总DNA提取

总DNA提取（精选十篇）

总DNA提取 篇1

关于山羊粪便中细菌DNA提取方法的研究, 之前尚未见报道, 本实验在提取山羊粪便中细菌DNA的基础上, 提取山羊粪便总DNA, 以探索出最适于提取山羊粪便总DNA的方法, 为后续实验提供基础材料。现将试验结果报告如下:

1 材料与方法

1.1 主要试剂

磷酸盐缓冲液 (PBS) , TE缓冲液, 十二烷基硫酸钠 (SDS) , 酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) , 氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 无水乙醇, 5 mol/L Na Cl, 十六烷基-三甲基-溴化铵 (CTAB) , 溶菌酶, 蛋白酶K, DNA Marker, 天根试剂盒, OMEGA试剂盒。

1.2 主要仪器

恒温水浴锅、高速离心机、漩涡振荡仪、加热炉、电泳仪、凝胶成像系统、核酸蛋白检测仪。

1.3 粪便样本的收集与预处理

直接采集山羊新鲜粪便于15 m L灭菌EP管中, -20℃保存, 待提取总DNA用。预处理:称取3 g粪便样本, 置于15 m L EP管中, 捣碎混匀, 加18 m L PBS缓冲液 (p H 7.4) , 放入摇床过夜。取出过夜处理的粪便样本, 涡旋混匀3~5 min, 3 000 r/min离心3 min, 取上清。重复以上步骤3次。取上清分装成6份, 每份1.5m L, 装入1.5m L EP管, 12 000 r/min离心10 min, 弃上清。

1.4 四种方法提取细菌DNA

1.4.1 酚-氯仿抽提法。

将所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶, 混匀后37℃水浴1 h, 加65μL蛋白酶K和65μL 10%SDS, 混匀后37℃水浴2 h。然后再用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 抽提1次, 4℃、12 000 r/min离心10 min后取上清, 加入等体积氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 4℃、12 000 r/min离心10 min后取上清, 然后用2倍无水乙醇沉淀DNA, 4℃、12 000 r/min离心5 min取上清, 最后用70%乙醇洗涤沉淀, 干燥后将DNA沉淀溶于50μL TE缓冲液中, -20℃保存。

1.4.2 CTAB法。

将所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶, 混匀后37℃水浴1 h, 加入30μL蛋白酶K和30μL 10%SDS, 37℃水浴2 h, 然后再加入100μL5 mol/L Na Cl和80μL CTAB/Na Cl, 65℃水浴10 min。水浴结束后再用苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 抽提, 最后将DNA沉淀溶于50μL TE, -20℃保存。

1.4.3 天根试剂盒法。按照试剂盒要求操作, 最后将所得DNA溶液于-20℃保存。

1.4.4 OMEGA试剂盒法。按照试剂盒要求操作, 最后将所得DNA溶液于-20℃保存。

将以上4种方法提取的DNA均取4μL上样在0.8%琼脂糖凝胶中电泳, 利用凝胶成像系统进行成像, 判断DNA完整性。

2 结果

2.1 DNA电泳检测结果

从图1可见, 酚-氯仿抽提法和CTAB法提取的DNA电泳条带较明亮, 但有严重的拖尾现象, 说明酚-氯仿法和CTAB法提取的DNA浓度较高, 但都降解成了大量的小片段。天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法抽提的粪便DNA全是均匀的抹带, 说明这两个试剂盒抽提的DNA完整性好, 且天根试剂盒法的抹带比OMEGA试剂盒法的亮, 说明天根试剂盒法提取的DNA浓度更高。

M:DNA Marker;1~3:酚-氯仿法提取的DNA;4~6:CTAB法提取的DNA;7~9:OMEGA试剂盒法提取的DNA;10~12:天根试剂盒法提取的DNA

2.2 DNA含量和纯度的检测

由表1可以看出, 酚-氯仿抽提法和CTAB法提取出的粪便总DNA含量较高, 而天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法提取的粪便总DNA含量偏低。OD260/OD280反映了DNA的纯度, 正常情况下OD260/OD280值约为1.7~2.0, 若OD260/OD280值小于1.7或大于2.0, 说明可能有蛋白质污染或RNA污染[3]。酚-氯仿抽提法和OMEGA试剂盒法提取DNA的OD260/OD280值均大于2.0, 说明存在RNA污染。CTAB法和天根试剂盒法提取DNA的OD260/OD280值在1.7~2.0内, 说明天根试剂盒法和CTAB法提取的DNA纯度较高。

3 分析

关于粪便中提取细菌总DNA的方法, 目前的报道虽然较多, 但由于其提取机理和步骤的差异, 所获得的DNA含量和纯度也各不相同, 导致在后续实验 (如PCR扩增、DNA测序等) 过程中的结果差异很大[4]。本实验比较了四种从粪便标本中提取总DNA的方法, 得到了可用于后续实验的DNA模板。

基因组DNA提取的理想方法, 首先要考虑到DNA的纯度和浓度, 这是分子生物学研究的基础[5], 其次要考虑到DNA的得率, 即提取率, 要尽可能减少DNA的降解[6]。本实验提取的是山羊粪便总DNA, 所以提取DNA的完整性很重要。通过对四种提取方法的比较, 我们发现天根试剂盒法提取的粪便总DNA虽然浓度较低, 但纯度高, 完整性好, 能为后续实验提供完整的DNA片段。本次实验预处理过程中将加PBS的粪便样本放入摇床过夜, 目的是使粪便充分溶解以保障抽提到高质量的DNA。

4 结论

四种方法均能提取出DNA, 传统的酚-氯仿抽提法经济可靠, 但提取的DNA完整性不好, 且纯度低。CTAB法提取的DNA浓度和纯度都较高, 但大量降解。天根试剂盒法提取的DNA虽然浓度低, 但操作方便简单, 时间短, 纯度高, 完整性好, 质量稳定。OMEGA试剂盒法提取的DNA完整性好, 但纯度和浓度都较低。综合考虑, 推荐使用天根试剂盒法作为提取山羊粪便总DNA的方法。

摘要：本试验比较了从山羊粪便中提取总DNA的四种方法的优缺点, 旨在为后续实验提供合适的提取方法。笔者首先采用PBS缓冲液过夜处理粪便标本, 继而通过酚-氯仿抽提法、CTAB抽提法、天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法提取样品总DNA。结果显示:酚-氯仿抽提法提取的DNA完整性不好, 且纯度低;CTAB法提取的DNA浓度和纯度都较高, 但完整性不好;试剂盒法提取方便, 操作简单, 时间短, 但提取的浓度较低, 其中天根试剂盒法提取的DNA纯度高, 完整性好。综合考虑, 天根试剂盒法是提取山羊粪便总DNA的最佳方法。

关键词：山羊粪便,总DNA,提取,方法,比较

参考文献

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[5]张宁, 王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物, 2004, 25 (2) :40-46.

一种冰川微生物总DNA的提取方法 篇2

一种冰川微生物总DNA的提取方法

利用SDS高盐法对冰川微生物总DNA进行了提取,实验结果表明这种方法对不同区域的`冰川都可以提取到长度大于15kb的DNA片段,所得DNA应用细菌16S rRNA基因的引物进行PCR扩增,均能获得目的片段.因此,SDS高盐法是一种高效、简单的从小量冰川样品中直接提取DNA的理想方法.

作 者：尚天翠 SHANG Tian-cui  作者单位：伊犁师范学院化学与生物科学学院,新疆,伊宁,835000 刊 名：伊犁师范学院学报(自然科学版) 英文刊名：JOURNAL OF ILI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： “”(1) 分类号：Q33 关键词：冰川微生物   总DNA提取   PCR扩增  

总DNA提取 篇3

关键词：SDS法；CTAB法；基因组DNA；DNA提取；小白鼠；组织器官

中图分类号： Q523 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0047-03

DNA是生物体的基本遗传物质。基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作[1]，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。因此，学习、掌握DNA提取方法并对其进行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法[2-7]，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法进行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法[8-15]。目前，传统的SDS法和CTAB法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多[16-19]。基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2 试剂 dNTP、DNA Marker、高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物于Invitrogen 北京分公司合成，CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 SDS提取法 参照中真核基因组DNA提取方法[方案5][1]从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA并作适当修改。此流程最初由Palmiter等[20]提出，现在关于动物基因组提取的很多方法都是由此衍生而来的。其具体步骤如下：

