基因克隆

基因克隆（精选十篇）

基因克隆 篇1

关键词：克隆选择,基因重组,高频变异,函数优化

0 引言

生物免疫系统是生物体内结构最为复杂、功能最为独特的系统之一。研究生物免疫学机理, 成为当代生命科学中的前沿学科[1]。人工免疫系统AIS (Artificial Immune System) 是模仿生物免疫系统功能的一种新的智能方法, 是继模糊逻辑、进化计算和神经网络后, 人工智能领域又一研究热点[2,3,4]。Castro等根据免疫克隆选择机理, 提出了一种克隆选择算法[5], 并成功用于模式识别和函数优化[6]。随着人工免疫系统的迅速发展, 一些基于克隆选择机理的新算法相继提出, 李恒杰等提出了一种基于单一高斯算子变异的克隆选择算法[7], 加快解的收敛性, 同时保持解的多样性和分布的均匀性。胡江强等人提出了一种分级变异的动态克隆选择算法[8], 根据抗体亲和度将种群分解为3个子种群, 实施不同的变异策略, 加快全局搜索速度, 提高局部搜索精度。焦李成、杨咚咚、公茂果等人提出了一种基于偏好等级的免疫记忆克隆选择优化算法[9], 利用决策者提供的偏好信息来为抗体分配偏好等级, 增大抗体选择压力, 加快收敛速度。陶新明等人提出了一种混合变异克隆选择算法 (HMC-SA) [10], 在抗体进化过程中, 不同抗体种群采用不同的变异算子, 并通过外部记忆抗体群的更新, 保留进化的最优抗体, 避免算法进化后期出现的退化现象。

克隆选择算法CSA (Clonal Selection Algorithm) 是模拟生物免疫系统抵御外来抗原侵袭的一种自主学习进化过程。与遗传算法的有性繁殖 (父代基因交叉变异) 不同, 免疫克隆选择算法是通过无性繁殖 (自身克隆变异) 连续传代生成抗体种群, 并利用高频变异提高抗体克隆种群的亲和力, 从而实现抗体种群的不断进化, 最终找到最优抗体[11]。与传统克隆选择算法相比, 虽然改进的克隆选择算法克服了局部搜索能力低和进化缓慢的不足, 但是高频变异的随机性和不确定性可能会导致出现退化现象, 影响算法的收敛速度和降低全局搜索的能力。本文根据克隆选择机理, 利用生物工程中的基因重组技术, 提出一种基于基因重组的克隆选择算法 (GRCSA) 。根据抗体与抗原之间亲和力的大小, 获取优秀抗体的优秀基因片段, 并对亲和力低的抗体进行基因的交换与重新组合, 实现定向变异的目的, 防止种群退化, 提高变异效率。另外, 根据不同抗体浓度进行不同规模的克隆增殖, 保持抗体种群的多样性, 扩大全局的搜索范围, 防止陷入局部收敛。最后利用测试函数对算法性能进行评估, 并与文献[10]的算法进行比较, 实验结果验证了本文提出的算法提高了其收敛速度和解的精度, 证明算法的有效性。

1 基因重组的形式化描述

在生物工程领域, 基因是包含遗传信息的DNA分子片段, 基因重组技术就是对生物体的DNA分子进行交换和重新组合, 形成新的DNA分子, 改变生物体某些外在性状[12]。基因重组的优点是在生物体的DNA分子发生变异的过程中, 有方向性地改变生物体的基因组成, 避免生物体基因 (DNA分子) 出现有害变异, 导致退化现象。在克隆选择算法中, 基因重组包含两个过程:第一, 提取优秀抗体的优秀基因片段;第二, 利用优秀基因片段, 通过某些技术手段, 对抗体的某些DNA分子片段进行交换和重新组合, 形成新的抗体DNA分子, 从而达到改变抗体基因的目的。将基因重组做如下形式化描述:

