片上细胞外基质与基底的结合力较弱, 局部区域出现了脱落的现象 (图1B) , 高放大倍数下残留的细胞外基质呈现出颗粒状的分布, 无明显纤维结构。但在碱活化的粗糙表面, 细胞外基质呈现均匀的分布, 除了颗粒状物质存在外, 还有均匀的纤维网络状结构, 与基底的多孔结构有着明显区别, 高倍镜下细胞外基质的纤维清晰可辨 (图1D) 。
2.2 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的接触角测量和DR-FTIR检测
HUVECs在光滑和多孔钛片上分泌和沉积细胞基质后, 引起钛片表面亲水性的明显改变 (图2) 。在抛光的钛片上, 细胞外基质改性后接触角均值有所升高, 但这种差异并不具有统计学意义。细胞外基质改性后的光滑钛片上不同部位的接触角差异较大, 最高为84.5°, 而最低仅为22.5°, 这种接触角的不均匀可以进一步证明细胞外基质在光滑钛片上部分脱落的情况。相反, 细胞外基质改性后的碱活化钛片的接触角有显著的增高, 这种增高有统计学意义 (P<0.01) 。
HUVECs细胞外基质改性前后的抛光钛片和碱活化钛片的DR-FTIR图谱表明, 由于细胞外基质在抛光钛片上的脱落, 使其DR-FTIR图片上并没有出现明显的新的吸收峰, 而2 365 cm-1处的共同的吸收峰则可能是空气中CO2吸收峰。钛表面暴露在空气中能迅速形成一层氧化物薄膜, 表面含有少量的羟基[7], 除了碱活化所产生的3 405 cm-1处的-OH吸收峰之外, 还有许多新的吸收峰出现, 包括2 960 cm-1和2 916 cm-1处的C-H吸收峰, 1 650cm-1处的C=O吸收峰, 以及2 916 cm-1处的N-H吸收峰, 进一步证明了细胞外基质在碱活化表面的成功构建 (图3) 。
2.3 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞外基质分泌量
如图4所示, 细胞外基质在光滑钛和碱活化钛上构建后, 后者的细胞外基质质量明显高于前者, 光滑钛上细胞外基质的质量不均一, 最高可达0.06 mg, 最低只有0.02 mg, 进一步补充说明细胞外基质在光滑钛表面有部分脱落现象, 而碱活化钛片构建细胞外基质更具有质量稳定性。一方面, 钛的粗糙度能够影响蛋白质在钛表面的吸附, 随着粗糙度增大, 表面积增加, 蛋白质的吸附总量也是增加的[8—10], 另一方面, 钛表面的羟基越多, 与蛋白的反应活性越高[11]。
2.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞黏附及增殖
体外接种HUVECs的CCK测定结果表明 (图5) , 不论是培养1 d或者3 d, 碱活化的钛片上HU-VECs黏附数量的平均值与光滑钛片上相比较有一定程度的降低, 但两者间没有统计学差异。不论是在抛光的钛片还是碱活化的钛片上构建细胞外基质后, HUVECs黏附的数量均有明显的增加, 且这种增加有统计学差异。碱活化后使得钛片粗糙度增加, 而粗糙表面往往会对内皮细胞的生长起到抑制作用[12,13], 细胞外基质改性后的碱活化钛片上细胞黏附的平均数量比同样经细胞外基质改性后的光滑钛片上的数量相比有一定的提高, 但没有显著差异。
HUASMCs在各组样品上黏附1 d、3 d的荧光显微结果和细胞毒性检测结果 (图5) 显示, 各组样品均促进平滑肌细胞的黏附与增殖, 细胞外基质改性后的Ti和Ti-OH的表面更有利于平滑肌细胞的生长, 且碱活化组钛经细胞外基质改性后表面的平滑肌细胞增长与改性前相比有统计学意义 (P<0.05) , 研究表明平滑肌细胞在血管内的正常生长对控制内皮细胞的形态和表型有重要作用。
2.5 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的血小板黏附及激活
体外血小板黏附实验结果表明 (图7) , 在抛光的钛片上有大量的血小板黏附, 血小板团聚并伸出大量的伪足, 说明血小板激活程度很高;由HUVECs构建细胞外基质后, 血小板黏附的数量有一定程度上的减少, 但血小板的团聚和激活程度 (形态上) 与光滑钛片基本相似。碱活化处理可以明显减少血小板在钛片上的黏附[5,14], 血小板的团聚程度没有明显改变, 但血小板伸出的伪足有明显减少;在碱活化钛片上进一步沉积细胞外基质, 使得血小板黏附数量进一步降低, 血小板团聚程度降低, 大部分血小板呈圆形, 只有少数伸出伪足[1]。