样品预处理：解剖小鼠，PBS磷酸缓冲液冲洗各组织部位后，将组织尽量剪碎后分别放入冻存管，液氮速冻后，保存于-70 ℃。其中尾巴部位剪成1 cm左右小段。取小鼠不同部位组织至灭菌研钵中，液氮研磨。研磨好的样品放入到灭菌离心管中，为了便于试验结果的比较，将研碎的组织均加入到离心管500 μL刻度处。加入500 μL SNET裂解缓冲液，再加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）使终浓度达到400 μg/mL，充分混匀后，60 ℃保温1.5 h。待冷却至室温时加入等体积氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），上下温柔翻转5 min；12 000 r/min，室温离心10 min，取上清液转移到新的1.5 mL离心管中。加入2.5 μL RNaseA（10 μg/μL），37 ℃保温30 min除去其中的RNA。加入等体积氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），上下温柔翻转5 min；12 000 r/min，离心10 min，取上清液到1个新的1.5 mL离心管中，重复此操作1次。加入2/3倍体积异丙醇，-20 ℃静置10 min，沉淀DNA。4 ℃，12 000 r/min离心 10 min 收集沉淀的DNA。用70%的乙醇清洗沉淀，4 ℃12 000 r/min 离心5 min，去上清。用冷冻的无水乙醇清洗沉淀。4 ℃ 12 000 r/min离心7 min，去上清。室温干燥DNA。加入20 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 CTAB提取法 参照Doyle等的方法[3]，并进行适当修改。试验流程绝大部分与SDS法相同，只在划线处存在变动。划线处试验步骤改为：将研磨好的样品，加入预热好的4×CTAB提取液500 μL，同时加入10 μL的β-巯基乙醇。

1.2.3 基因組DNA琼脂糖凝胶电泳 2种方法提取不同组织部位的基因组DNA，每个样品吸取1 μL原液，选择λ-HindⅢ 作为DNA marker，0.8%琼脂糖凝胶电泳，120 V，30 min，EB染色后，凝胶成像仪（中国北京宾达英创科技有限公司，202D型）拍照保存。

1.2.4 基因组DNA质量和浓度测定 使用超微量分光光度计NanoDrop 2000（Thermo）检测DNA 的纯度及浓度，分别测定基因组DNA 在D260 nm 和D280 nm 的吸光度，以及D260 nm/D280 nm 和D260 nm/D230 nm比值。同时，测定提取的基因组DNA 的浓度。

1.2.5 PCR扩增 使用小鼠看家基因引物[21]Actin F（5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′）和Actin R （5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′） 进行扩增，目的片段长411 bp。试验采用20 μL体系，成分如下：13.7 μL ddH2O；2.0 μL 10×PCR Ex buffer；2.0 μL dNTP （2.5 mmol/L each）；0.8 μL Actin F（5 mmol/L）；0.8 μL Actin R （5 mmol/L）；0.5 μL DNA模板。提取的12个基因组DNA样品，根据浓度将其稀释成不同倍数，达到终浓度大约为8 ng/μL，用作PCR模板。PCR程序设为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL扩增产物，0.8% 琼脂糖电泳检测目的基因扩增情况。

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2 結果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

SDS法和CTAB法提取6个组织部位基因组DNA，每个部位每种方法任选1个作为代表，吸取1 μL原液，同时吸取3 μL DNA marker进行琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示，12个点样孔跑出的电泳条带，除了肾/SDS、心/SDS和心/CTAB条带较暗外，其余9个样品条带较亮、无拖尾；与λ-HindⅢ相比较，所有样品DNA大小均在10 kb左右（如图2左侧箭头所示），说明提取的基因组DNA完整性较好。但是几个浓度大的样品，点样孔存在不同程度EB吸收，并且在基因组DNA条带后方、靠近点样孔一侧有明亮度不同的条带，浓度低的样品则没有，而将浓度高的DNA样品进行稀释后，重新进行琼脂糖凝胶电泳，这一现象消失。因此推测此种现象很可能是由于DNA浓度过大造成的。脾/CTAB法提取的基因组DNA中的RNA条带较为明显。

2.2 紫外分光光度计检测DNA质量和浓度

采用紫外分光光度法测定提取的基因组DNA的纯度和浓度，D260 nm/D280 nm比值用来衡量蛋白质的去除情况，D260 nm/D230 nm比值用来衡量盐分去除情况，结果如表1所示。2种方法提取6种不同组织部位的基因组DNA，浓度和质量方面有很大差异。

在DNA浓度方面，SDS法提取6个组织部位的基因组DNA中，肝脏浓度最高，达到了（7 053.60±48.00）ng/μL；心脏最低，平均值只有13.32 ng/μL，两者浓度相差了500多倍；其余几个部位的浓度，从高到低依次为肺>脾>尾>肾。采用CTAB法提取的6个组织部位的基因组DNA，DNA浓度的数值也是肝脏最大（2 871.10±67.18）ng/μL，心脏最低（8.27±0.35）ng/μL，这点与SDS法相同，但是所获得的基因组DNA浓度均低于SDS法。其余4个部位的DNA浓度，从高到低依次为脾>肾>尾>肺。

在提取的DNA质量方面，主要根据D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值来衡量。D260 nm/D280 nm的比值可以看出基因组DNA中蛋白质和RNA的去除情况。纯净DNA的D260 nm/D280 nm比值应为1.8，如果小于1.6说明有蛋白质、酚等污染，如果大于1.9，证明RNA去除不完全。

从表1可以看出，肾/SDS纯度最差，平均值只有1.47；其次是心/SDS和心/CTAB，分别是1.71和1.68；脾/CTAB比值是2.05；而其余几个样品提取的基因组DNA质量较好，范围在1.73～1.86之间。D260 nm/D230 nm的比值可以检测出基因组DNA中盐分的去除情况，如果DNA盐分去除完全，D260 nm/D230 nm的比值应该在2.0以上。提取的所有样本，除了肺/SDS、尾/SDS、脾/SDS、脾/CTAB和肝/CTAB这5个样品的值接近于2.0（在1.93～2.06之间）之外，剩下的7个样品的盐分都没有去除完全（0.78～1.73），特别是其中的肾/SDS，比值只有0.78。

2.3 PCR检测

将2种方法6种不同组织部位提取的基因组DNA样品进行PCR扩增，吸取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。由图2可见，以0.5 μL DNA作为模板进行PCR扩增，1～12号点样孔均出现明亮、特异的条带，条带大小400多bp，符合目的片段的长度。同时阴性对照无任何条带出现，证明在整个PCR扩增过程中没有污染。

3 讨论

小白鼠是高校常用的一种试验动物，其组织部位由于其细胞类型、代谢产物等成分的不同，对不同的提取方法适用性也不一样。并且由于含有的一些特殊物质，导致在基因组DNA提取过程中，操作的难易度也不一样。试验共选取了6个组织部位，肝、脾、肾、尾、肺和心脏，尽管对样品进行了预处理（尽量将组织减碎），但是在研磨的难易度上，不同组织部位，差别很大。最容易研磨的部位是肝脏，并且肝脏的样品量最大，得率也最高；最不容易研磨的部位是尾巴，但是尾部除去漂浮的毛后，含的杂质最少，上清液最为清晰，后面的试验操作最为容易。而脾、肺、心的上清液都比较黏稠，后面较难操作。

为了节省时间，提高试验效率，将细胞裂解、释放基因组DNA的时间进行了改良，即水浴时间缩短到1.5 h。同时为了便于比较2种方法的优劣，水浴的温度都定在了60 ℃，观察紫外分光光度计的检测结果，可以看出，除了肾/S、心/S和心/CTAB外，大部分样品的蛋白都去除得比较彻底。

SDS法提取6个组织部位得到的基因组DNA，D260 nm/D230 nm的比值普遍都低于2.0，说明SDS法提取基因组DNA时，去盐不完全，但是从PCR结果来看，可以扩增出目的基因，说明用于普通的分子生物学操作没有问题。如果用于要求较高的分子生物学试验，可以采取无水乙醇洗涤沉淀DNA、DNA溶于水而不是TE等措施除去多余盐分，从而进一步纯化提取的基因组DNA。而肾/SDS相对肾/CTAB的浓度来说，得率非常低，有可能是SDS法不适合用于提取肾脏部位DNA，肾/SDS的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值（均是最差的数值）也从另一方面说明了SDS方法提取肾脏部位的基因组DNA质量稍差。

CTAB法提取的6个组织部位的基因组DNA浓度，除了肝脏（最高）和心脏（最低）外，其余4个部位从高到低依次为脾>肾>尾>肺；而SDS法为肺>脾>尾>肾，说明在这4个组织部位中，2种方法各具优势。根据D260 nm/D280 nm的测定结果，相对于脾/SDS=1.79的比值，脾/CTAB质量稍差，达到了2.05，说明RNA没有去除完全，基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图片也说明了这一点。另外一个与SDS法差别较大的是肾脏，SDS法测的比值只有1.47，而肾/CTAB达到了1.79。说明CTAB法比较合适肾脏部位基因组DNA的提取。

