分子标记（精选十篇）
分子标记 篇1
1 分子标记的来源及定义
1.1 分子标记的来源
“标记”一词, 根据汉语大词典的解释, 是“便于识别的标识或者记号”。随着人们对生命本质认识的一步步加深, 在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列, 甚至占到了全序列的90%以上。这些非编码序列具有特殊的一级结构, 如串联重复、回文结构、Alu序列 (反向重复序列) 、CpG岛等, 并且全基因组分布[3]。随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序, 一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位, 整个基因组内的标记密度越来越高, 并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁, 所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。
1.2 分子标记的定义
广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶 (不同基因位点编码的酶的不同分子形式) 及等位酶 (同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式) 。狭义的分子标记仅仅指DNA标记, 一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。构成蛋白质的氨基酸有几十种, 而构成DNA的碱基只有4种, 通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异, 且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。并且到目前为止, 蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟, 可控性也不高。因此, 蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。但从更严格的意义上讲, 蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记, 因为其更稳定、多态性更高, 每种蛋白质都是唯一的 (序列唯一、构象唯一) 。
1.3 理想的分子标记
理想的分子标记必须达到以下要求: (1) 具有高多态性; (2) 共显性遗传, 即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型; (3) 能明确辨别等位基因; (4) 遍布整个基因组; (5) 除特殊位点的标记外, 要求分子标记均匀分布于整个基因组; (6) 选择中性 (即无基因多效性) ; (7) 检测手段简单、快速 (如实验程序易自动化) ; (8) 开发成本和使用成本尽量低廉; (9) 在实验室内和实验空间重复性好 (便于数据交换) [5]。
特别需要提出的是, 所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁 (连锁程度越高越好) 甚至共分离。
但是, 目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。
2 目前常用分子标记的基本原理
2.1 限制性片断长度多态性 (RFLP)
限制性片断长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism) 是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异, 是研究不同基因组间的差异的技术, 由Grodzicker于1974年首先提出。其基本原理是:物种经过长期的进化, 各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同, 或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化, 这样该位点就不能被切开, 使得DNA片段比亲本长;若突变后形成新的酶切位点, 则酶切后的片断变短。这样, 通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异, 但对于核DNA而言, DNA片断呈连续分布, 无法辨别差异, 需通过Southern杂交转移至支持膜上, 用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交, 通过放射自显影或非同位素显色技术, 发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱, 即为RFLP[5,6]。这种特定的限制性片断与DNA探针的组合, 便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异, 不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响, 具有遗传的专一性和稳定性的特点, 在数量上不受限制, 可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记, 而且每个标记变异大, 检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取, 可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA, 也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性, 为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析, 遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记, 能够区别出杂合体与纯合体[7]。虽然RFLP具有结果稳定可靠, 重复性好, 特别适合建立连锁图等优点, 但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高, RFLP连锁图谱上还有很大的空间区 (gap) , 甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等, 这些都是需要进一步完善的地方。
2.2 随机扩增多态性DNA (RAPD)
随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphisms DNA) 是美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DNA片段的遗传标记技术。这一技术建立于PCR反应基础之上, 以随机的短脱氧核苷酸 (通常为10个碱基) 作为PCR引物, 对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开, 经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上, 每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段, 对一个特定的基因型来讲, 这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA, 用同一引物扩增既可能得到相同的带谱 (模板基因组间可能具有同源性) , 也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。事实上, 不同基因组DNA总是有一定差异的, 所以用RAPD即可进行分子标记研究。理论上讲, 在一定的扩增条件下, 扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物, 复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同, 但对于某一特定引物来说, 它同基因组DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话, 即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内, 就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变, 通过对PCR产物的检测, 即可找出基因组DNA在这些区域内的多态性[10]。由于RAPD分析时所用的引物数量极大, 并且引物序列随机, 虽然对某一引物而言检测的区域有限, 但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。与RFLP是从一系列酶切片段中寻找多态性片段不同, RAPD是利用PCR随机合成多态性DNA片段, 检测被扩增区域内的遗传特征变化。其具体优点体现在: (1) 极大的丰富性, 能反映整个基因组的变化; (2) 强大的可探测性, 无需合成特定的引物; (3) 高效性与灵敏性。短期内可以得到大量的扩增片段, 只要是遗传特异性的发生变化, 即使亲缘关系很近的个体也可以识别出[11]。
RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的, 所用引物通常多达几百种, 并且1套引物可以用作多个物种或者群体, 所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。因此, 用来鉴定品种纯度是很有用的。据报道[9], 从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DNA片段;中国科学院遗传所陈洪等利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度, 鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。RAPD技术反应灵敏、多态性强, 操作简便, 速度快, 费用低, 既有大量的随机引物可供筛选之用, 又不受种属的限制, 被广泛用于多种作物的种子鉴定[9,11,12]。
由于是随机引物对整个基因组进行多态性检测, 在技术上简单易行不需要克隆制备、同位素标记、Southern印记等预备性工作, 所需DNA样品量少, 安全性好, 价格便宜, 是继RFLP之后应用最广的分子标记。由于引物没有特异性, 1套引物可用于不同生物基因组的的分析, 分析速度快, 短期内可得到大量的遗传标记, 并克服了同工酶位点少和RFLP操作技术复杂的弊端, 已经广泛应用于遗传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染色体区段的鉴别和分离以及动植物育种等方面, 特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面, 近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。水稻的Xa-21基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RAPD标记, 然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
与PCR相比, RAPD具有以下特点: (1) RAPD使用的是随机引物, 不需要预先了解目的基因和相应的序列; (2) 操作简便, 实验周期短, 能在较短的时间筛选大量样品; (3) 引物具有普遍适应性, 适用于自动化操作分析。
与RFLP相比, RAPD具有以下特点: (1) RAPD分析只需要少量模板, 1次扩增仅需20~100ng, 这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。 (2) RAPD标记具有更大的随机性, 亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种, RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交, 所得到的混合指纹会对其他等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大, 进行单拷贝的Southern杂交不很实际, 至少需要很长的曝光时间, 并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。 (3) 无需借助于有伤害性的同位素, 耗费的人力物力少。 (4) 灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化, 这是RFLP所无法比拟的。短期内可以得到大量的扩增片段, 只要是遗传特异性发生变化, 即使亲缘关系很近的个体也可以识别出。 (5) RAPD标记可以覆盖整个基因组, 包括编码和非编码区, 可以反映整个基因组的变化。但是, 由于引物的竞争性等, 基因组的RAPD位点有时不能全部检出, 造成假象上的差异, 这在种属亲缘关系的研究上尤其明显。 (6) RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区, 经过克隆和序列分析后, 可作为RFLP和原位杂交的探针, 在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
随着RAPD日益广泛的使用, 其不足之处也逐渐显现, 比如标记的显隐性位点性, 致使其不能在后代中区分杂合体和纯合体;稳定性差, 由于是单链引物随机的结合, 在众多的反向重复序列上, 每次的实验结果可能不一致。解决办法是对单链引物进行筛选, 优化PCR条件;高度的变异性, 即使在亲缘关系很近的物种间, 结果也可能差异极大;Tm值低的随机引物易受外界环境影响, 如Mg2+浓度等[8,9,14]。
由于RAPD技术是由多种成分参加的生化反应, 反应中各种成分均为微量, 尽管其反应灵敏度高, 但是影响因素较多, 故而RAPD受环境影响很大, 稳定性差, 重复性也不好, 因此对实验的设备、条件及其操作的一致性很严格, 这又大大限制了它的使用。为了得到较稳定的结果, 各种反应参数必须事先优化选择, 操作中每一步都必须小心谨慎, 以防止出现差错。
2.3 特征序列扩增区域 (Sequence-characterized amplified regions, SCAR)
RAPD标记一般表现显性遗传, 但若某RAPD片段不是重复序列, 也可将其转化为RFLP标记。另外, 为了提高某一理想RAPD标记的稳定性, 可首先将其克隆并对其末端测序, 之后, 在原来RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸, 以此为引物对基因组DNA再行扩增分析, 此即SCARs (Sequenced Characterized Amplified Regions) 标记[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore (1993) 提出并应用。SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是:先作RAPD分析, 然后把目标RAPD片段 (如与某目的基因连锁的RAPD片段) 进行克隆和测序, 根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物 (一般比RAPD引物长, 通常24个碱基, 是在原RAPD引物的3′与5′端延长14个碱基) , 利用两端各24个碱基的引物再进行PCR特异扩增, 这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。总的来说, SCAR比RAPD和其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好, 因为它有更高的可重复性 (原因是使用的引物长) , 标记是共显性遗传的[16]。