3 结论
黄鳝T淋巴细胞数量的检测比较试验 篇6
早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数量的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T淋巴细胞的最常用方法之一。通过对黄鳝T淋巴细胞的测定，可以了解不同发育阶段黄鳝的免疫活性，运用到实践上，可以对不同阶段的黄鳝的免疫力的强弱进行针对性的照料，当其免疫力弱时，可以加强防病治病的力度，从而达到科技运用到实践中的目的。
材料与方法
·实验材料
1、实验动物
白兔:购于荆州沙市区钟鼓楼菜市场，体重1.32kg，试验前常温饲养10天。
不同规格的黄鳝15条，购于荆州花鸟鱼市场，试验前22℃饲养7天，数据如表1所示。
2、实验器材
离心机；移液枪；枪头；水浴锅；EP管；注射器；显微镜；计数板；载玻片；盖玻片；高温灭菌锅；冰箱；制冰机等。
3、实验试剂
瑞氏粉；甲醇；甘油；姬姆萨氏粉；戊二醛；碳酸氢钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；小牛血清；柠檬酸钠；柠檬酸；氯化钠；percoll分层液；蒸馏水；氯化钾；氢氧化钠等。
· 实验方法
1、黄鳝血液的制备
（1）取出黄鳝，用剪刀剪断其脊椎，使其瘫痪，失去抵抗。
（2）用剪刀对准肛门下方少许处斜向剪断尾部，将断口对准事先准备好的装有阿式液的EP管，血液自然流进EP管。
（3）当血液量少的时候可以适当轻挤黄鳝躯体，使血液能更多的被采集。
（4）将收集好的血液存放在碎冰上备用。
2、黄鳝淋巴细胞的分离
（1）将1份10€譖BS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100 % Percoll悬液，其密度为1.1294 g/ml。
（2）用PBS稀释100% Percoll而获得所需密度的Percoll分离液。
（3）用稀释液稀释60 %则此时的Percoll分离液比重为1.0777g/ml，即可用于淋巴细胞的分离。
（4）取5ml的Percoll分离液于10ml的EP管中，将等倍稀释的黄鳝血液0.5ml小心叠加在分离液上。
（5）将EP管放在离心机上进行离心（1500rpm/min，10min）
（6）离心之后将EP管取出，可以看到EP管中有四个细胞层，从上到下第二层为淋巴细胞。
（7）用10um的移液枪小心的将这层细胞吸出，即为比较纯的淋巴细胞，将其收集好放在碎冰上备用。
3、兔红细胞的采集
（1）取5ml的注射器，用阿式液润洗。
（2）将白兔取出，按住其四肢和耳朵，让其面朝上躺着不能动弹。
（3）将注射器插入其心脏，缓缓抽出2ml血液，将血液迅速移入装有阿式液的EP管中，上下轻轻转动，让血液充分和阿式液混合。
（4）将制备好的兔血液放在碎冰上备用。
4、兔红细胞和黄鳝淋巴细胞的计数
（1）将采集好的兔红细胞稀释100倍，充分混匀。
（2）用移液枪吸取少量混液，小心的加在计数板上。
（3）将计数板放在显微镜下进行计数，计算出原兔红细胞的密度，配制出所需浓度的兔红细胞悬液
（4）用同样的方法配制出黄鳝淋巴细胞悬液。
5、玫瑰花环的形成
（1）取0.3ml小牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔红细胞和0.1ml黄鳝淋巴细胞，混匀。
（2）将EP管放在37℃水浴锅中反应25min。
（3）将EP管取出，放在离心机里离心（500 rpm/min，5min）。
6、玫瑰花环的制片、染色及镜检；
（1）将1滴反应好的培养物滴在玻璃片上，用枪头将其均与的涂抹在一定范围之内。
（2）将玻璃片放在一边让其自然干燥，干燥后滴加1滴甲醛在上面，5min后用6.4的PBS液冲洗。
（3）等其自然干燥后再滴加瑞式液，4min后再用6.4的PBS液冲洗。
（4）等其自然干燥后再滴加吉姆萨式液，4min后用6.4PBS液冲洗，干燥。
（5）每份培养液制备3份玻璃片。
（6）将制备好的玻璃片放在显微镜下进行观察，凡吸附3个或更多家兔红细胞的单核细胞，为RE花环形成细胞，共计数100个细胞，计算出百分率
不同规格黄鳝T淋巴细胞数量的比较（如表2所示）
通过上面表格可以看到，随着黄鳝规格的变大，其E玫瑰花环形成率逐渐增高，这也就是说，随着黄鳝的长大，其免疫力会逐步增强，而小黄鳝的免疫力最弱，在生活当中，应该更加注重黄鳝幼体的防病抗病工作。