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总的来看，采用SDS和CTAB 2种方法对小鼠的6个组织部位基因组DNA进行提取，提取的基因组DNA基本都能满足分子生物学研究。根据琼脂糖凝胶电泳图片、DNA的浓度和纯度，及PCR扩增效果，说明SDS和CTAB这2种提取方法，对于不同的组织部位具有不同的优势。综合来看，小鼠的6个组织部位中，肝脏最合适用来作为提取基因组DNA的材料。

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总DNA提取 篇4

1 材料

1.1 主要试剂

CTAB裂解液、硫氰酸胍洗液(Gu SCN)、磷酸钠缓冲液(p H值为7.0)、SDS提取液、SDS裂解液、TAE缓冲液,由西南民族大学生命科学与技术学院实验室自制;酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠(Na AC)、无水乙醇,由成都科龙化工试剂厂生产;琼脂糖,由Bio-Rad公司生产;QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒,由QIA-GEN公司生产。

1.2 试验样品及预处理

采集于阿坝州红原县一位牧民家中散养母藏山羊新鲜粪便(GPS坐标:北纬32°26'12″,东经102°22'23″),-80℃液氮保存带回西南民族大学生命科学与技术学院实验室。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪(型号为ETC811),东胜龙公司生产;高速冷冻离心机,Thermo公司生产;紫外可见分光光度计,上海成光仪器有限公司生产;凝胶成像系统、电泳仪、电泳槽,Tanon公司生产;微量移液器,Eppendorf公司生产;电子天平,常州市宏衡电子仪器厂生产;涡旋振荡器,北京优晟联合科技有限公司生产。

2 方法

2.1 CTAB法提取DNA

按照参考文献[14]的方法提取DNA,并重复试验1次。

2.2 试剂盒提取法提取DNA

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒,称取0.2 g粪便样品用于DNA的提取,具体步骤见QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒说明书,并将提取得到的DNA置于4℃冰箱中存储,备用,且按照相同的方法条件重复该试验1次。

2.3 SDS法提取DNA

2.3.1 样品的预处理

称取冷冻保存的粪便样品1 g置于4℃冰水或冰盒上解冻,置于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液30 m L中并充分涡旋混匀,500 r/min离心5 min,离心3次,去除离心管底部固体物,收集上清液。10 000 r/min离心5 min,收集菌体,用20 m L磷酸盐缓冲液洗涤3次;将菌体重悬于5 m L磷酸盐缓冲液中于4℃保存,备用。

2.3.2 DNA的提取

用微量移液器吸取混匀的样品预处液1 m L,加入含有2 m L SDS提取液的5 m L离心管中,10 000 r/min离心10 min,沉淀用提取液重悬离心洗涤1次,弃上清液,沉淀用2 m L SDS裂解液裂解,65℃水浴保温1 h,期间每隔10 min将样品摇匀1次。取出离心管自然冷却至室温,加入2 m L氯仿、异戊醇、乙醇混合液(体积比为80∶4∶16)轻轻摇匀,10 000 r/min离心10 min。吸取上清液加到另一个离心管中,加入2 m L氯仿、异戊醇、乙醇混合液(体积比为80∶4∶16)轻轻摇匀,10 000 r/min离心10 min。再吸取上清液分装到2 m L离心管中,加入等体积4℃的异丙醇轻轻摇晃,在-20℃条件下静置1 h,4℃、12 000 r/min离心10 min;再加入300μL纯化水与DNA相溶后再加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为25∶24∶1),12 000 r/min离心10 min。吸取上清液至另一个离心管中,加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比25∶24∶1),12 000 r/min离心10 min。吸取上清液分装到2 m L离心管中,加入等体积4℃的异丙醇,轻轻摇晃,在-20℃下静置1 h,4℃、12 000 r/min离心10 min[15]。用75%乙醇重悬清洗2次,4℃、12 000 r/min离心5 min。吸干乙醇,真空干燥,加入50μL TE+RNase,置于37℃保温30 min,-20℃长期保存[16]。该试验重复1次。

2.4 琼脂糖凝胶电泳分析

提前准备干净的配胶板和电泳槽等,用TAE配制0.8%琼脂糖凝胶,加入样品、Marker等,放入80 V电泳槽中电泳30 min,待完成后小心移动凝胶于凝胶成像系统下拍照,保存。

2.5 DNA浓度与纯度的分析

DNA浓度测定标准采用紫外分光光度法[17]。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等杂质,则测定误差会比较大,并且不同的提取方法提取出的DNA中核酸和蛋白质含量不同,根据这一点也可以判断哪种提取方法更合适,效果更好。吸取2μL提取的DNA加到198μL磷酸盐缓冲液中,并装入比色皿中,用260 nm和280 nm波长进行检测。

2.6 PCR扩增的分析

采用扩增16S rRNA基因的细菌通用引物,引物序列:正向引物27F[12]5'-AGAGTTTGATCATGGCT-CAG-3'(对应于E.coli 16S rRNA基因的第8~27个碱基位置),反向引物1492R 5'-CTACGGTTAC-CTTGTTACGAC-3'(对应于E.coli 16S rRNA基因的第1 492~1 510个碱基位置)[18]。

PCR扩增条件:94℃预变性4 min;94℃变性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃再延伸7 min。PCR扩增产物于4℃保存,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量。

3 结果与分析

3.1 琼脂糖凝胶电泳检测提取总DNA

将采集到的藏山羊粪便样品分别用CTAB法、试剂盒提取法、SDS裂解法提取粪便中的总DNA,经过0.8%琼脂糖凝胶电泳后以标准DNA MarkerλDNA/HindⅢ作为标准分子质量参照[18],再通过凝胶成像系统拍照,结果见图1。

M.标准DNA MarkerλDNA/HindⅢ;1,2.CTAB法;3,4.试剂盒提取法;5,6.SDS裂解法。

由图1可知,试验提取的总DNA长度均在23 000 bp左右,说明这三种方法均能提取得到藏山羊粪便中的总DNA,且在提取过程中DNA没有出现明显的降解。采用SDS裂解法提取得到的总DNA电泳条带最亮且产量高于其他二种方法,表明采用SDS裂解法提取藏山羊粪便样品总DNA效果最好。试剂盒提取法和CTAB法提取的条带不明显的原因可能是由于藏山羊特殊的生长环境及其粪便中特殊的菌群组成导致这二种方法提取的总DNA含量较少,最后导致电泳出现的条带不明显。

3.2 提取的藏山羊粪便中总DNA的纯度和浓度检测结果

采用CTAB法、试剂盒提取法、SDS裂解法提取藏山羊粪便样品中总DNA,采用紫外可见分光光度法检测提取产物的纯度,每种方法提取的DNA各测3次,取平均值,结果见表1。

注:DNA浓度=OD260×稀释倍数×50μg/m L(OD260为核酸的吸光度)。

根据DNA浓度测定标准:OD260值为1,相当于50μg/m L双链DNA,OD260/OD280比值在1.7~1.9之间说明所得的DNA纯度较好;若OD260/OD280比值低于1.7则可能有蛋白污染,若OD260/OD280比值高于2.0则DNA很可能已降解。由表1可知:CTAB法的OD260值及OD260/OD280比值低于试剂盒提取法和SDS裂解法,说明CTAB法提取的DNA含量较少,可能含有较多的蛋白质;试剂盒提取法与SDS裂解法所提取得到的DNA纯度较好,相比之下SDS裂解法提取的DNA浓度更高,更适合于藏山羊粪便中总DNA的提取。

3.3 16S rRNA基因的PCR扩增

将扩增的产物用1%琼脂糖凝胶电泳30 min,以DL-2 000 Marker作为参照,凝胶成像系统下拍照结果见图2。采用三种方法PCR的扩增效果均较好,获得了16S r DNA的特异性扩增片段,大小在1 500 bp左右,且干扰性杂带较少,重现性较好,但试剂盒提取法和SDS裂解法获得的条带比CTAB法获得的条带清晰,这表明试剂盒提取法和SDS裂解法提取的基因组DNA具有较好的质量。

M.DL-2 000 Marker;1.SDS裂解法;2.试剂盒提取法;3.CTAB法。

4 讨论

研究中,CTAB法获取的基因组DNA纯度及得率不够理想,除肠道菌群基因组DNA外,还可能掺杂其他杂质。虽然试剂盒提取法具有方法简便、操作简单、质量稳定、用时短的优点;但试剂盒价格昂贵,使用次数有限,不适合大量样本基因组DNA的提取,而且市售试剂盒质量也因厂家和批次的不同存在差异。SDS裂解法用时较长,但DNA浓度较高,纯度与试剂盒提取法相差不多,获得了高质量的菌群基因组DNA,完全适用于下游PCR扩增反应,是一种较好的提取藏山羊粪便DNA的方法。SDS裂解法提取的基因组DNA条带较亮,没有蛋白质杂质污染,可以进行大样本的试验。试验出现的这些差异可能与不同方法裂解细菌细胞的效率及与藏山羊特殊的生长环境导致其粪便中特殊的菌群组成有关,采用三种方法提取同一份样品DNA的纯度及浓度差异较大,说明在肠道菌群的研究中DNA提取方法会影响对菌群多样性的分析,可能会引入一些误差。