定义1将基因重组形式化描述成一个三元组GR=。其中, Ab={Ab1, Ab2, …, Abp}表示p个优秀的抗体组成的抗体种群, 每一个抗体Abi (i∈[1, p]) 是由l位二进制串组成的抗体DNA分子表示;Abs表示从优秀抗体Ab种群中提取的优秀基因 (DNA分子) 片段;R (·) 表示一种操作算子, 将优秀基因片段经过交换和重新组合注入到其他抗体的DNA分子中, 达到控制抗体变异方向的目的。

1.1 抗体优秀基因片段

在生物免疫学中, 虽然抗体表面有多个表位, 但在诱导免疫应答时只可能是一种或者一个表位其主要作用, 使宿主产生特异性为主的免疫应答, 这种现象叫作免疫显性或免疫优势, 关键作用的表位叫作显性免疫优势点[13,14]。在抗体DNA分子中, 显性免疫优势点是由某段基因片段表达的, 称为优秀基因片段。基因重组的基础就是获取优秀基因片段。

在人工免疫系统中, 抗原、抗体以及抗原/抗体的亲和力分别对应函数优化问题的目标函数、优化解以及解与目标函数的匹配程度。人工免疫系统借鉴生物免疫学的有关机理, 通过抗体自身的不断进化以适应抗原的刺激, 达到解决目标函数最优值的目的。为了简化问题, 将被优化的目标函数记为f:F→F', 亲和力函数aff一般为目标函数f。对于抗体编码, 每个抗体Ab∈Bl、Bl={0, 1}l代表由长度为l的二进制串组成, 这个二进制串表示抗体的DNA分子, 抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}为抗体Ab的n元组。

定义2假设每一个抗体是由一个长度为l的二进制串组成, 记为Ab=[ab1, abn, …, abn], 如果它满足:f (Ab) =f (ab1, …, abi-1, 1, abi+1, …, abl) ≥f (ab1, …, abi-1, 0, abi+1, …, abl) 或者f (Ab) =f (ab1, …, abi-1, 1, abi+1, …, abl) ≤f (ab1, …, abi-1, 0, abi+1, …, abl) , 则称抗体的第i位为优秀基因片段, 其性状表达为显性免疫优势点。

1.2 抗体优秀基因片段的获得

利用获取的优秀基因片段, 改造与抗原亲和力低的抗体的基因, 使之表现出显性免疫优势点的外在性状, 促使每次变异都趋向于好的方向, 从而达到定向变异的目的, 提高变异效率和算法收敛速度。

优秀基因片段的获得算子:

1) 定义规模为n的初始抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}, 每个抗体的DNA分子由l位二进制串表示。抗体种群可记为:

2) 计算种群中每个抗体的亲和力, 根据亲和力大小, 选取亲和力大的优秀抗体。定义一个参照抗体Abs, 用来记录显性免疫优势点, 从而提取优秀基因片段。

3) 利用参照抗体Abs, 对亲和力低的抗体的DNA分子进行交换与重新组合, 改变其DNA分子, 使其获得优秀基因片段, 表现出显性免疫优势点的外在性状, 实现高频变异中的定向变异。

2 基于基因重组的克隆选择算法

本文在传统克隆选择算法的基础上, 借鉴基因重组技术, 提出了一种基于基因重组的克隆选择算法, 对传统克隆选择算法中的高频变异进行定向控制, 使每一次变异都趋向于好的方向, 产生更优秀的抗体, 避免出现退化现象, 提高算法的收敛速度。假设一个规模为n的抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}, 每一个抗体的DNA分子由l位二进制串组成, 即Abi=[ab1, ab2, …, abl], i∈[1, n]。对基于基因重组的克隆选择算法作如下形式化描述:

克隆选择规则Rscs对初始抗体种群进行亲和力计算, 然后根据亲和力大小, 选择亲和力高的抗体进行克隆增殖。具体规则如下:

Rscs规则具体包括计算抗原和抗体亲和力的值和根据亲和力大小对初始抗体种群进行排序两个过程:

