肌成纤维细胞

肌成纤维细胞（精选四篇）

肌成纤维细胞 篇1

关键词：肌成纤维细胞,胆管狭窄,医源性

医源性胆管狭窄的处理是目前胆道外科的一大难题。术后突出表现为胆管瘢痕性挛缩和管腔狭窄,尤以肝门部或肝门部以上胆管狭窄最为常见[1]。本研究通过建立家兔肝外胆管损伤修复模型,术后动态观察肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)在愈合过程中的表达,从而探讨肌成纤维细胞在医源性胆管狭窄形成过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

选取健康家兔27只,雌雄不限,平均体质量2.0～2.5kg。将家兔麻醉后,在无菌操作下行经右上腹腹直肌切口入腹,探查肝胆系统大体形态,首先距十二指肠上缘2cm处游离出胆总管(上下游离范围不超过1cm),注意保护血供,沿周线切开胆总管前壁,范围不超过胆总管两侧纵轴。用显微外科技术,即在10倍显微镜下,用8-0无损伤缝合线作黏膜对黏膜全层吻合,针距0.2～0.3mm,边距0.1～0.2mm。术毕探查吻合口有无渗漏,于肝下放置引流管后关腹。术后预防感染治疗3d,观察动物的饮食、活动、反应状况、腹腔引流情况及并发症,直到正常进食为止。

1.2 研究方法

分别于术后1周、3周、3个月、6个月取吻合口瘢痕组织相对较多区域组织进行以下各项检查,每组每次取材6条。另以周边正常组织作为对照组。(1)大体观察与光镜观察:取肉眼观察吻合口瘢痕组织相对较多区域组织1块,2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定,分别进行Masson三色染色法及Verhoeff弹力纤维染色法,光镜下观察其病理组织学改变。(2)透射电镜检查(TEM):取肉眼观察吻合口瘢痕组织相对较多区域组织1块,4℃下迅速切取吻合组织1mm2,立即放入2.5%戊二醛磷酸缓冲固定液中,0～4℃下固定5h,再以2%四氯化钠固定1h,经分级乙醇脱水、包埋,超薄切片机切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,进行透射电镜观察并摄片。(3)免疫组织化学染色观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA):采用SP法,第一抗体鼠抗人平滑肌肌动蛋白单抗购自中山生物技术公司产品,SP试剂盒为ZYMED公司产品。染色步骤严格按SP试剂盒说明进行,3,3,-二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,封片,观察。(3)免疫组化SP法结果判定标准:以细胞膜和(或)细胞浆染成棕黄色为阳性细胞。“-”为阴性细胞,“+”为细胞膜和(或)细胞浆染成淡棕黄色;“+++”为深棕黄色;而“++”则介于两者之间。应用VIDAS图像分析仪,对各组切片单位面积阳性细胞数进行定量分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 11.5软件进行分析,计量数据以表示,采用方差分析,P<0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 家兔一般情况观察

一期术后10d 1只家兔死于胆瘘,术后1～2月2只家兔死于梗阻性黄疸,共存活24只;术后早期食欲、活动、反应尚正常,远期观察6只家兔3月以上时出现食欲下降、体质量减轻、尿色深及陶土便等梗阻性黄疸表现;术后腹腔引流管平均引流5～10ml淡血性液体,混有少量胆汁。

2.2 吻合口组织大体观察和光镜下观察情况

术后1周时吻合口表面渗出减少,黏膜下均为增生的肉芽组织,胆管壁较正常增厚,胶原纤维增生,排列紊乱;3周时吻合口表面转为慢性炎症反应,胆道黏膜部分修复,吻合口周围管壁明显增厚,均为增生的纤维瘢痕组织,部分纤维组织呈玻璃样变性,小血管增生、扩张、充血;3月及6月时吻合口胆道黏膜上皮基本修复完整,但排列较为杂乱,厚度较正常黏膜层薄,黏膜下多为较多慢性炎性细胞浸润,固有层含少量黏液腺,增生的毛细血管较前退化,管壁较前变薄,胶原纤维排列较前整齐,但仍杂乱无序、致密(图1)。

2.3 透射电镜观察(TEM)