5 结论

采用三种不同方法对藏山羊粪便提取DNA的比较研究,确定SDS裂解法对藏山羊粪便中DNA的提取效果比较好。提取的基因组DNA可用于后续试验,即PCR扩增的模板,且能保证试验结果的可靠性。此外该方法不需要特殊的仪器设备,成本低廉,操作简便,可作为大样本的试验方法。

摘要：为了选择更有效的提取藏山羊粪便DNA的方法及探讨不同提取方法对肠道菌群研究的影响,试验采用三种不同的DNA提取方法,即十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒提取法、十二烷基磺酸钠(SDS)裂解法,分别对同一份藏山羊粪便总DNA进行提取,通过测定OD260值与OD280值检测其浓度和纯度,再将获得的DNA进行16S rRNA基因扩增电泳比对。结果表明:三种方法均能提取得到藏山羊粪便的总DNA,SDS裂解法和试剂盒提取法提取的DNA纯度较高,CTAB法提取的DNA纯度较低,且SDS裂解法提取的DNA浓度约是CTAB法的3倍、约是试剂盒提取法的1.4倍。不同的DNA提取方法对藏山羊肠道菌群研究有影响,与其他二种方法相比SDS裂解法提取DNA的效率更高,能够得到更多种类的细菌DNA,更适合提取藏山羊粪便中的DNA及有益于对藏山羊肠道菌群的研究。

dna粗提取和鉴定 篇5

洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵(我们采用的是家用豆浆机)、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、试管(20mL两支)、天平，dna粗提取和鉴定。95%酒精、蒸馏水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂。

实验材料的选取

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

原理

①加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用

洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，对实验结果产生的影响

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有的细胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

实验步骤

1.破碎细胞，获取含DNA的滤液

动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋

.葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

2.去除滤液中的杂质

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

注意事项

①用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

②方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

DNA的析出与鉴定

将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA，鉴定材料《dna粗提取和鉴定》。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤

1.称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。

洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

2.研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。

3.向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。

此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌(不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。

4.鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。

注意事项

1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。

2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。

4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：

当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。

5.盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。

油梨果肉DNA提取方法的比较 篇6

关键词 油梨 ；果肉 ；DNA提取 ；改良SDS法 ；改良CTAB法

中图分类号 S667.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.007

油梨（Persea americana Mill.）为樟科油梨属植物，又名鳄梨、牛油果，英文名为avocado。油梨起源于中美洲、墨西哥热带湿润地区及海拔较高的山地森林或热带高原，是著名的热带、亚热带果树，也是一种木本油料作物[1]。油梨于1918年被引种到中国台湾省，在海南、广东、广西、贵州、云南、台湾等地均有栽培[2-5]。油梨果实形状一般为卵圆形、倒卵圆形、圆形及梨形，重量通常为50～2 000 g[6]。油梨果肉是由果皮发育而成，富含脂肪酸、膳食纤维、蛋白质、多酚、黄酮、叶酸等多种营养物质及活性成分，其中油梨脂肪酸含量根据品种及种植条件的差异可达到其果实重量的15%～30%[7-8]。但对于DNA提取，多酚、黄酮、脂肪酸等物质会使DNA氧化成褐色凝胶状物或与DNA结合成黏稠胶状物，阻碍其作为PCR模板进行分析[9-11]。这就需要对传统的DNA提取方法加以改进，以提取出高质量的DNA。周海兰等[12]以油梨叶片为试材，对比了传统CTAB法、改良CTAB法和试剂盒法3种方法的提取效果。结果显示，通过改良CTAB法所提取的DNA的浓度和纯度要远高于通过传统CTAB法所提取的DNA。但周海兰等[12]仅对传统的CTAB法进行了改良，而未对另一种广泛应用的SDS法进行改良并分析其效果。此外，油梨果肉中所含有的影响DNA提取的物质含量，如脂肪酸、多酚、黄酮等含量，要远高于油梨叶片[6]。所以提取油梨果肉的难度要远高于油梨叶片。提取到高质量的DNA或RNA是许多分子生物学实验（PCR扩增、基因克隆、基因表达等）的初始第一步骤，而油梨作为热带水果，果肉是油梨研究的主要部位，对油梨果肉组织进行分子生物学实验将有助于深入研究油梨果肉中营养物质及活性成分的生成、代谢等[1，13]。前人已经发表了有关油梨果肉RNA提取的优化方案，但对于相对较容易的油梨果肉DNA提取优化方案未见相关报道[13]。本实验通过比较改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法对油梨果肉DNA的提取效果，以期获得高效的油梨果肉DNA提取方法，为后续的分子生物学实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用优良油梨品系‘RN-5’果实样品于2016年8月在海南省儋州市中国热带农业科学院果树基地采集。每个DNA提取方法重复3次。

1.2 方法

1.2.1 改良SDS法和改良CTAB法

本实验采用的改良SDS法和改良CTAB法参照朱威龙等[14]的SDS法和CTAB法，改良之处如下：（1）在样品研磨步骤中加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮；（2）在SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液中加入2%（m/V）的聚乙烯吡咯烷酮；（3）在温水水浴前，加入20 μL β-巯基乙醇，并于SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液混匀；（4）水浴冷却后加入的提取液中加入酚，并且酚与氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1；（5）延长异丙醇沉淀时间到过夜。

1.2.2 试剂盒法

称取幼嫩叶片0.2 g，加入液氮充分研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司生产的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因組DNA提取试剂盒（离心柱型）进行提取，具体操作见产品说明书。

1.2.3 DNA质量检测

取DNA样品20 μL，用TE缓冲液稀释至10倍，用紫外分光光度计测定其OD260nm和OD280nm。DNA浓度=OD260nm×10（稀释倍数）×50（μg/mL）；DNA纯度=OD260nm/OD280nm。

取DNA样品10 μL，加入5 μL溴酚蓝缓冲液，用5%琼脂糖凝胶电泳，15 min后拍照，分析DNA的质量和完整性。

1.2.4 EST-SSR分子标记验证提取效果

以3种提取方法所获得的DNA为模板，采用油梨EST-SSR引物SHRSPa003进行PCR扩增，以检测3种DNA 提取方法的效果。油梨EST-SSR引物SHRSPa003序列信息来自Borrone等[15]的文献，油梨EST-SSR引物PCR扩增反应体系参照Ge等[16]的方法。扩增反应结束后取10 μL扩增产物进行电泳、染色、拍照分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法所得的DNA浓度和纯度

由表1可知，改良SDS法与改良CTAB法提取出的DNA浓度均超过600 μg/mL，浓度较高。2种方法纯度也均超过1.8，表明DNA样品中的蛋白质、酚类和脂肪酸去除较为充分，杂质较少，其DNA质量满足后续实验的要求。试剂盒法提取的DNA浓度仅为其他2种方法的十分之一，DNA纯度也较比其他2种方法低近1倍，其DNA质量很难满足后续实验的要求。

2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

由图1可知，改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种方法均能从油梨果肉中提取出DNA，其大小均在2.0 kb以上。改良SDS法与改良CTAB法提取的DNA量明显高于试剂盒法，其电泳条带也明显比试剂盒法的亮，提取效果的稳定性好。但改良SDS法提取DNA的3次重复所得的效果并不相同，有些DNA条带较亮，有些较暗，重复性较比改良CTAB法较差。

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2.3 EST-SSR標记PCR扩增验证

由图2可知，改良SDS法与改良CTAB法提取的DNA模板均可扩增出比较清晰的EST-SSR标记条带，且稳定性好；试剂盒法提取的DNA未成功扩增出清晰的EST-SSR标记条带，这可能是含有较多的蛋白质、糖、色素等反应抑制物所导致的。综上所述，改良SDS法与改良CTAB法提取的油梨果肉DNA纯度高，杂质去除充分，可满足EST-SSR等分子标记分析的需要。

3 讨论与结论

3.1 讨论

利用紫外分光光度法测定DNA纯度时，如果1.9>OD260nm/OD280nm>1.8时，表明DNA样品受杂质污染少，质量高；如果OD260nm/OD280nm>1.9时，表明DNA样品存在少量RNA；如果OD260nm/OD280nm<1.8时，表明DNA样品存在蛋白质等杂质[17]。由于油梨果肉含有大量脂肪酸，利用试剂盒法提取过程中脂肪酸等物质很容易形成粘稠的胶状物质，难于溶解堵塞柱子造成所获得的DNA浓度低，质量不高。