该方法与RAPD相比, 具体有如下优点: (1) 由于有较长的引物, 退火温度较高, 因此具有更高的检测稳定性; (2) 有将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性; (3) 如果是显性标记, 则在检测中可以直接染色而不需电泳检测。另外, 用RAPD找到扩增片段后不再设计引物, 而是直接测序后通过电脑软件分析 (如用ClustalX软件进行对位, MEGA软件计算DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数, UPGMA软件建亲缘关系树状图等) , 找出特异性的碱基作为鉴定的特异性标记[17]。
2.4 与RAPD技术相近的分子标记种类
下面提到的所有技术都是利用1个或2个短的富含GC碱基的随机引物。
(1) DNA扩增指纹图谱 (DNA amplification fingerprinting, DAF) [18]。与RAPD技术不同的是, 在DAF分析中, 引物浓度更高, 引物长度更短 (一般5~8个碱基) , 只有2个温度循环 (在RAPD中是3个温度循环) , 并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳, DAF通常会产生非常复杂的带型。
(2) 任意引物PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR) 。AP-PCR使用的引物较长 (10~50个碱基) , 但PCR反应前2个循环的严谨条件较低, 最终的反应结果与RAPD类似[19]。在AP-PCR分析中, 扩增分为3个部分, 每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异;在第1个PCR循环中, 引物浓度较高;引物长度不定, 并且常常来自为其他目的而设计的引物 (如M13通用测序引物) 。
2.5 扩增片段长度多态性 (AFLP)
扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism) , 亦称选择性限制片段扩增 (SRFA, Selective Restriction Fragment Amplification) , 是荷兰Keygene公司的Zabeau Marc和Vos Pieter于1993年创建的一种新型的分子标记, 并于当年获得了欧洲专利局专利[20]。
它是RFLP和PCR相结合的分子标记技术, 既有RFLP的可靠性, 又有PCR (如RAPD) 的灵敏性, 多态性高。其基本原理是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切后产生的限制性片断。基因组经2种限制性内切酶消化以后将一双链DNA人工接头 (artificial adapter) 连接于限制性片断两端。然后根据接头序列和限制性位点附近的区域的碱基序列, 设计一系列3′端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物进行特异性条件扩增, 只有那些限制性位点的侧翼序列与引物3′端选择碱基相匹配的限制性片段才能得以扩增。这些选择性碱基数目的多少主要是由待测样品的基因组大小决定, 选择性碱基数目多, 选择性就强, 扩增产物就少;反之, 其数目就少, 选择性弱, 扩增产物就多。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示其多态性。当不同基因组DNA中因为突变引起限制性位点的数量发生改变或2个限制性位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排时, 电泳谱带显示多态性, 多态性以扩增片段的长短不同和数量多寡显示出来[21]。
AFLP的技术特点包括以下几个方面: (1) 使用2种内切酶消化模板DNA。一些酶的切割位点较多, 如MseI、TaqI、XbaI等, 另一些酶切位点较少, 如PstI等等。采用双酶切割的原因是:多切点酶产生小片段, 便于凝胶分析切点数少的酶减少扩增片段, 由于AFLP反应中扩增片段是2个酶共同酶切的片段, 这样减少了选择扩增时所需的选择碱基数。双酶可以进行单链标记, 从而防止电泳中因为双链泳动不均而产生的双带假象。并且可使少量引物产生许多不同的引物组合, 从而产生大量的不同的AFLP指纹图谱[22]。另外, 不同物种基因组的AFLP过程中使用的限制性内切酶也不尽相同。EcoRI可靠廉价, 是6碱基内切酶的首选。分析真核生物基因组时大多使用MseI (4碱基) , 因为MseI的识别序列是TTAA, 而真核生物基因组富含AT序列, 与TaqI相比 (其识别序列为TCGA) , 可以获得更多的便于PCR扩增和电泳分离的小片段DNA[23]。 (2) AFLP的接头为双链寡核苷酸。人工合成时接头未进行磷酸化处理, 所以只有1条单链连接于酶切片段的末端。 (3) 与常规的PCR相比, AFLP的引物有其独特性。其引物有3部分构成:与接头互补的核心序列、内切酶识别序列以及3′末端的选择性碱基。该类引物的一个重要特征是通常以鸟苷酸G开头, 这样可以有效的形成双链, 不过当dNTP浓度过低时容易形成双链结构。此外, 选择性碱基的数目影响着AFLP反应的特异性。研究表明, 引物带有1~3个选择性碱基时扩增的选择性较好。当选择性碱基超过4个时, 扩增的错配程度超过了允许程度, 故而AFLP的选择性碱基数目一般不超过3个, 具体数目取决于基因组的大小。研究表明, 分析500Mbp以下的植物基因组时用EcoRI+2 (2个选择性碱基) /MseI+3引物组, 500~6 000Mbp的基因组应采取EcoRI+3/MseI+3较为严谨的引物组。微生物通常采用1个选择性碱基的引物组[24]。 (4) AFLP的PCR扩增分两步进行。首先预扩增, 其扩增产物经过一定比例稀释后, 以此为模板再进行选择性扩增。两步扩增可以减少扩增产物中的非特异性带, 降低了不清晰电泳造成的指纹图谱的背景, 提高了指纹图谱的清晰度, 还可以增加扩增片段数, 为AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技术不仅具有其他分子标记的优点, 即位点数量无限, 呈典型的孟德尔遗传, 无表型、复等位效应, 不受环境影响等, 还具有一些独特的优越性, 如标记异常丰富, 典型的AFLP反应中, 1次电泳可得到100~150个扩增产物, 其他标记技术难以达到。稳定性、重复性好, 应用非常广泛, 可用于任何生物基因组的遗传分析。与PCR技术结合, 可在短时间内得到大量多态性标记。同时对模板浓度不敏感, 模板需求量也小。Vos Pieter在对番茄基因组AFLP分析时, 证实了模板浓度在相差1 000倍以内 (0.000 5~25ng) 获得的指纹图谱基本一致。另外, 在AFLP中标记的引物会全部耗尽, 引物耗尽后, 扩增的带型不受循环数的影响。这样模板浓度即使不一致也可以通过增减循环次数的方法获得强度一致的带型。目前, AFLP是构建基因组特定区段高密度连锁图谱的最有效的方法。此外, AFLP全基因组分布非常适合构建遗传连锁图谱。AFLP也可以用于检测DNA库 (DNA pool) 克隆的DNA大片段的多态性, 而且其多态性的标记大多对应于基因组的某一位置, 这样就可以和STS一样, 成为遗传图谱 (genetic map) 和物理图谱 (physical map) 之间的桥梁[25,26]。
实际操作中, 影响AFLP指纹图谱结果的因素很多。因此, 应采取质量高、纯度好、分子量大的的基因组DNA作为模板。如果模板中含有其他杂质或者DNA降解很严重, 导致酶切不完全, 许多未经酶切的模板片段经电泳后产生表现为高分子量的条带 (假带) , 导致不能真实地反映被测物种的多态性。为了避免电泳的条带过多或者过少, 应对PCR反应体系进行优化, 筛选出最佳的引物组合。PCR扩增时, 应在模板变性之前加入Tag酶和dNTP, 否则会导致扩增失败。反应体系中的dNTP浓度不能过低, 否则扩增产物容易形成双链结构[21,27]。
2.6 序列标签位点 (STS)
序列标签位点 (Sequence-Tagged Site, STS) 指的是一段序列已知并且能够在基因组中作为“路标”使用的DNA序列, 是对由特定引物序列所界定的一类DNA标记的统称。其最大特点就是利用特异PCR, 因此结果非常可靠。显然, 成为STS必须满足2个条件: (1) 序列已知; (2) 位置确定并唯一。从理论上讲, 任何一段DNA都可以成为STS。但是, 由于需要的是与某一个目标性状基因或已知的标记紧密连锁的DNA片段, 因此能够利用的STS数量则非常有限。根据单拷贝的DNA片段两端的序列设计1对特异引物扩增基因组DNA, 产生的一段长度为几百bp的特异序列在基因组中往往只出现1次, 从而能够界定基因组的特异位点。在人类基因组作图中已用其作为将遗传图谱与物理图谱整合的共同位标, 这在基因组作图上具有非常重要的作用。随着大量的模式生物的全基因组测序, 会有越来越多的可利用的STS被发现。
2.6.1 表达序列标签标记 (Expressed Sequence Tags, EST) 。
EST是指一小段 (通常长度300~500bp) 单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达, 可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出, 并首先应用于人类基因组研究, 之后被广泛用于植物基因组研究, 它是通过大规模的cDNA随机测序, 从而获得对基因组认识的一种研究策略。目前, 许多国家和组织正在开展某些作物基因组EST计划的研究, 如成立于1998年的国际小麦族EST协作网 (International Triteace EST corperation, ITEC) , 就是致力于麦类EST研究和开发的[28]。近几年来, 国际公共数据库中的EST序列呈指数增长, 截止到2006年8月, 美国生物信息中心 (NCBI) 数据库Genbank已公布涉及205 000种生物的61 132 599条EST序列, 总长度共65 369 091 950bp。
快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。首先, 避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤, 而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品, 从而节省了大量人力物力[29];其次, 其本身是功能基因的一部分序列, 所以它将为功能基因提供“绝对”的标记[30]。同时, 由于不同物种间基因共线性和保守性, 从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究, 从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径[31]。现在EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。
另外, 还有一种被称为GSS序列的标记。GSS序列本质上和EST序列是一样的, 不同之处是它的序列直接来源于基因组而不是mRNA或cDNA。它通常有以下几种来源: (1) 全基因组检测得到的特异/单次重复序列; (2) 来自质粒/BAC/YAC克隆所得到的单次重复序列; (3) 基因组外显子捕获; (4) 通过Alu—PCR得到的序列。
2.6.2 微卫星 (SSR) 。
微卫星 (microsatellite) 又叫做简单重复序列 (Simple Sequence Repeat) 或者短串联重复序列 (Short trandem repeat, STR) 、简单序列长度多态性 (Simple Sequence Length Polymorphism, SSLP) 。简单序列重复多态性 (Simple Sequence Repeat Polymorphisms, SSRP) 微卫星指的是真核生物普遍存在的遍布整个基因组的排列为2~5个核苷酸的短串联重复序列, 如 (CA) n、 (GT) n、 (CAG) n等, 尤以 (CA) n重复序列最为常见, 其长度由重复单位的拷贝数决定。在真核生物基因组中微卫星很丰富, 通常长度能够达到150bp, 是一类呈高度多态的遗传标记, 不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆, 而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性, 但突变率仅为0.5×10-4~5.0×10-4, 在家系中可以稳定地遗传, 是一种很好的遗传标志[32]。
微卫星约占真核基因组的5%, 其基本构成单位一般为1~8bp, 多位于编码区附近, 也可位于内含子、启动子及Alu序列 (反向重复序列) 中。人类基因组约有5~10万个 (CA) n重复序列。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致, 因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。目前普遍认为微卫星充当基因重组的热点是基因重排和变异的来源[33]。微卫星不稳定性 (microsatellite instability, MSI) 是指由于复制错误 (replication error, RER) 引起的简单重复序列的增加或丢失, 也称RER阳性或RER表型。MSI首先在结直肠癌中观察到。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
由于微卫星的寡核苷酸在同一物种的不同基因型之间差异很大, 可以利用特异引物进行PCR扩增。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定保守序列设计, 用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大, 所以这是检测多态性的1种有效方法[34]。其特点包括:一般检测到的是1个单一的多等位基因位点;共显性遗传, 故可鉴别杂合子和纯合子;得到的结果复性很高。为了提高分辨力, 通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳, 它可检测出单拷贝差异。也可以在同1个反应试管中把PCR反应与不同的SSR引物结合起来 (称为multiplexing) , 这可节省时间, 但是, 这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用[35,36]。很显然, 使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息, 这一方面可以在其他种的DNA数据库中查询, 否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库, 再从中筛选可用的克隆, 进行测序, 然后设计合适的引物。同时, 这种由保守序列确定的微卫星序列也具有染色体位点的特异性, 因此1981年Miesfeld等首次发现微卫星后, 很快成为1种常用高效的分子标记。统计分析表明, 不同的物种其微卫星的突变频率也是稳定的。SSR的PCR引物也是对某一高变重复位点高度专一的。用特定引物扩增出相应的微卫星片段后, 再通过电泳分离, 差异可经过EB或者银染后观察。一般种群可显示出超过10种类型的等位基因。微卫星不仅重复单位变异数大, 而且其重复区域总长度又在PCR易于扩增的区域, 快速简便, 所需的DNA用量小。与等位酶相似, 微卫星是具有独立的共显性基因。由于微卫星的遗传中性并且比等位酶法有更多的可供检测的等位基因, 这样就可以提供更加精细的基因变化的范围, 因此在种群研究上有着更大的应用[3,34,37,38,39]。