1周时吻合口瘢痕组织内可见成纤维细胞增生,细胞功能活跃,处于合成状态。细胞外可见大量胶原纤维,直径40～80nm,较正常为细,密集成束,排列致密,杂乱,无方向性。同时可见一定数量的MFB,细胞较大,胞体扁平,多呈梭形,细胞核形态不规则。细胞内除具有成纤维细胞样丰富的粗面内质网和发达的高尔基器外,靠近细胞膜处尚具有发育良好的微丝和密体,与细胞长轴平行排列。此外,尚可见到较多炎性细胞浸润及漏出的红细胞;3周时瘢痕组织中成纤维细胞和MFB功能更为活跃,其中MFB所占比例增加。微丝和密体更易见到,粗面内质网扩张(图2),中性粒细胞和红细胞数目减少,巨噬细胞、淋巴细胞成为此前主要的炎性细胞,细胞外胶原纤维过度沉积,呈旋涡状或年轮状,排列致密、杂乱;3月时瘢痕组织细胞功能仍较活跃,MFB数量达到最多。细胞外胶原纤维排列仍无方向性,部分融合成不规则块状(图3);6月时出现纤维细胞,细胞功能相对静止,MFB数量下降,胶原纤维出现一定方向,类似波浪形排列。

2.4 免疫组织化学观察[α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]

α-SMA表达于MFB胞质、管壁少量平滑肌组织(图4)。α-SMA术后各期表达均较强,差异无显著性(P>0.05),与正常对照组织表达差异有非常显著性(P<0.01)。见表1。

注:与正常对照组比较,*P<0.05

3 讨 论

任何伤口的愈合都有瘢痕的形成,没有瘢痕就没有伤口愈合,瘢痕是伤口愈合必须经历的过程[2]。瘢痕病变部位胶原的过量沉积可导致瘢痕过度增生[3]。胆管狭窄突出表现为胆道瘢痕性挛缩和管腔狭窄,但其形成机制不清。笔者通过制作家兔胆总管损伤修复模型,发现胆管愈合方式属于过度愈合,愈合时间延长,胆管黏膜上皮修复较差,慢性炎症持续存在,成纤维细胞增生活跃,愈合后黏膜下胶原纤维过度沉积,改建较差,结果导致瘢痕增生,吻合口狭窄发生率较高。

近年来,人们逐渐认识到MFB与瘢痕挛缩关系密切[4]。MFB是一种在超微结构上兼有成纤维细胞和平滑肌细胞两者特征的非典型的成纤维细胞。通过手术笔者观察到胆管瘢痕组织中存在大量MFB。MFB术后1周时开始出现,3个月时达到高峰,高峰期持续较长一段时间。细胞的生活周期与吻合口肉眼组织的增生收缩过程基本上是一致的[4]。从而证实了MFB在医源性胆管狭窄形成过程中起着重要作用,是引起吻合口瘢痕性挛缩,造成术后胆道狭窄的重要原因。免疫组织化学结果显示,α-SMA在术后各期表现均较强,术后6个月的表达仍为++,各期差异无显著性。α-SMA阳性表达于MFB胞浆和管壁少量平滑肌组织,α-SMA作为成纤维细胞向MFB分化的标志,实际上也就成为MFB的重要标志[5,6]。

MFB术后持续存在于胆道瘢痕组织的原因尚不清楚。正常情况下,MFB通过细胞凋亡而死亡、消失,而在增生性瘢痕和纤维化疾病中持续存在[7]。有研究表明巨噬细胞(MФ)及转化生长因子(TGF-β1)的高表达与胆道瘢痕增生有密切关系[8]。其原因可能与胆汁的刺激作用引起的管壁慢性炎症有关。炎性反应持续存在造成上皮愈合后巨噬细胞仍大量聚集,持续合成、分泌多肽生长因子,导致成纤维细胞增殖旺盛,胶原过度合成,管腔瘢痕性狭窄。因此设法减少胆汁刺激引起的炎症反应的量和程度,缩短愈合时间,抑制巨噬细胞过度浸润及其活性,将有助于减轻胆管瘢痕增生。胆道愈合过程长期的观察及MFB确切的调控机理尚有待进一步研究。

参考文献

[1]耿智敏,刘青光,潘承恩,等.良性胆管狭窄形成机制的实验研究[J].中华肝胆外科杂志,2001,7(10):618-619.