与寒温带水果相比，热带水果叶片、果实等各部位普遍含有更多的多糖、多酚、蛋白质等物质，其中果实内各种物质又比其它部位更多，这些物质对DNA的提取影响较大[11，18-19]。前人对热带水果DNA的提取，把聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇加入到传统的SDS法和CTAB法中，大幅提高了DNA的浓度与质量，取得了较好的结果[10-12，20-23]。本实验中的改良SDS法和改良CTAB法，在前处理期加入了聚乙烯吡咯烷酮，其可有效防止多酚氧化，并可与酚类、单宁酸、脂肪酸等共沉淀用以去除杂质。在裂解液中加入了聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，可进一步抑制多酚氧化，并去除杂质。此外，延长异丙醇沉淀时间到过夜。前人研究结果表明，异丙醇沉淀时间越长，DNA浓度越高[24]。本实验改良CTAB法与周海兰等[12]的改良CTAB法略有区别，本实验额外增加了2个步骤，即水浴冷却后加入的提取液中加入了酚和延长异丙醇沉淀时间到过夜。这2个步骤前一个可更有效地抽提DNA，而第2个步骤可提高DNA浓度。虽然油梨果肉的杂质或抑制物质比叶片多，但本实验改良CTAB法增加的2个步骤使得提取的DNA纯度（1.81）与周海兰等[12]的通过改良CTAB法提取的DNA纯度（1.7～2.0）大致相同。

3.2 结论

本实验采取改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法3种DNA提取方案从油梨果实中提取DNA，通过比较DNA的浓度和纯度，进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度，确定了提取DNA质量较高的方法为改良SDS法和改良CTAB法。

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总DNA提取 篇7

本研究采用4种方法提取棉花连作和轮作不同栽培条件下土壤微生物总DNA,分析比较了这些方法提取的DNA的产率和质量,应用ARDRA和DGGE分子生物学技术对提取的DNA质量进行验证评价,旨在建立快速高效地从土壤中直接提取土壤微生物总DNA的方法,为利用分子生态学研究技术评价棉花不同栽培体系下土壤微生物种群结构和功能多样性的变化特性,揭示新疆棉田连作障碍的机理,探讨调节改善棉田生态环境的有效措施提供科学基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

土壤样品取自呼图壁县大丰镇棉田连作-轮作定点试验示范区。试验设连作5年以下、6~8年、9~12年、13年以上的连作棉田及棉田连作8年后轮作春麦,玉米,番茄,草木樨不同倒茬作物的8个处理。各处理区根据棉花及倒茬作物的不同生育期按5点取样法采集0~20cm耕层混合土样。新鲜土样低温冷藏迅速带回实验室分析。

1.1.2 试剂

TENP溶液:50mmol/L Tris;20mmol/L EDTA;100mmol/L NaCl;0.01g/ml PVP;pH 10.0。DNA提取液Ⅰ:0.1mol/L Tris;0.1mol/L EDTA;0.2mol/L NaCl;2% PVP;3% CTAB;pH 9.0。DNA提取液Ⅱ:0.1mol/L Tris-HCl;0.1mol/L EDTA;0.1mol/L磷酸钠;1.5mol/L NaCl;1%CTAB;pH 8.0。试剂盒Ⅰ:3S DNA Purification Kit(上海申能博采生物技术有限公司)。限制性核酸内切酶HinfⅠ、Csp6Ⅰ(QIAGEN分装,购自北京天根生化科技有限公司)。

1.1.3 仪器

冷冻离心机(H-2050R,长沙湘仪仪器有限公司),电热恒温水箱(长沙湘仪仪器有限公司),PCR仪(德国Biometra公司),凝胶成像系统(Bio-Rad,USA),紫外分光光度计(Bio-Rad,USA),DGGE使用的电泳设备Bio-Rad Gene系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 方法A:样品预处理-DNA提取液-SDS法[8]

称取1g土壤样品,加TENP溶液对样品进行预处理,旋涡振荡后离心弃上清,重复3次,加PBS缓冲液洗涤1次。采用玻璃珠-DNA提取液Ⅰ和SDS提取缓冲液裂解微生物细胞,65℃水浴30min,离心收集中间液相层。重复上个步骤,将两次液相层合并。加等体积的氯仿/异戊醇抽提1次,取上清液加0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积异丙醇,室温沉淀1h,离心弃上清。70%乙醇洗涤沉淀,将DNA沉淀溶于500μl ddH2O中。再次进行抽提、沉淀,将DNA溶于30μl灭菌ddH2O。采用试剂盒Ⅰ将DNA溶液过柱纯化,-20℃保存备用。

1.2.2 方法B:样品预处理-DNA提取液-溶菌酶法

土壤样品预处理同方法A。预处理后的土样采用玻璃珠-DNA提取液Ⅰ-溶菌酶裂解微生物细胞。土样中加入0.2g灭菌玻璃珠和1 mL DNA提取液,旋涡震荡10min,加入50μl溶菌酶(100mg/ml),旋涡震荡5min,37℃水浴30min。温和旋涡震荡5min,再加入500μl SDS缓冲液,以后步骤同方法A。

1.2.3 方法C:溶菌酶-SDS-酚氯仿抽提法[5]

称取1g土壤样品,加入1ml 0.1mol/ml、pH 8.0磷酸缓冲液、玻璃珠,振荡1min,加入溶菌酶2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125μl 20% SDS振荡处理15min后离心,加酚(1∶1体积)抽提1次,氯仿-异戊醇(1∶1体积)抽提2次,加0.6体积异丙醇,室温放置1h,离心,70%乙醇清洗,30μl TE溶解。

1.2.4 方法D:改良CTAB-SDS法

称取1g土壤样品,加1ml DNA提取液Ⅱ,在漩涡震荡仪上混匀。溶菌酶温和裂解30min,液氮冷冻10min,65℃水浴10min,反复冻融3次。加入20% SDS缓冲液溶液100μl,65℃水浴2h,每20min轻轻颠倒几次。6 000r/min离心10 min,取上清。剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液,65℃水浴30min,6 000r/min室温离心10min,取上清,合并两次的上清液。等体积的酚氯仿-异戊醇抽提1次后用氯仿-异戊醇再次抽提,取上清。加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇混匀,4℃沉淀1h。13 000r/min离心15min,70%乙醇清洗2次,30μl TE溶解。提取粗DNA在0.6%的Agrose,70V电压下电泳1.5h后,采用试剂盒Ⅰ进行溶胶回收。

1.2.5 提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测

对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230nm、260nm、280nm处的光密度值。以OD260/OD280(DNA/蛋白质),OD260/OD230(DNA/腐植酸)比值检测DNA纯度。

DNA浓度=OD260值×50μg/ml×80×DNA溶液体积/干土质量[9]

1.2.6 16S rDNA的PCR扩增

采用细菌通用引物(27f,1495r)对土壤微生物总DNA中细菌16SrDNA进行PCR扩增。反应体系(50μl):10×buffer 5μl,上下游引物各1μl(10μmol·L-1),模板(提取土壤微生物总DNA)2μl,Taq酶1U,dNTP(10mmol·L-1)4μl,ddH2O 36μl。反应条件:94℃变性5min;94℃变性1min,55℃ 1min,72℃ 3min,35个循环。取PCR产物在13%的Agrose中电泳。

1.2.7 ARDRA分析

取16S rDNA的PCR扩增产物10μl,5U的限制性核酸内切酶HinfⅠ、Csp6Ⅰ,37℃分别酶切2.5h。2% Agrose检测酶切产物。

1.2.8 DGGE分析

采用上游引物(341f)5′-GC(CGCCCGCCGCGCGCGCGGCGGGGGGGCGGGGGCACGGGGGG)CCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游引物(518r)5′-ATTACCGCG GCTGCTGG-3′扩增土壤细菌16S rDNA V3区。扩增反应体系(50μl):10×buffer 5μl,上下游引物(10mmol·L-1)各1μl,16SrDNA扩增产物2μl,Taq酶0.5u,dNTP(10mmol·L-1)1μl,ddH2O 39.5μl。反应条件采用Touchdown模式运行[8]。

将PCR扩增产物在变性剂浓度范围40~60%,8%聚丙烯酰胺凝胶上进行 DGGE分离。电泳条件: 60℃,150 V电压下电泳 5h,凝胶以硝酸银染色,Bio-Rad凝胶成像系统观察采集图像。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物总DNA的提取和电泳检测

对采用不同方法提取出的各连作、轮作棉田土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示,其中3种方法(B、C、D)均能成功地从土壤中提取出微生物总DNA,电泳检测出现清晰的条带,而方法A没有出现条带。提取得到的DNA片段约为23kb左右,为大片段DNA,无明显被剪切现象。其中方法B、C所提取的DNA略有降解。方法D提取的DNA完整性最好(图1)。

注:M:DNA 分子量标准(λDNA/Hind Ⅲ);1-8分别为不同连作、轮作处理棉田土样(1.连作5年以下的棉田;2.连作6-8年的棉田;3.连作9-12年的棉田;4.连作13年以上的棉田;5.连作田轮作春麦;6.连作棉田轮作玉米;7.连作棉田轮作番茄;8.连作棉田轮作草木樨)。M:DNA Marker(λDNA/HindⅢ); Lane 1:< 5 years continuous cropping of cotton,Lane 2:6-8 years continuous cropping of cotton;Lane 3: nine to twelve years continuous cropping of cotton; Lane 4: more than thirteen years continuous cropping of cotton; Lane 5: cotton-wheat rotation; Lane 6: cotton-corn rotation; Lane 7: cotton-tomato rotation; Lane 8: cotton-sweet clover rotation.