简而言之, 微卫星的最大优点在于通过简单的PCR扩增即可直接检测到已知的特定的染色体位点, 不仅具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点, 还具有RFLP的稳定可靠、特异性、共显性等特点, 不足之处是其引物开发难度较大, 技术复杂, 周期长, 成本也高。不过随着众多模式生物的全基因组测序的飞速进展, 对全基因组了解的日益全面, 各个大型数据库的逐步完善, 并且借助越来越发达的计算机计算和预测技术, 使得开发成本有所降低。
2.6.3 其他具有特定引物的分子标记种类。
(1) 加锚微卫星寡核苷酸 (Anchored microsatellite oligonucleotides) 。Zietki-ewicz et al (1994) 对SSR技术进行了发展[40], 他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物, 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2~4个随机选择的核苷酸, 这可引起特定位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR (inter-simple sequence repeat) 、ASSR (anchored simple sequence repeats) 或AMP-PCR。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中, 可以1个是ASSR引物, 另1个是随机引物。如果1个是5′端加锚的ASSR引物, 另1个是随机引物, 则被称为RAMP技术。
(2) CAPS (Clea-ved amplified polymorphic sequence) 。CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是:先进行PCR扩增, 然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切, 再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开, 用EB染色, 观察。与RFLP技术一样, CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测, 其多态性称为ALP。Neff et al. (1998) 在此基础上又发展出dCAPS技术 (derived CAPS) , 这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。
(3) 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction, SPAR) 。SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用1个引物, 但SPAR分析中所用的引物不是随机的, 而是在SSR的基础上设计的, 例如可能的序列是 (TA) 10或 (CGA) 6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP-PCR (microsatellite-primed PCR) 。
(4) 小卫星区域DNA直接扩增 (directed amplification o minisatellite region DNA, DAMD) 。直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。
(5) Inter-Alu PCR like genomic profiling。与SPAR技术相近, 也只用1个引物, 但所用的引物是在Alu序列 (反向重复序列) 的基础上设计的, 扩增的是copia (另一种反向重复序列) 序列之间的DNA序列。
(6) ISTR (inverse sequence-tagged repeat) 。这种技术与SPAR技术也相近, 所用的引物是在copia序列的基础上设计的, 扩增的是copia序列之间的DNA序列。
(7) IFLP (intron fragment length polymorphism) 。检测的对象是内含子的长度差异。根据内含子两端的特征序列设计引物, 扩增出长度不同的内含子片段。
(8) RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism) 。RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近, 但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是:先用1个单一的随机引物 (即RAPD引物) 对基因组DNA扩增, 用电泳将扩增片段分开, 然后, 把凝胶转移到尼龙膜上, 使之与一个带有放射性标记 (或其他标记) 的与SSR互补的寡核苷酸探针如 (CA) 8和 (GA) 8杂交, 放射自显影后可得到新的多态性类型。
先找到RFLP标记后, 对RFLP探针进行测序, 再合成适当的PCR引物, 这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。
3 抗性基因同源序列 (RGA)
近年来, 在各种农作物抗性育种的进程和模式生物的抗性研究中, 在水稻、玉米、番茄、马铃薯、烟草、拟南芥等植物中克隆了若干抗性基因, 包括植物对病毒、细菌、线虫的抗性基因。例如烟草抗花叶病毒基因、水稻抗白叶枯病基因Xa-21、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、亚麻抗锈病基因L6以及甘蔗抗胞囊线虫基因HS1等。
Leister等通过分析研究已克隆的植物抗病基因的结构特征, 发现很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年, 《美国科学院院刊》在同一期发表了2篇应用同源序列从大豆中克隆R基因同源序列的报道, 从而引发了同源序列法在植物抗病基因研究中的应用。随后的大量研究表明, 植物抗病基因中存在多种类型的保守结构域。Hammond Kosack和Parker通过分析已克隆的植物抗病基因结构, 将植物抗病基因分为8类, 其中, 含有NBS-LRR (富亮氨酸重复子Leucine-rich Repeats, LRR) 结构域的抗病基因是最主要的类型。
这些结构可能是参与蛋白质之间的相互作用或者细胞信号的传导以及识别。根据抗性基因的这一共性, 以其保守结构的序列为基础设计引物, 在任何作物中, 用PCR技术扩增和分离具有相似序列的DNA片段, 即抗性基因同源序列。
RGA提供了一种快速鉴定候选抗性基因的便捷途径。目前已经利用此技术在小麦、大豆、马铃薯中鉴定了候选抗性基因, 它们在基因组的位置基本上就在已知的抗病基因区域。已知基因包括抗病毒、细菌、真菌和线虫的基因。而且部分与抗性基因紧密连锁的标记本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此, 应用RGA进行基因定位可以较快地检测到与抗性基因紧密连锁的分子标记。可以预见, RGA将成为抗性基因定位的重要手段, 并且在分子作图的领域将发挥更加巨大的作用[41,42]。
4 单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphisms, SNPs)
单核苷酸多态性是指2套基因组的DNA序列两两进行位置比对时, 单个核苷酸的的不同而显示出的差异 (多态性) 。因此, SNP反映了过去多数突变事件的特点, 2个个体在同一位点携带的不同等位基因被认为是进化的遗传标志。显而易见, SNP是目前已知的多态性最高的分子标记。据Genbank估计, 如果比较2套人类基因组的DNA序列, 出现SNP的频率可达1/2 000~1/1 000, 看起来这个频率并不高, 但是考虑到人类基因组共有3.2×109bp时, 即可能出现3.2×1012个SNP位点时, 这个数量已经相当可观了。并且这只是2套基因组之间的比较, 所有的SNP位点肯定比这个数字大得多。水稻中SNP分布频率也很高, 平均1 000bp就有1个SNP, 这些标记随着水稻基因组的实施而被发现和利用。由于SNP具有同一个位点多态性低而全基因组多态性又极其丰富的特点, 并且分析时只需要进行阴/阳性分析而不需进行片段的长度分析, 特别适合用DNA芯片技术进行大规模的扫描分析, 是继微卫星后最为高效的标记。不过其昂贵的成本 (开发和使用的成本都很高) 使其应用受到一定的限制。建立可供利用的SNP标记需经过以下几步: (1) 全基因组测序; (2) 根据测序结果确定特定的序列标记位点; (3) 对STS进行扫描, 寻找SNP位点; (4) 确定SNP; (5) 将SNP定位到染色体上。
5 单链构象多态性 (Single Strand Conformational Poly morphism, SSCP)
SSCP是指DNA单链构象的多态性, 是基于PCR扩增而新发展起来的一项检测DNA多态性的分析技术。在进行SSCP分析时, 利用PCR特异的扩增出基因组目的DNA片段, 然后将这些扩增出来的DNA片段进行变性处理, 使双链DNA分开成单链, 再用非变性凝胶电泳分离。由于在自然状态下, 单链DNA会折叠卷曲, 形成一定点空间构象, 这种空间构象是由DNA链的碱基序列决定。如果扩增的目的DNA片段序列的碱基发生了变异, 就可能造成其单链的空间构象发生改变, 从而影响其单链电泳时的迁移速率, 导致其在电泳图谱上的带纹位置不同, 显示出不同生物个体DNA的特异性。
6 新型分子标记的开发及其应用前景
自从20世纪70年代第1代分子 (RFLP) 标记出现以来, 分子标记家族迅速发展繁荣起来, 并且准确性和灵敏性也一步步提高。目前的SNP技术已经可以在单个核苷酸的水平上找出不同样本之间的差异, 即使它们之间的亲缘关系非常接近。
纵观分子标记的发展, 是伴随着人们对生命本质的认识一步步加深, 认识范围从宏观表型一步步逼近微观世界的进程同步发展的。任何一个特殊生命现象的发现, 都可能导致革命性的理论或技术的产生, DNA双螺旋理论的提出导致了DNA的自我复制理论, 又进而导致了PCR技术以至于后来的全自动PCR仪的问世 (当然也少不了其间Taq聚合酶的发现) 。比如各种类型的外切酶和内切酶的发现导致了RFLP技术的产生。
分子标记 篇2
采用简化的CTAB法提取了16种有香和无香春兰的基因组DNA,并以此为模板,采用BA系列的100条随机引物,进行RAPD分析,其中引物BA0088(G08)对香花春兰的扩增产物中具有一条特异性的`370 bp的条带,带型清晰,重复性较好,为进一步确定与香味成分相关基因连锁的RAPD标记打下了基础.
作 者：王健 乐超银 谢伟 梁薇 林直 郭政宏 作者单位：王健,乐超银,谢伟,梁薇,郭政宏(三峡大学生物技术研究中心,湖北,宜昌,443002)
林直(三峡大学图书馆,湖北,宜昌,443002)
分子标记 篇3
关键词：玉米；RAPD；体系
中图分类号：S513 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2012）-10-0050-1
RAPD（random amplified polymorphic DNA，RAPD）也称之为AP-PCR（Arbitrary Primer PCR），即随机扩增多态性DNA技术，是由Williams和Welsh等发明的分子标记技术，是一项基于PCR技术的分子生物技术[1，2]。是以基因组DNA为模板，常以一个10mer随机的寡核苷酸序列作引物，通过PCR扩增，产生许多不连续的DNA产物，以检测DNA序列的多态性。它可以在物种遗传背景没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行基因组指纹图谱进行研究，还可用于检测体细胞杂种和微生物分型[3]。
玉米是最为古老的栽培作物之一，目前为我国栽培作物的第二位。吉林省是我国的玉米大省，玉米种植面积在全国位于前五，每年审定的新品种数目为全国第一。由于目前玉米为品种检定手段还不完善，导致品种管理有一定的难度。故本文进行了玉米RAPD分子标记体系的相关研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
购买市售玉米主推品种种子。
1.2 试验试剂和仪器
TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer（含Mg2+）、10碱基随机引物、dNTPs；琼脂糖、DNA分子量标准（D2000Maker）等购自上海生工。
1.3 RAPD方法
1.3.1 DNA的提取 以玉米种子产生的嫩芽为材料，使用植物基因组试剂盒提取。DNA回溶于灭菌水中，-20℃保存备用，1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。
1.3.2 RAPD条件及扩增程序 根据王志刚[4]RAPD反应体系文献，玉米RAPD初始25μL反应体系包括：2.5μL 10×PCR Buffer、0.2μmol·L-1引物、0.5U Taq DNA聚合酶、0.1 mmol·L-1dNTPs、20ng模板DNA，用ddH2O补齐反应体系到25μL。
RAPD-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性50s，38℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，72℃后延伸10min，4℃保存。
1.3.3 RAPD反应体系优化 模板DNA浓度，TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTP定量对影响RAPD反应结果影响较大须进行优化。本试验将各种影响因素设置梯度，并进行正交实验，对各个相关参数进行了优化，以建立较为完善的反应体系和程序。
1.3.4 RAPD产物检测 取5μl扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上进行检测。凝胶成像分析系统照相保存数据并分析结果。
1.3.5 引物的筛选 将所选择的样品提取的DNA等量的混合，作为筛选引物的 DNA为模板。并对购买的100个随机引物分别进行相同条件的RAPD扩增，初步筛选出若干个多态性引物。再经过二次筛选，选取扩增DNA条带型清晰、差异性和多态性好的引物。最后确定出最佳的随机扩增引物。
2 结果
2.1 基因组DNA提取质量的检测
本试验使用试剂盒提取玉米基因組DNA，以1%的琼脂糖凝胶上检测，结果如图1所示。
图1 玉米基因组电泳检测结果
从图中可以看出，主带清晰，无拖带现象，间亮度均一，一般每克材料提取DNA产量在30～40?g之间。说明提取基因组DNA质量好，产率高，完全满足RAPD反应体系的要求。
2.2 引物的筛选
通过实验从100个随机引物中，筛出22个扩增条带清晰，多态性好的引物。图2为部分实验结果。
图2 玉米RAPD部分实验结果
2.3 RAPD反应体系
通过实验对影响RAPD扩增结果的因子进行研究筛选，并对其影响因素进行了优化，筛选出了最合适玉米的RAPD条件，并利用该体系对所选的材料进行扩增，得到了清晰、多态性高的谱带，具有较好的重复性，说明该体系稳定可靠，适合于玉米的研究。
参考文献
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[4] 王志刚，张志宏，李贺，等.利用RAPD和SCAR标记鉴定草莓品种.园艺学报，2007，34（3）：591-596.