[2]周林斌,郭善禹,张莉,等.合成粘合剂在胆道损伤修复重建术中预防吻合口狭窄的研究[J].中华肝胆外科杂志,2001,7(12):735-738.

[3]付小兵,王德文.创伤修复基础[M].北京:人民军医出版社,1997:202.

[4]Nedelec B,Ghahary A,Scott PG.Control of wound contraction:Basic and clinical features[J].Hand clin,2000,16(2):289-302.

[5]Chipev CC,Simman R,Hatch G,et al.Myofibroblast phenotype and ap-optosis in keloid and palmar fibroblasts in vitro[J].Cell Death Differ,2000,7(2):166-176.

[6]Badid C,Mounier N,Costa AM,et al.Role of myofibroblasts during nor-mal tissue repair and excessive scarring;Interest of their assessment in nephropathies[J].Histol Histopathol,2000,(15):269-280.

[7]Desmouliere A,Rechard M,Darby L,et al.Apoptosis mediates the de-crease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar[J].Am J Pathol,1995,146:56-66.

肌成纤维细胞 篇2

2008-06-19 00:00 来源：丁香园

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知识总结

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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials 注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

网友crepi 的观点：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友baichangming的观点：

MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

除皱新方法：注射自体成纤维细胞等 篇3

皱纹的产生是皮肤老化的突出表现。消除面部皱纹的治疗方法很多，皮肤填充注射是治疗早期静态皱纹的首选方法。目前，用于填充的材料主要有生物组织和人工合成材料两种。前者包括自体脂肪、自体真皮、自体成纤维细胞、异体胶原、牛胶原等，后者有液硅、生物塑料等。

近日，国内部分医疗机构尝试采用注射体外培养的自体成纤维细胞的方法进行除皱，取得较好疗效。由于注射入体内的是自身细胞，避免了异体、异种或人工材料可能导致的过敏、免疫排斥及异物反应，安全性高。此外，自体成纤维细胞可以长期存活于体内并增殖，在注射后即刻及较长时间内都具有治疗效应，与普通填充剂（如胶原和透明质酸）治疗效果随时间递减的特点相比，具有明显的优越性。不过，由于该技术正处于起步阶段，缺乏更长期的随访结果，远期疗效还有待进一步观察。

适应对象：脸部静止性皱纹，如鱼尾纹、眉间皱纹、鼻唇沟纹等。

开展单位：浙江省人民医院

脱敏新方法：舌下含服免疫治疗

近年来，过敏性疾病的发病率逐年上升，过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎等疾病严重威胁着人们的身体健康。研究显示，避免接触过敏原是最根本、有效的预防疾病发作的方法，而脱敏治疗则是目前唯一针对过敏性疾病的病因进行治疗的方法。

常用的脱敏治疗是指将诱发哮喘或过敏性鼻炎发作的特异性过敏原，如尘螨等，经特殊加工后，配制成各种不同浓度的提取液，经反复皮下注射进入患者体内，剂量从小到大，浓度由稀到浓，使患者对该过敏原产生耐受，以预防发生新的过敏，并显著改善过敏症状。脱敏治疗一般需要3～5年，长期、频繁注射给患者带来诸多不便。近年来，国内部分医疗机构尝试开展一种新的脱敏疗法，该疗法不用注射，只需舌下含服过敏原免疫制剂，即可达到与注射治疗相似的脱敏效果，且安全性高，发生严重反应（如过敏性休克）的概率非常低，应用前景十分广阔。

开展单位：上海交通大学医学院附属仁济医院、江苏省人民医院、北京协和医院等

腰突症治疗新手段：中药熏蒸床

随着生活节奏的加快，工作压力的增大，正常人群中患腰椎间盘突出症的患者越来越多。中药熏蒸技术是中医传统的治疗方法，历史悠久，属于自然疗法的范畴，是中医“内病外治”的经典方法之一。其原理是通过熏蒸的方法，将含药蒸气渗透、扩散入患者的皮肤，进而深达脏腑，以起到促进血液循环、通经活络、活血化瘀、行气止痛的目的。近日，山东省立医院推拿科最近研制出一种国家级实用新型专利——中药熏蒸床（如图），在临床推广应用后，收到显著疗效。中药熏蒸床使用的中药方剂是用于治疗腰突症疼痛的20余种中药材，如当归、枸杞、丹参等。治疗前，医生先将中药装入袋中，并放入熏蒸锅内浸泡6小时。治疗时，中药煮沸后产生的药蒸气，以对流和传导的方式直接作用于疼痛部位，可起到活血化瘀、消炎止痛、祛风散寒的作用。治疗过程中，患者的疼痛症状有显著改善和减轻。同时，中药蒸气对皮肤的温热刺激可使患者心情放松、肌肉松弛，疗效更佳。熏蒸后，中药袋还可以进一步利用，用油布包裹后，可用作局部热敷，使患处继续保持温热，巩固治疗效果。