2.2 提取土壤微生物总DNA的浓度和纯度

测定结果显示(表1),提取粗DNA的得率最高的是方法D,其DNA的得率分别是方法C、方法B的3.7和2.0倍。但方法D的A260/A280比值低于方法C,A260/A230比值低于方法B,说明该法所提取的粗DNA去除蛋白质和腐殖酸杂质的效果劣于其他两种方法,纯度尚不理想。但经纯化后,DNA的A260/A280达到了1.80,A260/A230为1.70,纯化回收率为70.1%左右,提取效果得到明显提高。

2.3 16S rDNA的PCR扩增检测

改良CTAB-SDS法提取的粗DNA经纯化后,扩增出了约1 500bp近全长的16S rDNA片段(图2)。说明此提取和纯化方法能有效去除污染DNA及抑制PCR反应的腐殖酸杂质,纯化效果显著。因此,后续试验以改良CTAB-SDS法提取并经纯化后的DNA为材料。

2.4 ARDRA分析

对棉田连作、轮作各处理土壤中细菌16S rDNA的PCR扩增产物进行ARDRA分析,结果显示各处理样品经HinfⅠ、Csp6Ⅰ酶切后,均有多条条带产生,但条带图谱不同。连作棉田土壤酶切条带体现出随着连作年限增加,带数减少的特点。其中在1 000bp处各样品均有共有的一条条带,可能是棉田土壤中的优势细菌类群。在棉田轮作倒茬不同作物的的土壤中,HinfⅠ、CspⅠ酶切图谱相似,分别产生5条、6条带,但各处理的条带亮度不同,表明在不同倒茬作物轮作条件下土壤微生物群落中的优势菌群组成较为稳定,但其相对丰度有差异。以上结果表明,所提取的土壤微生物DNA用于细菌的ARDRA分析体现出了处理间的差异,适用用于土壤微生物多样性及群落结构变化的研究。

2.5 DGGE分析

DGGE图谱显示(图4),各样品产生21~32条不等的条代数, 表明扩增的16S rDNA的基因片段在DGGE中得到有效分离。 各条带的迁移率和强度不同,有些样有较明显的区别与其他样品的特异条带,表明各处理的菌群结构、组成、优势菌群及菌群丰度具有较大差异。

3 讨论

3.1 近年来ARDRA和DGGE技术在环境微生物群落多样性和种群结构动态变化的分子监测中得到了越来越广泛的应用,但在连作、轮作棉田土壤微生物多样性的分子解析中的研究还鲜见报道。本文建立了一种简便、高效地提取土壤微生物总DNA的方法,为不同栽培体系下棉田土壤微生物生态学研究提供了基础。

3.2 获取微生物总DNA是土壤微生物分子生态学研究的关键技术[10]。土壤中存在许多抑制剂,其中以腐殖酸类物质抑制作用最明显,它们主要通过干扰裂解、使核酸降解或非特异性吸附和抑制酶活性方式起作用[11]。Nathalie F等提出,在裂解微生物细胞之前,对土壤进行预处理,有助于去除腐植酸污染[12]。本试验中采用的提取方法B,在粗DNA提取之前,对土壤样品先以TENP和PBS缓冲液进行多次洗涤和旋涡振荡处理,此过程一方面使微生物细胞从土壤颗粒中充分释放出来,同时在土样洗涤过程中加入的聚乙烯聚吡咯烷酮,可以减少胞外游离DNA及腐殖酸等各种污染杂质,但经预处理的土壤样品DNA产量下降。有研究表明在纯化过程中采用柱式腐殖酸清除剂进行纯化,纯化效果较好[13]。本实验中方法D对粗提DNA进行溶胶过柱回收,取得了纯化较好的纯化效果,且纯化过程中对DNA产量损失不大。因此在几种提取方法中,该法去除腐殖酸的效果较为理想。

3.3 土壤微生物DNA提取中细胞裂解是极为关键的一步。国内外在土壤微生物总DNA提取中常采用机械破碎方法如玻珠振荡法 、超声波法 、液氮研磨法,物理法如冻融法,酶法如溶菌酶和蛋白酶K,或是几种方法的组合来破碎细胞,增加细胞的溶解率以获得大片段、高产量、高质量的DNA[14]。本研究中方法A和B的土样经过相同的预处理过程,但不同的细胞裂解方法,取得了不同的DNA提取结果。以DNA提取液-溶菌酶裂解细胞,获得了较高的DNA产率,但以DNA提取液-SDS裂解细胞却未能提取出DNA。方法C用溶菌酶-SDS裂解细胞,酚-氯仿抽提DNA中混杂的蛋白质。该法去除蛋白质的效果好,但反复抽提导致DNA 产率下降。方法D以CTAB为基础结合SDS,同时利用溶菌酶和液氮冷冻反复冻融共同作用破碎细胞,获得的DNA完整性最好,产率最大,取得了较理想的效果。该法中采用SDS细胞裂解,在有效地裂解菌体的同时,还能保证DNA片段不被破坏。CTAB不仅可以提高DNA的产率,还有助于去除腐殖酸。而DNA提取液中加入的EDTA具有抑制核酸酶活性,保证在提取过程中DNA不被降解的作用。其次在抽提过程中使用酚氯仿-异戊醇抽提可以更好地沉淀核酸,去除蛋白质,再结合溶胶回收纯化步骤,进一步提高了DNA的纯度,这几个关键步骤决定了该法具有提取DNA完整与高产率的优势。

总DNA提取 篇8

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

研究区为辽宁省阜新市海州露天矿排土场,于2008年5月7日采集土壤样品。采样前双手及采样工具用75%酒精消毒,按“之”型分别取5点距离地表0～10 cm处土样,5点土样混匀后作为该取样小区的样品。将新鲜土样打碎、混匀,去除杂质、石砾、粗根等,装入无菌塑料袋内,于一20℃冰箱中贮存。

1.2 DNA提取方法

分别采用SDS高盐法和PBS缓冲液法并配合不同的酶以及机械法来裂解细胞,在细胞裂解时所采用的酶分别为蛋白酶K、溶菌酶以及蛋白酶和溶菌酶两者组合。具体操作参照Zhou[4]的方法并略有改动。

1.2.1 SDS高盐法

①取1g土壤放入研钵中,倒入适量的液氮研磨直至土壤颗粒研成粉末。将土壤粉末倒入10 mL离心管中并加入2.7 mL DNA提取液[0.1 mol.L-1 Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mol·L-1 EDTA (pH 8.0);0.1 mol·L-1Na2 HPO4;1.5 mol.L-1 NaCl;1%CTAB]和10μJL蛋白酶K (20 mg.mL-1)或80μL溶菌酶(50 mg·mL-1),或者两种酶均加入,混合摇匀置于37℃摇床225 r·min-1振荡30 min。②加入0.3 mL20%SDS,轻轻混匀于65℃水浴2 h,每隔15～20 min轻轻颠倒几下。③10 000 r.min-1离心10 min,取上清液转入新的10 mL离心管中。④再取900μL DNA提取液和100μL 20%SDS,颠倒混匀后65°C水浴10 min。⑤10 000 r·min-1离心10 min,取上清液与原上清液合并。重复操作1次,合并上清液。⑥10 000 r·min-1离心10 min,用阔口Tip头吸上清液于一新离心管中,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提10 min。⑦10 000 r·min-1离心10 min,用阔口Tip头吸上清液于一新离心管中,加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提10 min。⑧10 000 r.min-1离心10 min,用阔口Tip头吸上清液于一新离心管中,加入2倍体积的冷无水乙醇于一20℃沉淀DNA 0.5～1.0 h。用预冷的75%乙醇洗涤DNA 3次,室温干燥,TE溶解。置于4℃待用。

所采用的机械法为循环冻融法,具体操作为65°C水浴2 h,每隔15～20 min轻轻颠倒几下后将样品轻轻移至一180℃液氮中10 min,后移至65℃水浴l h,循环3次。其余步骤同上。