(1) 计算抗原与抗体之间的亲和力的值, 得到一个抗体亲和力的集合Aff={aff1, aff2, …, affn}。如今最常用的计算亲和力的方法有:Euclidean距离 (式 (2) ) 、Manhattan距离 (式 (3) ) 以及Hamming距离 (式 (4) ) :

(2) 根据亲和力大小对亲和力集合的个体进行排序, 得到新的抗体种群序列rank (Aff) ={Ab'1, Ab'2, …, Ab'n}。另外, 定义一个克隆选择概率P, 由如下公式求得:

其中, pi是第i个抗体的选择概率, affi是第i个抗体与抗原的亲和力, i∈[1, n]。根据克隆选择规则Rscs, 选择出ε×n优秀抗体, 即种群{Ab'1, Ab'2, …, Ab'ε×n}进入克隆增殖过程, 对应的选择概率为{p1, p2, …, pε×n}。ε是克隆选择参数, 决定克隆选择的数目。

克隆增殖规则Rpcs对克隆选择出的优秀抗体种群Rscs (Ab) , 根据抗体/抗原亲和力的大小, 进行不同规模的克隆增殖, 具体规则如下:

其中, Ab'i=×jAb'i, (i∈[1, ε×n], j∈[p1, pε×n]) , 是克隆增殖参数, 决定不同的克隆增殖规模。根据克隆选择概率, 对概率大且浓度低的抗体进行优先克隆, 且克隆的规模与选择概率成正比, 即选择概率越大, 克隆规模越大。

克隆变异规则Rhcs运用基因重组技术, 借助从优秀抗体的DNA分子中获取的优秀基因片段, 对亲和力低的抗体的DNA分子进行交换和重新组合, 使之表现出高亲和力的性状, 达到定向变异、提高变异效率的目的。具体规则如下:

其中克隆变异概率与克隆选择概率成反比, 即选择概率越小, 变异概率越大。Rhcs规则具体包括获取优秀抗体的优秀基因片段和定向改造抗体DNA分子两个过程:

(1) 获取优秀抗体的优秀基因片段。根据抗体/抗原亲和力大小, 选取η个优秀抗体。定义一个参照抗体Abs, 用来记录优秀基因片段, 获取方法如下:

(2) 定向改造抗体DNA分子。利用参照抗体Abs, 对亲和力低的抗体进行DNA分子的重组, 将获取的优秀基因片段注入其DNA分子内, 定向改造亲和力的性状, 从而达到定向变异的目的。具体方法如下:

其中, Abm表示亲和力较低的抗体, Ab'm表示经过基因重组改造以后的抗体, remove () 是根据参照抗体Abs对抗体Abm的DNA分子进行交换和重组操作算子。

免疫记忆规则Rmcs从优秀抗体种群中选取一定数量的优秀抗体进入记忆细胞集合, 成为记忆细胞, 用于引发二次免疫应答。具体规则如下:

其中λ是免疫记忆参数, 决定生成记忆细胞的个数。

基于基因重组的克隆选择算法的算法流程如下:

Step1随机生成规模大小为n的初始抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn};

Step2 For每一代种群do

{

Step2.1对随机生成的初始抗体种群Ab, 按照克隆选择规则, 进行Rscs (Ab) 操作, 构成规模大小为k的子种群Abk;/*计算抗体/抗原的亲和力, 按照亲和力大小对抗体种群进行排序, 选取亲和力较大的抗体形成子种群*/

Step2.2对子种群Abk, 参照克隆扩增规则, 进行Rpcs (Abk) 操作;/*对选择出来的抗体根据亲和力大小进行克隆增殖, 亲和力越大增殖的规模越大*/

Step2.3对于余下种群Abn-k, 参考克隆变异规则, 进行Rhcs (Abn-k) 操作, 对低亲和力的抗体进行定向变异, 改变其亲和力;/*获取优秀抗体的优势基因片段, 借助基因重组技术对亲和力低的抗体进行有效的改造, 完成变异过程*/