肌成纤维细胞 篇4

关键词：乳腺肿瘤,超声弹性成像,肌成纤维细胞,临床意义

乳腺癌在妇科中属于常见疾病,在临床中具有较高的发病率,严重的影响女性的身体健康,尽早的诊断和治疗,对提高乳腺肿瘤患者的生活质量具有较大的意义[1]。本研究对乳腺肿瘤的超声弹性成像和肌成纤维细胞的分布情况进行深入的探究,判断其是否能够准确的乳腺肿瘤,从而为临床尽早诊断乳腺肿瘤和治疗提供参考,具体分析如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取浙江省青田县人民医院(以下简称“我院”)2010年1月~2011年6月治疗的乳腺肿块患者200例。乳腺良性病变98例为良性组,年龄30~68岁,平均(54.3±2.4)岁,其中纤维腺瘤患者60例,硬化性腺病患者20例,导管内乳头状瘤患者18例;乳腺癌病变102例为恶性组,年龄为34~79岁,平均(53.8±2.6)岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 超声检查方法

本次研究选取EUB-8500型彩色多普勒超声诊断仪,且配备彩色超声弹性成像技术,探头的频率7.5~13.0 MHz。本研究所有患者均在术前给予常规超声诊断和超声弹性成像检查,其中主要包括肿瘤的置和大小以及纵横比与形态、边界等,对超声弹性成像检查情况进行评分,并将检查的图片进行保存,由2名至少工作10年以上且经验丰富的医师进行观察与判断[2]。

1.2.2 免疫组织化学法

本次研究对于乳腺间质CD34和平滑肌肌动蛋白(SMA)表达采取免疫组织化学进行检测[3]。首先,将选取的新鲜活检组织给予10.0%甲醛进行固定,并采取梯度酒精进行脱水处理,采取二甲苯透明和石蜡的包埋处理。然后,将石蜡切片进行HE染色,并且在每张切片滴加相应对应的一抗CD34和SMA。最后,进行DAB显色和苏木精复染处理,并在显微镜下进行观察与判断。

1.3 评定标准

1.3.1 弹性成像评分

本次研究对于弹性成像评分主要采取7分法进行评估[4]:(1)1分:肿块的整体显示为绿色;(2)2分:肿块显示为绿色与蓝色相间,且呈现马赛克的形状,主要以绿色为主;(3)3分:肿块的中心显示蓝色,而周边显示为绿色;(4)4分:肿块显示为绿色与蓝色相间,且呈现马赛克的形状,主要以蓝色为主;(5)5分:肿块完全呈现蓝色;(6)6分:肿块的周边和肿块的内部均呈现蓝色,只有肿块内部出现小区域的绿色;(7)7分:肿块的周边均呈现为蓝色。恶性:弹性成像评分>5分;良性:弹性成像评分≤5分。1.3.2 CD34和α-SMA光镜观察方法在高倍的光学显微镜下进行随机的选取10个视野(400×)进行观察,并且每个视野选取计数100个细胞,并采取双盲法进行观察[5]。(1)0分:染色细胞计数<5.0%;(2)1分:染色细胞计数5.0%~<25.0%;(3)2分:染色细胞计数25.0%~<75.0%;(4)3分:染色细胞计数≥75.0%。而阳性细胞染色的强度:(1)0分:细胞不显色或者显色不清;(2)1分:细胞显示为浅黄色;(2)2分:细胞显示为棕黄色;(3)3分:细胞显示为深棕色。总积分=(染色细胞计数的评分+染色强度的评分)/2。(-):积分<0.5分;(+):积分在0.5~1.5分之间;(++):积分>1.5分。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两独立样本的计量资料采用u检验;计数资料以率表示,采用χ2检验。相关性采取Spearman分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 弹性成像评分