1.2.2 PBS缓冲液法

①取1g土壤,研碎,加入2 mL PBS缓冲液(0.12 mol.L-1 Na2 HPO4,pH 8.0),置于37℃摇床225 r·min-1振荡30 min。②加入1.5 mL溶液I (0.15 mol·L-1 NaCl,0.1 mol.L-1 EDTA),10μL蛋白酶K或80μL溶菌酶(50 mg l·mL-1),或者两种酶均加入,37℃水浴2 h,每隔15～20 min轻轻颠倒几下。③10 000 r·min-1离心10 min,取上清液转入新的10 mL离心管中。④再加入2 mL溶液Ⅱ(0.15 mol·L-1 NaCl,0.5 mol·L-1 EDTA,10%SDS),颠倒混匀后65℃水浴10 min。10 000 r·min-1离心10 min,取上清液与原上清液合并。⑤重复第④步操作1次,合并上清液。⑥其余步骤同1.2.1中的⑥～⑧。机械法同前。

两种缓冲液与3种酶、机械法的组合方案见表1。

1.3 凝胶电泳检测DNA完整性

将5μL DNA和1μL的Loading Buffer混匀点样在1%琼脂糖凝胶(含0.5μg·mL-1 EB)上,80V电压电泳,用凝胶成像系统观察并用数码相机拍照,初步检测提取的DNA完整性。

1.4 紫外分光光度计检测DNA纯度

以4 mL TE作空白对照,另于装有3.6 mL TE的石英比色皿中加入400μL DNA,充分混合,使其稀释100倍。在波长为260、280 nm处调节紫外分光光度计读数至零(用对照的TE)。于260、280 nm波长处读数,分别测定其OD值,根据公式(1)计算所提取DNA的浓度,根据OD260/OD28。的值确定DNA的纯度测定[5]。

2 结果与分析

2.1 DNA完整性

各处理组合琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。可以看出,4～6号样品的谱带和10～12号样品的谱带(均为SDS高盐法)在λ-HindⅢ即Marker 23 kb的附近均有条带出现,说明SDS高盐法所提取的DNA均有较好的完整性。1～3号样品的谱带(PBS缓冲液未经循环冻融)中无明显条带,而7～9号样品的谱带中条带亮度较弱。从条带的亮度来看,SDS高盐法加入2种酶且不经循环冻融的6号样品的谱带亮度强于其它条带,说明该法所提取的DNA得率为最高。因此可以推断,蛋白酶K和溶菌酶共同作用可以提高DNA的提取率,反复的循环冻融可能会造成基因组DNA的机械断裂而不利于提取土壤微生物的总DNA。

2.2 DNA纯度

用紫外分光光度计法测得的DNA浓度及纯度见表2。可知,6号样品的DNA浓度最大,与凝胶电泳初步检测的结果相符。OD266/OD280值大一些的模板,说明其中的杂质较少,DNA的纯度相对较高。OD260/OD280。值小于1.8,说明模板中有蛋白质、酚等杂质的污染;OD260/OD280值大于2.0,说明模板中有少量的RNA;OD260/OD280值在1.8～1.9的范围内最好。表2中的值均不在此范围内,说明模板中有许多的杂质,需要进一步的纯化处理。

综合凝胶电泳的DNA完整性检测结果和UV检测DNA的纯度和浓度的结果来看,在多种细胞裂解的方法组合中,不经循环冻融、且同时加入蛋白酶K和溶菌酶的方案组合为最佳。但是所提取的DNA含有较多的杂质,如抽提过程中残留的酚等有机试剂或土壤中含有的腐殖酸,因此需要进一步的纯化才可以进行PCR扩增,否则会影响PCR扩增的顺利进行。

3 结论与讨论

用直接法提取土壤微生物DNA,主要考虑的是细胞裂解方法对DNA得率的影响。常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和酶法。单纯使用一种方法很难得到高质量的DNA,适当进行各种方法的组合,可以得到不错的结果。

常用的机械方法是冻融和加玻璃珠搅拌,它们可以破坏土壤结构,最大限度地触及整个细菌群落,但也存在一定的弊端。BUrgmann H等[6]对加玻璃珠搅拌的方法进行了研究,发现在提取缓冲液体较小的情况下,搅拌时间越长、速度越大则DNA产量越高,但DNA损伤也增加。该试验也得到了相似的结论,即反复冻融会降低DNA的得率。

化学方法提取土壤微生物DNA最常用的是阴离子去污剂SDS,它能够溶解构成细胞膜的疏水性物质,通过破坏细胞膜结构的方式破碎细胞,从而使DNA能够从细胞中提取出来。在实际操作中,往往是将SDS与其它试剂结合使用以达到最佳的效果,如EDTA螯合剂、CTAB或磷酸钠缓冲液,曾经有报道指出,在土壤中加入SDS-磷酸钠缓冲液获得的DNA片段平均长度约为25 kb[7]。利用化学法提取DNA时必须与酶法相结合才能达到事半功倍的效果。在提取土壤微生物DNA时常用到的酶有溶菌酶和蛋白酶K。溶菌酶水解糖苷键和腐殖酸,以此来提高DNA的纯度。蛋白酶K可以用来消化细胞中的蛋白质,有助于细胞的裂解。2种酶的作用不同,因此将这2种酶同时用于土壤微生物的细胞裂解,所获得的DNA得率最高。

由于露天矿排土场土壤中含有多种土壤酶、大量的腐殖质以及煤矸石和重金属,而导致土壤微生物DNA的提取成为了难点。该研究建立了利用直接法提取露天矿排土场土壤微生物总DNA的方法组合,该方法具有简便、快速、造价低的特点,更重要的是能够从土壤微生物中获得完整性好、浓度大的DNA。用该法所获得的DNA经过纯化后可以进行下一步研究,为从分子水平上研究土壤微生物的群落结构以及多样性等提供了可行的方法。

摘要：对露天矿排土场土壤微生物总DNA的提取方法进行了研究,将化学法(SDS高盐法和PBS缓冲液法)、酶法(溶菌酶和蛋白酶K)和机械法(循环冻融)组合为12种细胞裂解方案。琼脂糖凝胶电泳和UV检测的结果表明,SDS高盐法与酶法和机械法组合的6种方案所获得的DNA均具有较好的完整性和较大的浓度。为缩短试验时间,减小DNA在循环冻融过程中造成机械断裂的可能性,故SDS高盐裂解液不经循环冻融、并加入蛋白酶K和溶菌酶的方案组合为最佳,该结果为从分子水平上研究露天矿排土场土壤微生物的多样性及以PCR为基础的研究提供了可行的方法。

关键词：露天矿,土壤微生物,总DNA,提取方法

参考文献

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[3]朱建林,詹鹏,吕文洲.聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术研究梯田式人工湿地微生物群落动态变化[J].环境污染与防治,2010,32(2):46-50.

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番茄基因组DNA提取探讨 篇9

番茄是较早构建遗传连锁图谱的作物,目前基于番茄培育种和各种野生种杂交构建了许多分子图谱,因此获取高质量的DNA是番茄分子生物学和基因工程研究的前提。现对CTAB及SDS 2种方法进行比较,旨在为番茄基因组DNA的提取方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物材料为番茄幼嫩叶片。供试药品有:CTAB提取缓冲液:2%CTAB(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0),1.4mol·L-1 NaCl,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

SDS提取缓冲液:2%SDS(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol·L-1EDTA(pH8.0),150mmol·L-1 NaCl,20%SDS溶液;5mol·L-1 KAC;3mol·L-1 NaAC,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5 mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的CTAB提取缓冲液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),上下颠倒混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清液加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10 min,取上清液加入1/10体积3 mmol·L-1 NaAc(pH 5.2)和等体积异丙醇,轻轻混匀,-20℃放置20 min,4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解。

加入2μL(10 mg·mL-1)RNaseA酶液,在37℃条件下保温30min,然后氯仿-异戊醇(24∶1)抽提1次,离心、沉淀、干燥,最后将DNA溶解在30μL灭菌纯水,于-20℃保存备用[3,4]。

1.2.2 SDS法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的SDS提取缓冲液,70μL的20%SDS溶液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,取上清液加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),4℃,12 000r·min-1离心10 min;取上清液加入1/10体积的NaAC和等体积异丙醇,-20℃放置10min;4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解[3,4]。去RNA方法同上。

1.2.3 DNA检测方法

DNA浓度检测:以无菌水作为空白对照,测定各样品OD260及OD260/280值,计算样品中的DNA浓度并判断DNA的纯度。DNA电泳检测:0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性及RNA污染程度。PCR检测:PCR反应体系:25μL反应体系,10×Taq Buffer2.5μL,Primer 1(10pmol·μL-1)1μL,Primer2(10pmol·μL-1)1μL,dNTP 2μL,Taq polymarase(5 U·μL-1)0.2μL,Template DNA 1μL;PCR反应条件:94℃预变性5min,30个下列循环:94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min;72℃延伸7min,4℃保存。