植物分子标记研究进展 篇4
关键词：植物分子标记,原理,应用,进展
分子标记 (Molecular Markers) , 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记, 是DNA水平遗传多态性的直接反映。它是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记方法。随着分子生物学的发展, DNA分子标记技术已有数十种, 分子标记的方法越来越表现出其优越性。目前, 在物种亲缘关系鉴别、基因组作图、植物遗传育种等方面分子标记已得到了广泛应用。
1 第1代分子标记
1.1 限制性内切酶片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
RFLP是以DNA-DNA杂交为基础的第1代分子标记, 由于不同个体等位基因之间碱基的替换、插入、缺失或重复等变化, 造成了限制性内切酶的识别和酶切发生改变, 从而造成基因型之间酶切片段长度的差异, 可反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。RFLP在基因组中以低拷贝编码序列为主, 存在稳定, 具有共显性的特点。但其操作工序比较复杂, 对DNA的需求量也比较大, 不仅成本高, 而且检测的周期较长, 在大规模的分子育种中不适用。
余四斌等利用RFLP对生产上广泛应用的优良杂交组合汕优63的分离群体进行分析, 很好地定位了32个控制产量及其构成性状的QTLs[1]。孙传青等利用RFLP分子标记研究了中国、南亚、东南亚普通野生稻与栽培稻和粕粳之间的遗传分化关系, 研究表明粕粳演化是多途径的, 粕粳分化是栽培稻核DNA遗传分化的主流[2]。
1.2 随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)
RAPD技术是建立在PCR基础之上的。它应用了PCR的反应原理, 以基因组DNA为模板, 在热稳定的DNA聚合酶作用下, 以单个随机核苷酸序列 (通常为10个碱基对) 为引物, 进行PCR扩增。扩增产物经过电泳的分离、染色后, 采用紫外透视仪进行检测。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。与RFLP相比, RAPD需要的模板量较少、灵敏度高、操作简便、快捷的特点, 在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。但易受试验条件影响, 重复性差, 产率低[3]。胡保忠等利用RAPD分子标记用43个随机引物对11个紫花苜蓿进行扩增, 共检出440条扩增片段, 对紫花苜蓿进行了很好的聚类分析[4]。
1.3 扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)
AFLP是基于PCR的一种选择性扩增特异片段的方法。对不同物种的基因组DNA进行利用, 经过限制性内切酶的酶切后, 可以得到大小不同的分子片段, 将酶切片段与相应的接头连接, 以接头序列及邻近内切酶的识别位点作为引物的结合点, 采用含有1~3个选择性碱基的不同引物进行DNA扩增, 不同选择性碱基的数目、种类和顺序决定了扩增片段的特异性。扩增产物经放射性同位素标记、电泳分离, 最终根据凝胶上DNA条带的有无来检验其多态性。它兼具了RFLP的可靠性和RAPD的方便性等优点, 但它对DNA的纯度要求较高, 操作繁琐。黄想安等利用AFLP技术表明石蒜属具有非常高的种间遗传多样性, 为石蒜物种的分类鉴定提供一个很有效的依据[5]。
2 第2代分子标记
主要包括简单序列重复 (Simple Sequence Repeat, SSR) 。SSR也称微卫星DNA, 不同的重复碱基对串联数目决定了其高度多态性。它根据微卫星两端互补序列进行引物的设计, 然后通过PCR进行扩增, 由于不同的核心序列串联重复数目, 扩增出的PCR产物的长度也有所不同, 通过电泳技术对扩增的产物进行分离, 结合片段的大小决定基因型, 并对等位基因的频率进行计算。在真核生物中可根据其两端的高度保守序列, 设计双引物进行PCR扩增, 深入揭示其多态性[6]。SSR一般可检测1个单一的多等位基因位点, 其位点呈共显性遗传, 同时检测所需DNA量较少。Han等利用SSR标记构建了第1张含有小豆SSR标记的分子遗传图谱[7]。
3 第3代分子标记
主要包括单苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) 。SNP标记是基于DNA芯片技术的第3代分子标记, 包括单个碱基的插入、缺失等[8], 主要是由于单核苷酸发生了突变而造成。SNP的位点广、遗传稳定性较好, 检测迅速, 适合于数量较大的检测分析。Xu等通过检测水稻亲本9311, 检测到了768万个SNP位点, 绘制了1张高密度的Bin图谱。通过Bin图谱, 定位1个重要的QTL[9]。朱磊利用SNP标记精细定位水稻苯达松敏感致死基因, 得出该基因位于第3染色体上0.4 c M范围内, 且4个SNP标记与其共分离[10]。
4 新型分子标记
4.1 多样性芯片技术 (Diversity Arrays Technology, DArT)
DAr T技术是2001年发明的一种基于芯片杂交技术的新型分子标记技术。其主要依靠不同来源的基因组DNA中特定限制性内切酶位点的分布不同, 从而产生多态性Heller-Uszynska等首次在甘蔗属内采用了该技术, 对其遗传关系进行了分析, 且构建了遗传图谱, 结果表明甘蔗的原始种和栽培种之间遗传差异大, 且大多数DAr T标记与孟德尔分离规律相符合[11]。高轶静等利用7份不同种属的甘蔗材料为样本建立DAr T标记体系, 结果表明其遗传相似性分析结果与材料预期的亲缘关系密切程度相一致[12]。
4.2 靶位区域扩增多态性 (Target Region Amplified Poly-morphism, TRAP)
TRAP是一种在2003年被提出的基于PCR的新型分子标记[13]。该技术是基于已知的c DNA或EST序列信息, 主要在遗传图谱的构建、重要性状的标记等方面应用。Hu等应用TRAP技术扩增出菠菜中59个TRAP多态性标记[14]。Chen等采用了TRAP标记对小麦比较基因组图进行了绘制, 并证明Qfhs.ndsu-3AS与Qfhs.ndsu-3BS不同源[15]。
4.3 限制性内切酶位点标签 (Restriction-Site Associated DNA, RAD)
RAD标记技术是2007年开发的一种应用于非模式生物的分子标记, 目前已应用于寻找DNA多态性, 鉴别SNP, 基因测序, 构建遗传图谱, 定位目的性状基因, 研究生物多样性等方面。Chutimanitsakun等利用已知序列的RAD标记绘制出了高质量的遗传连锁图谱, 验证了对于单个基因位点的检测和QTLs[16]。Barchi等利用RAD测序, 测定茄子超过10 000个SNP位点, 1 600个多态性位点和1 800个假定的SSR位点, 对于构建茄子的遗传图谱有重要意义[17]。
5 结语
分子标记技术在蝇类研究中的应用 篇5
DNA分子标记作为新发展起来的一种遗传标记形式,凭借其可靠有效等优点,在动植物研究中的应用已越来越广泛.本文主要综述了DNA分子标记技术的`发展及其在蝇类研究应用的进展,并对有关问题进行了初步讨论和展望.
作 者：王亚超 白林 侯蓉 WANG Ya-chao Bai Lin HOU Rong 作者单位：王亚超,白林,WANG Ya-chao,Bai Lin(四川农业大学动物科技学院,四川雅安,625014)
侯蓉,HOU Rong(成都大熊猫繁育研究基地)
分子标记 篇6
摘 要：利用已发表的区分胡萝卜育性的标记引物对胡萝卜线粒体DNA进行PCR扩增，开展育性鉴定研究。结果表明，所用的2对标记引物都能用于区分一种遗传背景的材料组合，并可用于品种纯度鉴定，而另一种材料组合不能区分。
关键词：胡萝卜;线粒体;PCR;分子标记;育性
中图分类号：S631.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.002
Deferential Carrot Sterility and Fertility by PCR Molecular Marker
FU Ren-sheng1，GUAN Chang-zhi1，YIN Li-rong1，CHEN Lei1，DUAN Hong-ying2，LIU Jun-huan3
（1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology， Tianjin 300384， China; 2.Tianjin Xiqing Plant Protection Station，Tianjin 300381， China; 3.Tianjin Wuqing Plant Protection Station， Tianjin 301700， China）
Abstract： Cytoplasmic male sterility usability is important for carrot F1 hybrid development .Carrot mitochondrion DNA was isolated and PCR amplified by published primers. The results showed that two pairs of marker primers could be utilized to deferential one material combination and identify variety purity， not able to deferential another material combination.