Step2.4参照免疫记忆规则, 进行Rmcs (Abn-k) , 生成记忆细胞;/*选取最优抗体成为记忆细胞, 用于引发二次免疫应答*/

Step2.5将原种群中亲和力低的 (l+r) 个抗体用l个优秀抗体和r个随机生成抗原细胞进行代替进入下一代新的抗体种群;/*引入部分随机生成的抗体, 避免陷入局部最优解*/

}

Step3直到满足算法结束条件

Step4从抗体种群中选择亲和力最大的抗体作为最优抗体

3 仿真实验与结论

为了评估基于基因重组克隆选择算法的在收敛速度与搜索范围的性能, 实验选取如式 (11) 、式 (12) 作为测试函数, 并与基于混合变异的克隆选择算法进行比较:

基于混合变异的克隆选择算法采用文献[9]的代码, 种群规模为100, 每个变量 (抗体) 的二进制编码 (抗体DNA分子) 长度为20位, 测试函数与亲和力函数的映射关系如式 (13) , 亲和力值越大, 说明抗体越好, 越接近函数的最优值 (测试函数的极小值) 。终止条件是达到给定的最大进化代数 (本文的进化代数是200) 或者是解在连续30次迭代中不再变化, 认为算法基本收敛, 算法结束。

其中, f (Ab) 为抗体Ab对应的可行解的目标函数值, β是调节因子。

利用基于基因重组的克隆选择算法 (GRCSA) 和基于混合变异的克隆选择算法 (HMCSA) 分别对对目标函数f1和目标函数f2进行性能评估, 实验数据如下表所示。

从表中可以看出, 在算法进化过程中, 通过GRCSA算法得到的测试函数的极小值和种群均值都要小于由HMCSA算法得到的。另外, 对于测试函数f2, 由于是函数本身就是多峰函数, 具有多个函数极小值, 通过GRCSA算法得到函数的极小值小于HMCSA算法得到的, 说明GRCSA算法扩大了问题解的搜索范围, 提高了目标函数最优解 (极小值) 的精度。

图1和图2分别是目标函数f1和f2的进化曲线, 横坐标轴为进化代数, 纵坐标轴为测试函数的极小值。从图中可以看出, GRCSA算法的收敛迭代次数要明显低于HMCSA算法的, 并且每次迭代GRCSA算法取到的测试函数的极小值均小于HMCSA算法的, 说明GRCSA算法在种群进化速度上优于HMCSA算法。基于基因重组的克隆选择算法是借助基因重组技术, 在抗体高频变异阶段, 对亲和力低的抗体进行定向变异, 提高了抗体变异效率和算法收敛速度。因此, 在进化初期, GRCSA算法的收敛速度明显快于HMCSA算法的。另外, 基于基因重组的克隆选择算法根据相同亲和力的不同的抗体浓度, 对抗体进行不同规模的克隆增殖, 增加了优秀抗体的种类及多样性, 避免在收敛速度加快的同时, 陷入局部收敛, 造成局部最优的情况。在进化后期, 虽然两种算法都达到了一种基本收敛, 但是从测试函数的极小值上看, GRCSA算法得到函数极小值是小于HMCSA算法的, 从而证明基于基因重组的克隆选择算法在收敛速度和搜索范围的有效性。

4 结语

动物转基因及克隆技术研究 篇2

动物转基因是通过转基因技术将改造后的目的基因或基因组片段导入实验动物的受精卵,使其与受精卵DNA发生整合,然后将此受精卵转移到雌性受体的输卵管或子宫中,使其顺利完成胚胎的发育.克隆是指基因型完全相同的.两个或更多的个体组成的一个群体.转基因克隆动物技术的采用可使基因转移效率大大提高.