2 结果与分析

2.1 DNA样品紫外分光光度计分析

DNA的浓度及纯度见表1。可知,由OD260/280值说明2种方法提取的DNA纯度较高,且提取量差异不显著。

2.2 DNA样品电泳分析

DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳上检测结果见图1和图2。可知,由CTAB和SDS 2种方法提取的番茄基因组DNA都有清晰的主带,无降解,无RNA污染,DNA质量较好。

2.3 PCR检测

将提取的番茄基因组DNA用于PCR分析,由图3可见,PCR扩增条带清晰,说明所提取的DNA可以满足PCR要求。

3 结论

番茄成熟及衰老叶片中含有较多的多酚类物质,叶片中糖含量较高,对提取的DNA质量有影响,经试验证明通过在提取液中加入2%聚乙烯比咯烷酮有助于抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性。但选择材料时应尽量选取幼嫩叶片,因其含有较完整的DNA,从而提高DNA的质量。在加入酚-氯仿-异戊醇抽提液时,注意抽提液体积,若抽提液体积过小,抽提离心后在固体层下方会产生一个空隙,在取离心管的过程中造成震荡使上层提取缓冲液漏下,造成DNA浪费。DNA沉淀时可加入2倍体积的乙醇或等体积的异丙醇,异丙醇能与自由水紧密结合,结合了溶解DNA的水分子使DNA沉淀,可常温沉淀离心,但沉淀容易将盐成分一起沉淀不易除去;无水乙醇易于从DNA沉淀中除去,需-20℃放置10～20min。因此可根据实际情况进行选择。

采用CTAB及SDS 2种方法对番茄幼嫩叶片DNA进行提取,试验结果说明2种方法均能得到完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

摘要：以番茄幼嫩叶片为材料,通过CTAB和SDS 2种方法对番茄基因组DNA提取进行了比较研究。结果表明:2种方法均能提取完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

关键词：番茄,DNA,提取

参考文献

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人外周血DNA提取方法比较 篇10

1 实验方法及注意事项

1.1 传统方法

提取DNA传统方法按照《分子克隆实验指南》进行[8], 该法是Stafford和Blin根据Cross-Bellard等方法改良而成。

1.2 改良方法

改良方法所用DNA小量抽提试剂盒 (纯化柱式) 购自碧云天生物技术研究所。

1.2.1 全血的运输及保存

提取DNA的全血需用EDTA抗凝, 用量为2mL或以上, 运输过程中应避免采血管反复颠倒和 (或) 强力震荡等, 以免发生溶血;取回的全血4℃保存待用, 一般存放时间不宜超过24h, 以免影响DNA的提取;如需长期保存, 可将其保存于-80℃低温冰箱中 (经低温保存后的全血提取DNA需要较长的操作时间) ;全血在保存过程中应避免反复冻融。

1.2.2 实验前期准备

DNA提取过程中, 操作人员需穿戴实验服、口罩和手套, 实验所需移液器、枪头、EP管和Eppendorf管等实验耗材需经高压灭菌消毒, 并提前预热水浴锅和恒温箱。

1.2.3 血清的分离及注意事项

实验开始前, 首先要详细记录每个采血管对应患者的基本信息, 将标记好的采血管置于离心机中, 离心条件:4℃、1000rpm、5min;离心后抽提上层血清, 置于-80℃低温冰箱留存待用;血清分离时, 操作人员动作要缓慢, 操作时尽可能抽净上层血清, 保留中间层的白细胞和下层的红细胞;初学者操作时不可过分追求吸净上层血清, 以免将中间的白细胞层吸走而影响DNA提取。

1.2.4 红细胞的裂解及注意事项

本文以采取2mL全血提取DNA为例, 向吸去上层血清的采血管中加入红细胞裂解液5mL, 用一次性吸管或移液器反复吹打, 8min后将其置于离心机中, 条件为:4℃、1000rpm、5min。可重复一次。离心后弃掉上清液, 加1mL红细胞裂解液, 用一次性吸管吹匀, 转入已标记好的1.5mL Ep管中, 裂解5min, 离心 (条件同上) , 弃上清液;以上步骤操作时间一般不宜超过15min (离心时间不计算在内) 。

1.2.5 DNA的提取及注意事项

向Ep管中加入PBS缓冲溶液1mL, 用移液器或一次性吸管将沉淀打散至絮状, 离心 (条件同上) , 离心后弃上清液, 加入200μL PBS缓冲溶液, 涡旋摇散沉淀至絮状, 加20μL蛋白酶K, 立即涡旋混匀, 然后加裂解液B 200μL, 立即涡旋混匀;此步骤应注意不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合, 加样过程中要注意防止样品及试剂的污染。

后将Ep管置于70℃恒温箱中10min, 恒温后加入200μL无水乙醇, 立即混匀;将Ep管中液体用移液枪转入标记好的DNA纯化柱中, 此过程必须将沉淀全部转移到DNA纯化柱中, 否则会严重影响DNA提取效果。接下来将DNA纯化柱置于废液收集管上, 离心, 条件:17℃、8000rpm、1min。离心后弃废液收集管内液体, 并回收废液收集管;后向纯化柱内加入500μL洗涤液Ⅰ, 离心 (条件同上) , 离心后弃废液收集管内液体, 回收废液收集管。加入600μL洗涤液Ⅱ, 离心, 条件:17℃、12000rpm、1min;离心后弃废液收集管内液体, 回收废液收集管;空离一次 (条件同上) , 离心后弃废液收集管。

在DNA回收过程中我们采用两步法, 充分回收DNA, 将DNA纯化柱转入标记好的第一组Ep管中, 加60μL水, 置于水浴中, 条件为55℃、3min, 水浴后离心 (条件同上) , 离心后将Ep管放入-80℃低温冰箱保存待用;将DNA纯化柱转入标记好的第二组Ep管中, 加60μL水, 置于水浴箱中, 条件为55℃、3min, 水浴后离心 (条件同上) , 离心后将Ep管放入-20℃冰箱保存待用;实验器材使用后均需酒精擦拭消毒。

1.2.6 实验操作的注意事项

在实验操作过程中, 使用移液器吸取试剂时不要把移液器枪头伸入液体过多, 以刚刚没入液面为宜, 保证能吸到液体即可, 避免造成浪费。PCR实验精度较高, 加入试剂量多为微升计, 如移液器枪头伸入试剂过多, 粘附于枪头的试剂就会较多, 会导致实验试剂的极大浪费。

2 DNA样本的质量

为了获得更多的DNA样品, 实验过程中采用二次洗脱法以增加DNA产量, 第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50%~80%的DNA量, 这对于PCR实验至关重要;DNA样本的纯度和含量将影响电泳后条带的明亮程度, 经二次洗脱得到的DNA样本, 电泳后条带亮度略微发淡, 与首次洗脱得到的DNA样本比较, 条带亮度有明显的差别, 所以DNA浓度越高, 扩增产物量越大, 电泳后条带越亮;在我们的研究中, 二次洗脱DNA样本主要用于验证DNA提取质量以及实验初期条件的摸索。

2.1 琼脂糖电泳检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的两种DNA纯度, 紫外灯照射显示, 用改良法提取的DNA电泳带齐整, 荧光显示较强, 识别度高;传统的酚、氯提取方法提取的DNA电泳带欠齐整, 有拖尾现象, 荧光显示较弱。

2.2 PCR扩增效果

在模板浓度、反应体系、反应条件及引物相同的条件下, 对改良及传统提取的DNA为模板分别进行PCR扩增, 结果显示以改良法提取的DNA为模板, PCR的扩增效果明显好于传统的酚、氯DNA提取的方法, 而且这种差距伴随扩增产物片段的增加更加明显。

3 DNA样本的存储

根据实验需要提取的DNA样品应作分装处理, 近期实验用少量DNA样品冻存于-20℃冰箱中, 其余样品冻存于-80℃低温冰箱;DNA样品切忌反复冻融, 若DNA样品长期存放于-20℃环境或实验过程中反复多次冻融, 则易发生降解, 从而造成PCR扩增后产物在电泳时产生涂抹条带或者没有条带, 或阳性检出率降低等结果。

4 结语

DNA提取技术是分子生物学、遗传学和分子流行病学等实验研究中不可或缺的一种实验技术, 在基因相关研究领域中具有重要地位, 因此, 熟练掌握DNA提取实验的基本原理、实验操作方法、影响因素和注意事项等是非常重要的。

从上述我们对改良及传统抽提DNA方法的对比分析可以看出, 传统提取DNA法不仅操作费时费力, 样本需求量大, 而且获得的DNA纯度、总量以及PCR扩增效果等都存在欠缺, 所以有必要进行改进, 我们采用的DNA小量抽提试剂盒法操作简单、省时省力, 同时结果更为稳定, 是目前提取DNA较好的方法。

参考文献

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