Key words： Daucus carota;mitochondria;PCR;molecular marker;sterility and fertility
植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility， CMS ） 是人类能够高效利用植物生产的一类重要性状，雄性不育性状的鉴定通常是在植物开花时观察鉴定[1-4]，分子生物学的发展为细胞质雄性不育研究提供了新的有效手段，其优点在于在植物生长发育的任何阶段，只需提取适当的DNA即可鉴定。胡萝卜CMS的发现应用对人类培育胡萝卜F1杂交品种具有决定性的作用，开展胡萝卜CMS分子水平的研究具有重要意义，国内学者在分子水平上开展了胡萝卜CMS相关工作，如于春霞、梁毅等对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行了cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段[5-6]，但仅限于少量的试验材料，未见报道加以应用。国外学者对胡萝卜细胞质雄性不育分子水平开展了研究，结果认为细胞质雄性不育与线粒体有关[7-9]，并获得线粒体上与雄性不育有关的DNA标记，采用基于PCR的SSR标记区分胡萝卜“瓣化型”雄性不育植株和可育植株[10]，并在多个胡萝卜不同根型的线粒体上进行区分验证，能较好地区分。本研究选取已发表的标记引物，对课题组拥有的胡萝卜材料进行育性鉴定研究，以期拓展现有标记应用范围，为进一步筛选稳定、可靠的胡萝卜CMS的标记奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
胡萝卜Sk4为瓣化型CMS，HY 为可育。Sk4×HYF1为Sk4与HY杂交种，瓣化型CMS，HYEH为瓣化型CMS。HYEH×HYF1为HYEH与HY杂交种，瓣化型CMS。
1.2 方 法
1.2.1 胡萝卜线粒体DNA的提取 胡萝卜种子分别播种于口径30 cm，高度25 cm的塑料盆中，待胡萝卜苗长至6～8片叶时，进行遮光处理1周，以减少淀粉因素的干扰，剪取黄化幼嫩叶片，采用从上海杰美基因医药科技有限公司购买的线粒体DNA提取试剂盒，鉴于胡萝卜是多糖和多酚类型材料，提取过程中增加了二硫苏糖醇（DDT）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。对最终提取获得的胡萝卜线粒体DNA提取物，在1%琼脂糖凝胶上进行了电泳，予以验证。电压100 V，电泳时间30 min，将染色凝胶在成像系统下拍照。
根据已发表文献确定2对引物，如表1。
1.2.2 PCR扩增 PCR 反应体系：反应总体积为20 μL，包括模板DNA 20～60 ng，Taq DNA 聚合酶0.5 U，dNTPs（each 0.1 mmol·L-1），1.5 mmol·L-1 MgCl2，引物0.4 μmol·L-1。将所有反应物混匀后，于PCR 仪上扩增（MJ PTC-200）。PCR反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 1 min，引物退火55 ℃1 min，72 ℃引物延伸2 min 30 s;72 ℃延伸7 min。PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。取PCR 产物6 μL 与1 μL loading dye 混合后上样，在电压为80 V 条件下电泳25 min，电泳结束后，将染色凝胶置于成像系统中观察并照相。
2 结果与分析
2.1 胡萝卜线粒体DNA的提取
泳道Ma为碱基5 000 bpMarker，1为胡萝卜Sk4×HYF1，2为Sk4，3为HYEH×HYF1，4为HY，5为HYEH。从图1可以看出，泳道1、2、3、4、5都有一条明显条带，表明成功提取了线粒体DNA，泳道3条带相对较浅，应是线粒体DNA浓度较低。
2.2 引物1扩增片段
利用引物1对Sk4×HYF1，Sk4，HYEH×HYF1，HY，HYEH进行PCR扩增。从图2可以看出，泳道3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）都出现了1条相同的扩增条带，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带的碱基大小应为1 100 bp，而其他泳道未出现扩增条带。1（Sk4×HYF1）和2（Sk4）都为雄性不育系，也未扩增出条带，试验结果表明该引物不能对全部不育系都扩增出条带。
2.3 引物2扩增片段
利用引物2对Sk4×HYF1，Sk4，HYEH×HYF1，HY，HYEH进行PCR扩增。从图3可以看出，泳道1（Sk4×HYF1），3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）都出现了1条相同的扩增条带，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带碱基大小应为321 bp，而Sk4为雄性不育系，未扩增出条带，本试验表明该引物也不能对全部不育系都扩增出条带。泳道4（HY）有1条扩增条带，比泳道1（Sk4×HYF1），3（ HYEH×HYF1），5（HYEH）的条带略大，与Inga C.Bach等人研究结果比较，条带碱基大小应为392 bp。
3 结论与讨论
利用2对引物对Sk4×HYF1和Sk4扩增，都未能全部扩增出可以区分胡萝卜材料雄性不育和可育的标记片断。而Inga C.Bach等人研究结果为利用这2对引物都能区分试验全部的雄性不育和可育材料，所用的材料属于Imperator， Nantes， Imperator-Nantes， Danvers-Chantenay。而本试验的Sk4为Imperator-Kuroda，存在这种差异可能源于不同核基因组背景导致的线粒体基因组的重排或缺失和线粒体基因组动态特性。这也表明期望1至2个标记区分所有不同遗传背景的胡萝卜雄性不育和可育材料是不可靠的。因而，开发更多的标记区分胡萝雄性不育和可育就显得非常必要。
HYEH和HY分别是商业种 HYEH×HYF1的雄性不育母本和雄性可育父本，在该试验中，利用PCR扩增，根据条带的碱基大小区分胡萝卜雄性不育和可育，利用这一结果，2对引物都可用于商业种HYEH×HYF1生产制种的纯度检测，防止混杂有父本种子。
参考文献：
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光皮桦AFLP分子标记体系的建立 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
光皮桦试材来自浙江林学院智能温室。取正常生长的嫩叶,用冰壶带回实验室,液氮速冻后置-70℃冰柜保存。
1.1.2 试剂
主要试剂:EcoRⅠ和MseⅠ和T4连接酶购自纽英伦公司;Taq DNA聚合酶和dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司;引物及接头由北京奥科合成; 试验所有Marker分别为100 bp DNA Ladder 和DL2000 ,购自宝生物工程(大连)有限公司;银染试剂均购自北京鼎国公司;其他相关试剂均为实验常规药品。
1.1.3 仪器
Gene Amp PCR system 9700、Ts-2000A脱色摇床、Bio-RAD电泳仪、数控超级低温恒温槽、Sequi-GenGT核酸测序电泳系统、NanoDrop微量分光光度计(ND-1000)、Gel DocTM凝胶成像系统。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA的制备与检测
采用三种方法提取光皮桦叶片DNA,即SDS法[26]、常规CTAB法[27]、CTAB结合硅珠吸附法[28]。用NanoDrop微量分光光度计测定DNA的纯度和浓度。同时每个样品取5μL,加1μL上样缓冲液混合后,于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,在凝胶成像系统下观察并照相。
1.2.2 DNA的酶切与连接
采用EcoRⅠ和MseⅠ双酶切,反应体系为:模板DNA用量100～800ng,10×NEB buffer 5μL,100×BSA 0.3μL,EcoRⅠ(20U/μL,NEB)0.15μL,MseⅠ(10U/μL,NEB)0.3μL,加dd H2O至25μL。在37℃水浴条件下酶切1～6h。放入75℃水浴15min后,立即放于冰上冷却。取5μL反应液加1μL上样缓冲液混合后,在1%琼脂糖胶上电泳。
连接反应体系总体积为25μL,具体为:取酶切产物20μL,EcoRⅠ接头(10μmol/L)0.5μL,Mse Ⅰ接头(10μmol/L)1μL,10×buffer 2μL,T4 Ligase(400U/μL,NEB)0.1μL,ddH2O 1.4μL。在16℃条件下进行过夜连接。接头序列如下:
EcoRⅠ接头:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’;
3’-CATCTGACGCATGGTTAA-5’。
MseⅠ接头:5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’;
3’-TACTCAGGACTCAT-5’。
1.2.3 预扩增反应
预扩增反应体系为:连接产物2μL,E+A引物(50 ng/μL)1μL,M+C引物(50 ng/μL)1μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTPs(2.5mmol/L,TaKaRa)1.6μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL,NEB)0.2μL,加dd H2O到20μL。预扩增在ABI 9700 PCR仪上进行,反应程序为:94℃预变性2min;94℃ 30s,56℃30s,72℃1min,30个循环;最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μL预扩增产物加1μL上样缓冲液,混合后在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测预扩增效果。
1.2.4 选择性扩增
预扩产物稀释一定倍数后进行选择性扩增,具体反应体系为:稀释后的预扩产物2μL,E+ANN引物(20ng/μL)0.3μL,M+CNN引物(20ng/μl)1.8μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTPs(2.5mmol/L,TaKaRa)1.6μL,Taq DNA polymease(5U/μL,NEB)0.2μL,加ddH2O到20μL。预扩增在ABI 9700 PCR仪上进行,反应程序为:94℃预变性2min;94℃ 30s,65℃ 30s(以后每个循环降低0.7℃),72℃ 1min,13个循环;然后在56℃退火温度,其余条件不变的情况下,再进行24个循环;72℃延伸5min,然后4℃保存。
1.2.5 PAGE电泳及银染检测
反应结束后,选择性扩增产物与上样缓冲液(98%甲酰胺;10mmol/L EDTA,pH 8.0;0.25%溴酚蓝;0.25%二甲苯青FF)等体积混合,95℃变性6min,立刻将PCR管放到冰上待用。本实验中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的方法进行检测[29]。银染后的板晾干后在胶片观察灯下观察,选择那些具有清晰、电泳带易计数的引物作为AFLP反应的最佳引物。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取结果与检测
获取高质量的基因组DNA是AFLP成功分析的关键步骤之一。本实验采用的三种方法都能从光皮桦嫩叶中提取DNA,各项质量检测数据见表1。CTAB结合硅珠吸附法提取DNA的OD260/OD280比值在1.8左右,表明蛋白质等杂质去除较干净,纯度较高,但浓度相对较低,在90.0ng/μL左右。用1.0%的琼脂糖凝胶作电泳检测(见图1),点样孔内杂质少,带型整齐,无降解。而常规CTAB法和SDS法提取DNA的OD260/OD280比值皆大于2.00,电泳时点样孔内有亮点,说明有蛋白质污染。经比较,虽然CTAB结合硅珠吸附法提取的DNA浓度不是很高,但其质量是最好的,适用于AFLP分析。
M:DL2000 DNA Maker;A:CTAB-SiO2method;B:conventional CTABmethod;C:SDS method.
2.2 AFLP反应体系的优化
以往的一些研究认为,AFLP分析不仅模板DNA的用量少,而且对DNA的浓度也不敏感。本实验分别加入100～800ng量的DNA,进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增,结果在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测,可见各样品扩增条带在100～700bp,且300bp左右较为明亮,表明都获得了清楚的扩增带(图2)。最后经6%聚丙酰胺变性胶电泳,发现DNA浓度的不同没导致DNA条带多寡的变化,而且条带的清晰度也差别不大。
M:100bp DNAMaker;1-8:DNAusage of 100,200,300,400,500,600,700,800ng.