作 者：余华 叶健强 刘丹 YU Hua YE Jian-qiang LIU Dan 作者单位：余华,YU Hua(四川省出入境检验检疫局,四川,成都,610066)

叶健强,YE Jian-qiang(四川省畜牧科学研究院,四川,成都,610066)

刘丹,LIU Dan(成都高新区管委会出口加工管理办公室,四川,成都,610000)

我国率先克隆出水稻功能基因等 篇3

前不久，我国在水稻分蘖分子遗传学机制研究和功能基因克隆技术方面取得重要突破。中国水稻研究所青年科学家钱前博士领导的课题组，与其他科学家合作，分离鉴定出水稻分蘖控制基因ＭＯＣＩ，它能调节水稻分蘖芽的形成及正常生长发育。（浙江）

中国黄牛生下世界顶尖良种奶牛后代

５月３１日上午９时５分，一头世界顶尖良种高产奶牛经过剖腹产诞生在中国农科城杨凌金坤生物工程股份有限公司（邮码：７１２１００，电话：０２９－７０９８６２１）。这头种牛的胚胎是美国胚胎移植协会援赠给我国的７５枚冷冻胚胎中，最早被培育生产出来的小宝贝。（陕西齐永茂）

油菜新品种产量创新高

陕西省咸阳市农科所（邮码：７１２０３４，电话：０９１０－３１１８２４２）华德钊研究员育成的秦优双低９８０２油菜新品种，前不久通过陕西省品种审定，并创造出双低油菜６６７平方米（１亩）产量达２８５．４公斤的国内最高记录。

该品种的芥酸、硫甙含量，均优于国内和国际双低油菜籽质量标准，还具有抗油菜菌核病和病毒病的优势。（陕西毛苹）

四川甘薯育种获突破性进展

四川省南充市农科所（邮码：６３７０００，电话：０８１７－２８０２７２８）选育的甘薯新品种“南薯９９”，前不久通过了国家甘薯品种鉴定。

专家认为，南薯９９综合性状优良，属兼用型甘薯新品种，具有高产、抗黑斑病、耐储藏等突出优点。（四川叶伟达）

让老鼠“计划生育”的疫苗问世

一种可以使老鼠“计划生育”的疫苗，经过新疆大学生命科学与技术学院（邮码：８３００４６，电话：０９９１－８５８３２５９）张富春教授等人三年攻关，前不久宣告试验成功。

注射该疫苗后，在活动正常的情况下，一胎能产下１０只小鼠的高产“妈妈”，现在只能产３～４只。与传统的化学毒杀方法相比，这种方法不会产生二次中毒，不会伤害有益或无害生物。（新疆王慧敏）

湖北选育出桑树新品种

湖北省农科院果茶蚕桑研究所（邮码：４３００６４，电话：０２７－８７３８９４３６）邓文教授选育的桑树新品种“鄂育１号”，前不久通过湖北省品种审定。

“鄂育１号”树型直立，发条数较多，枝条长而直，是早生早熟品种，发芽率９５％以上，叶片数春为４０５～４２９片，秋为２０４～２４０片。（湖北董梁）

杜鹃花新品在昆明诞生

中国科学院昆明植物研究所（邮码：６５０２０４，电话：０８７１－５２２３６３０）张长芹研究员主持的“杜鹃花的抗性育种及新品种选育研究”，前不久获得了云南省２００２年科技发明三等奖。

甘蔗基因克隆的研究进展 篇4

近年来, 随着基因工程技术的发展, 利用分子生物技术对甘蔗品种进行遗传性状改良已成为甘蔗育种的热门研究。选育抗旱甘蔗品种对甘蔗产业的可持续发展甚为重要, 而通过基因改良提高甘蔗抗旱性是目前比较热门的研究方向。了解与分析近年来对甘蔗抗旱基因克隆的相关研究现状, 有助于为下一步研究把握方向, 为进一步挖掘出更多重要抗旱基因用于甘蔗品种改良打下坚实基础。

1 甘蔗渗透调节相关基因的研究

甘蔗是一种对水分和热量要求比较高的植物, 在甘蔗的生理代谢、营养吸收和物质转化等过程中均少不了水分的参与, 因此水分是维持甘蔗正常生长发育的重要物质。当甘蔗受到干旱胁迫时, 苗期蔗苗的萌芽、中期蔗株的分蘖、伸长以及后期甘蔗糖分的积累等不同生长发育过程均会受到限制, 从而使甘蔗体内发生一系列的生理生化反应, 如渗透调节物质变化、活性氧增加、光合作用受抑制等, 是影响甘蔗产量和品质最主要的非生物胁迫因素。大量研究发现干旱胁迫时甘蔗体内会积累大量的代谢物质, 并通过自身的调节功能维持细胞内外的物质平衡和渗透压平衡。这些渗透调节物质分为2类:一类是游离小分子有机物质, 主要包括脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖、氨基酸等;另一类是外界进入植物体内的无机离子, 主要有K+、CL-、Ca2+、Mg2+、Na+等。