恶性组的弹性成像中观察肿块均显示为蓝色,评分为(7.0±0.3)分,而良性组的弹性成像中观察肿块大部分显示为绿色,肿块内部显示极少的蓝色,评分为(2.2±0.4)分,两组比较差异有统计学意义(u=11.2013,P<0.05)。

2.2 CD34和α-SMA定位

良性组中CD34蛋白主要定位于细胞质中,α-SMA蛋白主要定位于导管肌的上皮细胞中;在恶性组中CD34蛋白主要定位于血管中,α-SMA蛋白主要定位于细胞质中。

2.3 CD34和α-SMA表达

恶性组CD34表达水平低于良性组,而α-SMA表达水平明显高于良性组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4 CD34和α-SMA表达与弹性成像相关性分析

CD34表达和弹性成像呈负相关性(r=-0.124,P<0.05);α-SMA表达和弹性成像呈正相关性(r=0.132,P<0.05)。

3 讨论

超声弹性成像是一种新型的超声诊断技术,这种诊断技术比传统的超声诊断更加全面,能够对肿瘤和扩散疾病进行成像观察[6]。在临床中已经应用到乳腺和甲状腺以及前列腺等疾病的诊断中,而且具有较好的诊断效果[7]。临床中采取这种诊断方法中形成的弹性成像主要是因肿瘤的硬度不同而产生的一种差异,继而显示不同的图像[8]。这种诊断方法主要是依据不同组织间的弹性系数和组织发生变形的程度进行超声探测,并将其转变为实时的彩色图像[9]。一般弹性系数越小,受压程度大则显示为红色;而弹性系数越大,受压程度小则显示为蓝色;弹性系数处于中等水平,一般显示为绿色。因此,临床中常常采取图像的色彩进行判断组织的硬度情况。这种诊断方法有效的拓宽了传统超声诊断的不足,并更形象和生动的显示病变。

随着人们对乳腺肿瘤的不断研究,发现癌间质中的肌成纤维细胞是决定整个肿瘤硬度的重要因素[10]。而且其生物的学特性也不同于正常乳腺组织中的间质成纤维细胞。因此,临床中可以依据α-SMA的表达情况进行判断肌成纤维细胞是否在肿瘤中,从而判断其在肿瘤中的分布特征[11]。因此,临床中分析α-SMA的表达与超声弹性成像的相关性,即可了解肌成纤维细胞和超声弹性成像之间的关系。由于在α-SMA也有可能在其他的组织中得到表达,因此需要进一步的采取辅助指标进行观察,从而更好的定位。而CD34属于一种穿膜的糖蛋白,一般主要出现造血前驱细胞和内皮细胞等[12]。临床中有资料显示,在乳腺癌间质细胞中CD34将失去表达,而α-SMA将得到大量的表达,并且向肌纤维细胞进行分化。同时也有资料显示,在硬化性乳腺疾病中,CD34蛋白将得到大量的表达,且分布在纤维细胞中。因此,本次的临床研究选取CD34和α-SMA进行综合评估,从而避免干扰[13]。

通过本次的临床研究分析,在良性组中CD34蛋白主要定位于细胞质中,α-SMA蛋白主要定位于导管肌的上皮细胞中;在恶性组中CD34蛋白主要定位于血管中,α-SMA蛋白主要定位于细胞质中。由此分析,在乳腺恶性肿瘤中α-SMA蛋白得到大量的表达,进一步的分析出肌成纤维细胞在乳腺恶性肿瘤中得到大量的表达。并且本组的资料还显示,CD34的表达和弹性成像呈现负相关性(r=-0.124,P<0.05);α-SMA的表达和弹性成像呈现正相关性(r=0.132,P<0.05)。由此分析,在乳腺肿瘤中超声弹性成像的评分越高,则表示α-SMA蛋白在乳腺肿瘤中得到大量的表达[14]。进一步的分析,超声弹性成像的评分越高,则表示肌成纤维细胞在乳腺肿瘤中得到大量的表达。因此,临床中可以采取超声弹性成像进行判断肌成纤维细胞的分布情况。由于肌成纤维细胞属于非转化的细胞,常常和肿瘤细胞相比,该细胞的基因组相对比较稳定,且不容易出现抗原丢失的情况发生。因此,这也为临床中治疗乳腺肿瘤提供新的思路。