酶切是否完全直接影响到实验结果的正确性。酶切不完全会造成相应的指纹片断的缺失,得出不完整的片断信息而失真,同时也会使大片段增多不便于数带。实验中以300ng的模板DNA进行不同时间的酶切处理,经电泳检测发现1h未能酶切完全,而经2、3、4、5、6h的酶切,DNA片段都能被完全切开,且几乎没差别(图3)。
1:genomic DNA;2-7:Digest time is 1,2,3,4,5 and 6 hours.
预扩增产物的用量对选择性扩增结果有重要影响,实验采用300ng DNA经酶切、连接和预扩后,预扩产物分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60进行稀释,选择性扩增后在2%琼脂糖凝胶上电泳检测,发现稀释倍数为5、10、20、30、40和50时,结果一致,条带较清楚,主要在100～700bp左右,而不稀释或稀释60倍的效果相对较差(图4)。
2.3 引物组合的筛选
不同引物对DNA模板的结合力不同,同时模板不同对引物的反应力也有差异,从而导致扩增产物片段的长度、分布、紧密度等可能完全不一样。因此,进行AFLP分析时,对引物组合进行筛选是必需的。实验中预扩引物采用EcoRⅠ+A和MseⅠ+C组合,选择性扩增引物均采用3个选择性碱基,具体引物见表2。利用随机选取的8个光皮桦DNA样品对64个引
物组合进行了筛选,根据最终聚丙烯酰胺凝胶上反映出的条带数目、清晰度、多态性以及重复性情况,选择出了51个引物组合。
M:DL2000 DNAMaker;1-8:Diluted by 60,50,40,30,20,10,5,1 times.
注:“+”表示筛选出的符合要求的引物组合;“-”表示被淘汰的引物组合。Note:“+" and “-" means the selected and eliminated primer combinations respectively.
3 讨论
AFLP技术程序多且复杂,从基因组DNA的提取到电泳银染每个环节都必须严格要求,才能获得最佳结果。模板DNA的质量和完全酶切是AFLP试验成败的关键,经对比实验,用CTAB结合硅珠吸附法提取的光皮桦DNA质量符合AFLP技术要求,酶切时模板以300ng为宜,酶切时间设3～6h间。预扩增是一承上启下的步骤,既可以检测酶切和连接的效果,又可以对选择性扩增模板起到纯化的作用。预扩产物的稀释倍数对于选择性扩增的成败非常重要,稀释倍数太大易发生拖带现象,导致带型模糊,难以辨别;稀释倍数太小显带很弱或显不出带,不利于条带的读取及多态性片断的检出。本实验结果显示,以300ng的光皮桦DNA为模板进行AFLP分析时,预扩增产物稀释30倍较合适。AFLP步骤多且联系密切,因此建议在光皮桦AFLP分析时,每完成一步,最好取少量样品在琼脂糖凝胶上进行电泳检测,得到预期效果再进行下一步试验,这样既节省时间,又不浪费试剂。另外,在聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测时,就注意以下几个问题。一是胶质量的好坏直接影响结果的优劣,其中尿素的质量是关键因素,尿素质量不好,易产生拖尾现象,条带模糊分不开;二是显影时,显影溶液必须预冷至10～12℃,以减小背景杂色;三是染色后的洗涤步骤也是非常关键的,忌时间过长。
1-8:8 DNA samples;A:E-AAC M-CAC;B:E-AAG M-CTG;C:E-ACA M-CAG;D:E-ACT M-CAC.
分子标记在小麦研究中的应用 篇8
目前, 分子标记在生物遗传多样性研究、品系分析、高密度遗传图像的构建、微生物分型与鉴定、生态位变化、抗性育种等方面已得到了广泛应用。其优越性在于:1) 直接以DNA的形式表现, 在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到, 不受季节、环境限制, 不存在表达与否的问题;2) 数量极多, 遍布整个基因组, 可检测座位几乎无限;3) 多态性非常高, 自然界存在着许多等位基因变异, 不需要专门创造特殊的遗传材料;4) 表现为中性, 不影响目标性状的表达;5) 许多标记表现为共显性的特点, 能区别纯合体和杂合体;6) 遗传稳定, 可靠性强;7) 检测速度快, 操作简便。
分子标记大概可以分为三类:第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术, 其代表性技术为限制性片段长度多态型 (RFLP) 、DNA指纹技术等;第二类是以聚合酶链式反应 (PCR) 为核心的分子标记技术, 其代表性技术为随机扩增多态性DNA (RAPD) 、简单序列重复 (SSR) 、简单序列长度多态 (SSLP) 、简单重复序列间区 (ISSR) 、扩增片段长度多态 (AFLP) 、序列标签位点 (STS) 、序列特征化扩增区域 (SCAR) 、单链构象多态性 (SSCP) 等;第三类是以基因组序列为基础的分子标记技术, 其代表性技术为单核苷酸多态 (SNP) 和表达序列标签 (EST) [1]。
六倍体普通小麦是人类最重要的粮食作物之一。它含有A、B和D三个基因组, 构成一个庞大和复杂的总基因组。每单倍体基因组含有约16000Mb, 其中80%多为重复DNA。虽然小麦的微卫星研究起步相对较晚, 但发展迅速。本文就小麦SSR标记的运用进行综述。
1 小麦SSR标记的一些发展
微卫星 (microsatellites) 或简单重复序列 (simple sequence repeats, SSRs) 是以1~6个碱基为基本单元的串联重复序列[2]。它是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记, 是DNA水平遗传多态性的直接的反映。它是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术, SSR分子标记与其它类型分子标记相比具有多态性高、技术简便、成本低廉、易于操作、重复性和稳定性好等优点。因此目前在科技研究中得到广泛重视和应用。张传光[3]等利用均匀分布于水稻基因组的300个SSR标记对95个华南地区不同年代常规籼稻主栽品种进行分析, 研究了该地区常规稻品种的遗传多样性及其变化趋势。
在小麦研究方面, 通过对序列数据库的查询, Devos等首先对小麦SSR进行了研究[4]。他们将小麦储存蛋白的两个微卫星序列转换成PCR标记。这些标记是基因组专化性的, 表现出高水平的变异。这是对序列数据库的删选。之后又有Roder[5]、Ma[6]等对克隆文库进行了删选。
表达序列标签 (EST) 一般是长度为150~500bp的基因表达序列片段, 一段EST序列代表生物体某组织某一时期的一个表达基因[7]。EST技术是1991年建立起来的一种快速鉴定大批表达基因的简便技术, 是将m RNA转录成c DNA并克隆到载体构建成c DNA文库后, 大规模随机挑选c DNA克隆。对其5′或3′端进行一步法测序所获序列与基因数据库中已知序列比较, 从而获得在转录中对生物生长、发育、繁殖、变异、衰老等一系列生理生化过程认识的技术。
由于国际小麦簇EST协作网 (International Triteace EST Cooperation, ITEC) 的建立, 小麦EST研究发展迅速, 到2001年已有近90000条EST被开发, 并可以在http://wheat.pw.usda.gov/genome/上获得其序列。小麦EST不断增加为新的SSR标记提供了一个巨大的有价值的来源。从表达序列中产生的SSR标记将为功能基因提供“绝对的”标记, 这将可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定。许多三核苷酸和更多核苷酸重复也存在于EST中, 这些标记在中间也许比双核甘酸重复更具有可转换性。基因中的SSR标记作图将允许相关种间更详细的比较作图。
2 SSR标记在小麦中的应用
2.1 小麦及其亲缘种的遗传作图
与RFLP标记对比, 大多数小麦SSR标记都是基因组专化性的, 只在小麦A、B或D基因组含有一个SSR的特定位点扩增[8]。由于利用方便和高信息量, SSR已替代RFLP进行小麦的遗传作图。迄今有近千个SSR标记已作图。而小麦的第一张微卫星遗传图谱也是由Roder等于1998年建立的。六倍体小麦的微卫星标记也为其他一些近缘种属提供了很好的分子标记来源。对于后代遗传变异, 也可以利用SSR技术对其进行检测[9]。
2.2 小麦遗传多样性研究
在DNA标记中, 小麦种应用最普遍的RFLP和RAPD仅检测到低水平的多态性。相比之下, SSR更丰富和普遍存在, 具有高度的变异性和高多态性信息量。由于这些特征, SSR标记在鉴定小麦遗传多样性的作用, 在其应用于小麦研究中一开始就得到证明[10]。在对小麦抗病性的研究中, SSR标记成为必不可少的技术[11]。这为小麦品种的选择提供了分析的依据[12]。
2.3 鉴别小麦细胞遗传学材料
SSR由于其丰富的多态性和随机分布在小麦整个基因组, 也为小麦细胞学遗传材料的真伪鉴别提供了有力的工具。此外, 在四倍体小麦中, SSR标记可被用于进行D染色体附加系的鉴定。
2.4 基因标记与作图
寻找与目标性状紧密连锁的分子标记是进行分子辅助选择育种的基础。迄今有决定许多重要小麦性状的近百个主效基因和一些QTL已获得不同类型的分子标记[13]。
2.5 系谱分析和标记辅助选择
在其他的一些作物研究中, 已经证明SSR标记能够十分稳定和可靠地在系谱中追溯目的单基因或数量性状基因座流。在小麦方面, 也有对多个冬小麦新品种 (系) SSR标记遗传差异进行的研究, SSR标记的聚类结果也与系谱的划分基本一致[14]。SSR标记是坚定小麦品质资源亲缘关系的一条有效途径。
由于共显性性质、多态性高、廉价和使用方法等优点, SSR标记是辅助选择育种的理想分子标记。在小麦分子辅助育种方面, 少数重要性状的SSR标记也正在用于辅助选择, 如利用SSR标记进行小麦抗大麦黄矮病毒的标记辅助选择[15]。另外一些小麦重要性状的SSR标记的有效性已得到检测, 可用于辅助选择。
分子标记在澳洲坚果上的应用 篇9
我国澳洲坚果的种植起步较晚,广西壮族自治区亚热带作物研究所于20世纪70年代陆续从澳大利亚批量引入优良澳洲坚果品种在广西种植,20世纪80年代末至90年代初,我国才开始商品性种植发展,现主要分布于华南和西南部分地区,其中云南的种植面积最大。
分子标记不同于形态标记、细胞学标记和生化标记,它是以生物遗传物质DNA的多态性为基础的遗传标记。广义的分子标记包括两类,即同工酶标记和DNA标记,狭义的分子标记仅指DNA标记。由于澳洲坚果的栽培史仅有150多年,与其他木本果树相比研究较为薄弱,而分子标记在澳洲坚果上的应用也较少。本文将对近年来分子标记技术在澳洲坚果研究中的应用进展进行概述。
1 应用于澳洲坚果的分子标记种类
理想的分子标记应达到以下几个要求:(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合与纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;(6)选择中性(即无基因多效性);(7)检测手段简单、快速;(8)开发成本和使用成本尽可能低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好。但目前尚未有一种分子标记能满足上述要求。目前在澳洲坚果上已有报道的分子标记手段有同工酶、AFLP、RAPD、SSR、RAF等,其中RAF技术在国内其他果树上尚未见有相关的应用。
RAF(randomly amplified DNA finger printing,即随机扩增DNA指纹)标记是典型的显性遗传标记。由Waldron等[1]将DAF标记进行改良后而建立。它是一种基于任意引物聚合酶链反应的DNA标记技术,可有效地提高任意引物的检测效率。RAF标记类似于DAF标记,由于在PCR循环中它的扩增子被放射性的33P或荧光所标记,因此表现出较好的稳定性和较高的灵敏度。采用RAF对基因型的未知微卫星标记进行研究的方法则被称为RAMiFi(randomly amplified microsatellite finger printing),即随机扩增微卫星指纹[2]。与AFLP标记相比,RAF标记在许多植物基因组(如甘蔗和小麦的一些大的和复杂的基因组)的研究上具有更高的效率及可靠性。其优势在于无需酶切,花费低,灵敏度高,可靠性好,对DNA模板的质量要求不高等。
2 分子标记在澳洲坚果上的应用
2.1 品种鉴定及遗传多样性分析
在植物的育种过程中,若需要抑制近交衰退或达到最大的遗传多样性,就必须了解个体间遗传距离。由于全球澳洲坚果的生产仅依靠一个有限的基因库,因此在澳洲坚果上同样要面对这一问题[3]。遗传多样性是生命系统的基本特征,也是物种适应自然和发生进化的遗传基础。基因型不同的品种或亲缘关系不同的物种,基因组内核苷酸系列存在差异。原先对澳洲坚果种质变异性的研究主要通过形态学及农艺学上所表现出的性状进行,但这一方法却易受环境修饰等因素变化的影响。而分子标记产物的多态性反映了被测材料的多样性,可有效地检测种质资源的遗传多样性。在澳洲坚果的系统演化、物种与品种的亲缘关系和分类方面应用分子标记技术,可提供分子水平上的客观依据,且比传统方法更能反映物种间的遗传多样性。
Vithanage等[4]首次将9个同工酶用于对来源于M.integrifolia、M.tetraphylla、M.ternifolia以及杂交和实生选育获得的共73个品种进行遗传多样性分析。结果发现其中7个同工酶所获得的条带已具有足够的差异,可将参试样品区分开。而葡糖磷酸异构酶(PGI)所表现出的多态性最高。研究结果证实了原先对部分栽培品种起源的认定,对澳洲坚果的野生种及其他非栽培种的种质保存及遗传改良具有重要的意义。Aradhya等[5]利用8个同工酶将45个澳洲坚果品种分为4个类群,在最大的一个类群中包括所有来自M.integrifolia的参试样品以及M.ternifolia的3个品种,而所有夏威夷的品种分为2个亚类。由此推断夏威夷的栽培品种可能起源于2个不同的居群,而M.ternifolia可能是M.integrifolia的变种。
Steiger等[6]利用AFLP技术在澳洲坚果上检测到丰富的多态性。虽然结果与同工酶技术所得结果略有差异,但从聚类分析的结果来看,9个栽培品种所产生的2个亚类大体上与Aradhya等(1998)的聚类结果一致。所出现的差异可能是由于标记性质不同所致。由于所得M.ternifolia和M.integrifolia之间的遗传距离相对较远,因此否定了M.ternifolia可能是M.integrifolia的变种的看法。
Vithanage等[7]利用RAPD及SSR技术对76份澳洲坚果种质进行遗传多样性研究。其中品种A4、A16与Renown聚在一个亚类中,与Vithanage等(1992)的结果一致。这符合实际情况,因为A4与A16均从开放授粉的Renown后代中筛选而得。但也出现了未能解释的情况,同样以Renown为母本的A29、A104及A199不与之聚为一个亚类,其原因尚待进一步研究。
RAF标记在澳洲坚果遗传多样性的研究上检测效率较其他标记更高。Peace等[8]利用此技术在澳洲坚果的30个主栽品种上发现了19个新的共显性标记,它们与显性标记相结合,构建出这30个品种所特有的指纹。Peace等[9]利用RAF标记对南非38个主栽品种的研究结果表明几乎所有夏威夷选育的品种(包括741及741u)都是光壳种,而南非所选育出的杂交种(Nelmak 1及Nelmak 26)较之澳大利亚选育出的杂交种(A4及A16)更接近于粗壳种。并提出夏威夷所选育出的741u实际上就是741,而741s即Makai(HASE 800),这一发现纠正了澳洲坚果品种上的错误命名。
郭凌飞等[10]利用ISSR技术对17份澳洲坚果种质进行亲缘关系分析,能有效地将17份种质区分开,认为澳大利亚所选育的澳洲坚果品种遗传背景和选育史较之夏威夷选育的品种更为复杂,因此在聚类上澳大利亚选育的品种各自聚为一类。并提出桂热一号与夏威夷选育的品种间的相似系数较大,因此其实生母体应是源自夏威夷选育的品种,与夏威夷品种具有较为相似的遗传背景。
2.2 遗传图谱的构建
由于澳洲坚果的人工杂交相对较难,不易得到适宜作图的杂交群体,因此目前在澳洲坚果遗传图谱构建方面的研究相对较少。Peace等[11]利用RAF标记构建了首张澳洲坚果遗传图谱。该图谱基于“Keauhou(HASE 246)”和“A16”的杂交F1代56个个体所构建。在382个标记中有84%按照孟德尔遗传位点分离。利用90个覆盖1100 cm并跨越70%～80%基因组的桥接基因座可将亲本分离图谱合成为一份详细的遗传图谱。该图谱含有24个连锁群,265个标记,其中有259个标记来源于随机扩增DNA指纹(RAF)。
2.3 检验离体再生幼苗的无性系的稳定性
由于组培过程中的重复继代培养或极端培养条件可能导致体细胞突变,对于木本果树而言,要通过表型性状以确定是否发生突变需要很长的时间,而采用分子标记技术则可迅速判断离体再生幼苗是否发生突变。Richard等[12]利用RAPD技术对3个母本植株及10个由母本植株获得的离体再生幼苗进行分析,发现母本植株与其微繁殖后代之间的无性系的完整性无明显差异。
3 存在问题与展望
由于栽培历史不长,对澳洲坚果的研究较之其他木本果树起步较晚,国内目前尚处于基础研究阶段。从整体上来看,近年国外对澳洲坚果在分子水平上的研究有了长足的进步,但也存在一些问题:(1)目前在澳洲坚果上所采用的标记技术多为显性标记,不能区分显性纯合体和显性杂合体,这对于绘制遗传图谱、比较基因组研究和遗传多样性及亲缘关系检测较为不利;(2)一些新兴的标记技术如SRAP等尚未见有应用的报道;(3)目前所得到的澳洲坚果的RAF遗传图谱,并未覆盖所有连锁群,达不到精细作图所需的“饱和”状态。这也限制了QTL定位(Quantitative Trait Loci,数量性状定位)和MAS(Molecular Marker-Assisted Selection,分子标记辅助选择)在澳洲坚果上的发展与应用。要解决这些问题,就要采用更多的标记并扩大群体规模。
目前应用于澳洲坚果上的分子标记技术中,SSR标记必须开发出供试作物的特异引物,对于澳洲坚果这样基因组基础研究较薄弱的树种需借鉴其近缘种甚至是其他物种已开发的引物才可进行研究,且引物的开发成本相对较高,因此该技术能否在澳洲坚果上广泛应用取决于SSR引物的开发速度;RAPD技术虽然简便快速,但重复性较差;AFLP技术虽然集RFLP与RAPD的优势于一体,但由于受专利保护,若用于育种,成本较高。相较而言,RAF标记具有无需酶切,花费低,灵敏度高,可靠性好,对DNA模板的质量要求不高等优点,对澳洲坚果这样分子生物学研究相对滞后的果树来说较为适用。
相信随着分子标记技术的不断发展和完善,分子标记技术在澳洲坚果的遗传改良中将发挥更大的作用,成为传统育种的重要的辅助手段。
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分子标记 篇10
关键词：粳稻,褐飞虱,导入系,分子标记辅助选择
褐飞虱是我国水稻生产上最重要的害虫之一[1]。20 世纪90 年代以来, 褐飞虱在我国的发生和危害十分频繁和严重, 每年受害的水稻面积约占总种植面积的50%, 年均损失稻谷达100 万~150 万t, 在1991 年、1996 年的损失均超过250万t, 2005 年仅华东四省市的损失就接近250 万t[2]。目前, 防治褐飞虱主要是使用化学杀虫剂, 但滥用杀虫剂易导致褐飞虱产生再增猖獗和环境污染等问题[3]。实践证明, 抗虫品种的应用是控制褐飞虱种群最经济有效的方法之一。然而有关研究表明, 水稻品种对稻飞虱抗性筛选影响因素很多, 如供试水稻品种的苗龄、种子纯度、 稻飞虱虫源性质、虫量和虫龄等, 采用常规方法进行抗虫鉴定进而培育抗虫品种尤为困难, 而随着分子生物学的发展, 分子标记技术有望能够解决这一难题[3]。吕仲贤等[4]对1999—2002 年浙江省水稻育种攻关协作组提供的水稻品种 (系) 抗虫性鉴定发现, 浙江省水稻褐飞虱的抗性品种检出率有明显的下降趋势。以浙江省嘉兴市农业科学研究院选育的粳稻为代表的浙北粳稻品种每年在浙江杭嘉湖地区及整个长三角占据60%以上覆盖面积, 其褐飞虱抗性水平直接决定该地区水稻生产状况[5]。武汉大学将药用野生稻中的抗源导入栽培稻并育成了高抗褐飞虱品系B5, 对褐飞虱生物型1、2 型和在武昌大田捕捉的褐飞虱均具有高抗性, 其抗性机制表现为拒虫性和抗生性, 是一份较理想的抗虫材料[6]。然而迄今为止, 利用B5 培育抗褐飞虱的材料 (品系) 均为籼稻背景, 粳稻背景尚未见报道。该研究以B5 为Bph14、Bph15 基因供体亲本, 以浙北粳稻品种嘉58 和秀水134 为受体亲本, 通过杂交、回交和标记选择将Bph14、Bph15 基因导入粳稻中并研究抗性基因的表达。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试验中抗稻褐飞虱亲本为B5 (武汉大学何光存教授提供, 典型的籼稻类型) , 高感亲本为浙北综合农艺性状优良晚粳稻品种嘉58 和秀水134 (均为浙江省嘉兴市农业科学研究院选育) , 试验在浙江省嘉兴市农业科学研究院 (所) 试验农场进行, 各株系单本植, 插植规格为21.0 cm×16.7 cm, 水肥管理及病虫害防治按一般生产用田。
1.2 抗褐飞虱基因Bph14、Bph15、Bph14/15 导入系培育
该研究2010 年3 月于海南陵水以感虫的常规粳稻品种嘉58 和秀水134 为轮回亲本, 携带Bph14、Bph15 基因抗褐飞虱材料B5 为供体亲本, 通过杂交和回交构建重组自交系群体。采用系谱法选育, 在自交系群体中选择株型亲轮回亲本, 综合农艺性状优良的单株, 利用分子标记检测抗褐飞虱基因的基因型, 种子成熟时采用人工接虫鉴定, “南繁北育”。2013 年11 月于嘉兴农科院试验农场定型Bph14 - 嘉58、Bph14-秀水134、Bph15-嘉58、Bph15-秀水134、Bph14/15-嘉58、Bph14/15-秀水134 导入系。
1.3 抗褐飞虱基因Bph14、Bph15 分子检测
采用SDS法从水稻叶片提取基因组DNA[7]。根据Bph14和Bph15 定位的紧密连锁的分子标记, 选择在亲本间有多态性的PCR标记, 其中与Bph14 和Bph15 紧密连锁的SSR标记为MRG2329 和MS5, 在亲本中扩增出180 bp和200 bp左右的DNA片段, B5 的片段均表现较大, 受体亲本 (嘉58, 秀水134) 的片段小, F1 的带型为双亲杂合型。其中MRG2329和MS5 在各分离世代检测Bph14、Bph15 基因。与Bph14 紧密连锁标记MRG2329 序列为5′-TTGTGGGTCCTC ATCTCC TC-3′;5′-TGACAACTTTGTGCAAGATCAAA-3′, 与Bph15紧密连锁标记MS5 序列为5′-GCACATACAGAAA TGGTGAA-3′;5′-GGCAAGGGACATGTAGTAAC-3′。
PCR扩增体系为20 μL, 其中8 mmol/L Tris-HCl (p H值8.3) , 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L Mg Cl2, d NTP各0.2 mmol/L, 5ng左右的DNA模板, 引物各0.5 μmol/L, Taq E 1U。PCR反应程序为:95 ℃预变性4 min后, 进行35 个循环扩增, 循环条件为94 ℃变性30 s, 55 ℃复性30 s, 72 ℃延伸1 min, 最后在72 ℃中延伸4 min, 于4 ℃下保存。PCR产物用4%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 抗褐飞虱基因Bph14、Bph15, Bph14/15 导入系抗性表型鉴定
导入系的抗性进行, 采用苗期集团法接虫鉴定。具体方法为将供试材料、亲本和对照品种秀水134 浸种、催芽后, 播于水泥槽 (600 cm×100 cm×50 cm) 内, 设置3 个处理, 播种15 粒芽势较为一致的种谷, 行长15 cm, 行距5 cm, 正常水肥管理。待苗至2 叶1 心时, 按每苗3~5 头2~3 龄若虫接虫, 2~3 次重复。抽穗期抗性鉴定, 具体方法为:孕穗初期, 在每行的第1 丛水稻面前放置1 丛带卵株作田间接种, 任稻飞虱自由分布。害虫经1 个世代繁殖后, 数量渐多, 虫压增大。由此可逐步看出水稻被害程度。在稻褐飞虱主害代, 当2个感虫对照品种全部枯死时, 调查各供试材料被害情况并定级, 该种方法以自然诱虫为主, 人工补充虫源为辅。在鉴定稻田区的四周种植5 行感虫品种嘉58, 秀水134 为保护行, 参试导入系种植5 行, 8 丛/行, 行株距16.7 cm×21.0 cm, 3 次重复, 随机排列, 褐飞虱为生物型1、生物型2 和生物型3 的混合群体, 由浙江省嘉兴市农科院植保所提供。抗性鉴定参照刘光杰等的评价标准进行[8], 当感虫对照品种TN1 死苗率达到95%左右时, 根据死苗率评定抗性级别。评价标准为:死苗率≤1.0%, 级别为0, 免疫;死苗率在1.1%~10.0%之间, 级别为1, 高抗;死苗率在10.1%~30.0%之间, 级别为3, 抗;死苗率在30.1%~50.0%之间, 级别为5, 中抗;死苗率在50.1%~70.0%之间, 级别为7, 中感;死苗率≥70.1%, 级别为9, 感。
2 结果与分析
2.1 利用分子标记辅助选育抗性基因导入系
2010 年3 月在海南陵水以B5 供体亲本, 嘉58 ( 品系) 和秀水134 为受体亲本配制杂交组合, 同年6 月在浙江嘉兴种植F1, 9 月以嘉58 和秀水134 为轮回亲本进行回交并获得BC1F1种子31 粒和45 粒。2011 年1 月在海南陵水播种BC1F1种子, 分别获得29 株和44 株苗, 2011 年3 月在回交群体中选取形态亲嘉58 和秀水134 的单株, 并进行分子检测Bph14、Bph15 基因型 (图1) 。在检测的17 株BC1F1群体中 (嘉58/B5//嘉58) , Bph14 基因杂合株5 株, Bph15 基因杂合株6 株, Bph14/Bph15 双杂合株2 株, 无纯合基因单株;在28 株BC1F1群体中 (秀水134/B5//秀水134) , Bph14、Bph15基因杂合株分别为9 株和11 株, Bph14/Bph15 双杂合株4株, 无纯合基因单株。选择Bph14、Bph15 和Bph14/Bph15 杂合单株继续与嘉58 和秀水134 回交, 形成嘉583/B5 和秀水1343/B5 2 个群体, 同年6 月在浙江嘉兴种植BC2F1。 此后通过嘉兴正季和海南南繁, 1 年2 季, 目前已获得一批形态亲嘉58 和秀水134 自交BC1F5或BC2F5代的稳定株系。对分离世代单株利用分子标记检测Bph14、Bph15 基因, 淘汰不含目标基因的单株 (图2) , 对于目标基因杂合的单株, 在下一代分离群体中对于目标基因杂合的单株, 在下一代株系中继续进行苗期分子标记检测, 结合株型等形态进行农艺性状选择;对于目标基因纯合的单株, 在下一代株系中先进行农艺性状选择, 然后再检测目标基因是否纯合。通过苗期分子标记选择, 成株期农艺性状选择, 2013 年3 月在海南陵水定型一批Bph14 或Bph15 单基因纯合和Bph14/Bph15 双基因纯合且株叶形态亲嘉58 和秀水134 的稳定株系。2014年6 月在浙江嘉兴种植成112 个株系, 其中Bph14 基因纯合株系15 份, Bph15 基因纯合株系11 份, Bph14/15 双基因纯合株系4 份。
2.2 抗褐飞虱基因导入系抗性表现
2014 年在嘉兴正季再次通过分子检测验证Bph14 和Bph15 基因纯合的株系, 在嘉兴种植成112 份株系, 应用苗期群体鉴定技术对其进行了抗褐飞虱鉴定 (表1) 。可以看出, 抗虫亲本B5 的抗性级别为1 级, 2 个受体亲本均为9 级;15份Bph14 基因纯合的株系中, 1 份为高抗, 8 份为抗, 4 份表现中抗2 份表现中感;11 份Bph15 基因纯合的株系中, 3 份表现抗, 5 份表现中抗, 3 份表现中感。3 份Bph14 和Bph15双基因纯合的株系都为高抗。同时发现Bph14-嘉58 平均抗性级别为4.63 级, 低于Bph14- 秀水134 的2.50 级, 但Bph15- 嘉58 平均抗性级别为3.50 级, 高于Bph15- 秀水134 的6.0 级;Bph14/15 双基因纯合系在嘉58 和秀水134间均表现高抗, 聚合有Bph14 和Bph15 基因的株系, 其抗性水平明显高于单基因纯合的株系。 抽穗期抗性结果表明, 鉴定的33 份材料中24 份材料的苗期抽穗期的抗性级别表现一致, 吻合度达72.72%, 9 份材料抽穗期抗性级别较苗期低1 个级别。
注:HR表示高抗;R表示抗;MR表示中抗;MS表示中感;S表示感。
3 结论与讨论
在水稻育种实践中, 分子标记辅助选择技术已经被广泛应用, 在水稻抗白叶枯病方面, 已成功地选育出一批抗病优良品种[7], 对于水稻褐飞虱, 虽然发现了不少新的抗源, 在遗传分析和基因定位等方面也作了大量研究[8], 李进波等[9]利用分子标记技术将抗飞虱质源B5 携带的抗性基因导入杂交籼稻亲本中培育了一批褐飞虱抗性水平较高的育种材料。上述B5 中抗性基因的应用局限于籼稻背景下, 应用于粳稻背景中尚未见报道。本研究利用分子标记技术将B5 中抗褐飞虱基因导入浙北当家栽培粳稻品种中, 结果表明, B5 携带的抗性基因在粳稻背景中能够有效表达, 但抗性基因的表达在不同背景下存在差异, 研究结论证实了利用B5 改良浙北粳稻品种的可能性。
水稻褐飞虱的抗性, 由于苗期群体鉴定在实践中往往因为秧苗素质的差异尤其是苗龄差异而使抗性表现有变化, 前人研究认为, 水稻生长到四叶一心期抗性趋于稳定, 与田间抗性基本一致[10]。有研究认为, 水稻品种, 尤其是中抗品种, 由于微效基因作用的组合和积累, 其抗性水平随秧龄增加而提高, 植株生长到一定秧龄时才表现出来[11]。通过培育苗期抗虫的品系, 并在此基础上选育成株期抗虫品系是培育抗虫品种最重要的途径[12]。该研究结果表明, 获得的Bph14、Bph15导入系苗期抗性与抽穗成株期的抗性水平一致或接近, 苗期抗性对成株期的抗性具有重要参考价值, 这对抗褐飞虱育种实践具有指导意义。值得一提的是该研究获得的导入系综合农艺性状优良, 有望选育抗褐飞虱的粳稻品种。
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