脯氨酸是一种小分子的渗透物质, 在正常生理p H范围内不带静电荷, 对植物无毒害作用。在细胞含水量很低时脯氨酸仍能提供足够的自由水, 从而维持细胞的正常活动, 因此脯氨酸被认为是与抗旱性密切相关的植物渗透调节物质。在干旱胁迫时为了提高植物的抗旱性, 植物细胞内会积累大量游离脯氨酸, 从而增加植物对水分胁迫和渗透胁迫的抗性[1]。至今已从水稻、拟南芥、黑麦、大豆、番茄等植物中成功克隆出了多个脯氨酸合成酶或与之相关的基因, 研究证明。1-吡咯琳-5-羧酸合成酶 (P5CS) 与脯氨酸脱氢酶 (Pro DH) 都是脯氨酸合成的主要酶类。Molinari等[2]将脯氨酸合成酶基因 (P5CS) 导入甘蔗体内中, 结果表明转基因甘蔗在干旱情况下诱导脯氨酸大量积累, 在干旱12 d后转基因植株的生物量明显提高。黄城梅[3]采用同源克隆与RT-PCR方法从甘蔗中成功克隆到Sc-P5CS基因, 建立反义植物表达载体后转入烟草, 进行研究发现转入Sc-P5CS基因的烟草植物矮小、叶片变黄, 猜测这与抑制了脯氨酸的合成有很大的关系。

海藻糖能够有效的保护植物体内细胞膜和蛋白质的结构, 因此甘蔗在受到干旱胁迫时海藻糖可以有效防止细胞失水, 从而使甘蔗具有更强的抗旱、抗寒能力。Li等[4]在水稻中克隆并转基因海藻糖-6-磷酸合成酶基因Os TPS1, 结果发现不仅可以使一些与干旱胁迫相关的基因上调表达, 而且在诱导表达的转基因植株中, 海藻糖和脯氨酸的浓度明显高于普通植株。Zhang[5]等将海藻糖合成酶基因转入甘蔗, 通过对转基因甘蔗体内一系列生理指标的测量, 转基因植株能够合成和积累海藻糖并明显提高了甘蔗的抗旱性。

2 甘蔗抗氧化防御类相关基因的研究

当植物受到干旱胁迫时活性氧产生的速率会随着胁迫的加大而递增, 从而导致细胞内的活性氧代谢失去平衡, 而过剩的活性氧将在细胞内诱发自由基连锁反应, 然后产生H2O2、O2-、OH-等更多的自由基和活性氧, 当细胞内大量积累活性氧类物质时就会对细胞造成一定的伤害, 主要表现为[6,7,8]:①加快细胞膜脂过氧化, 从而损伤甚至瓦解维持植物细胞区域化的膜系统;②活性氧攻击核酸碱基, 破坏核酸结构, 使变异产生并积累;③活性氧与色氨酸残基或者酶蛋白的巯基发生反应使酶失活;④活性氧对DNA复制过程的伤害, 导致蛋白质的合成受到破坏。超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 及过氧化物酶 (POD) 是植物体内抗氧化酶系统的主要作用酶, 在植物受到干旱胁迫时会激活这一类的氧化酶基因过量表达, 然后快速提高植物清除活性氧的能力, 增强相关蛋白复合体及膜结构的稳定性。

2.1 超氧化物歧化酶 (SOD)

SOD是一类广泛存在于植物细胞内的金属酶, 是膜脂过氧化防御系统的关键保护酶, 也是抵御活性氧伤害的第一道防线。它能催化活性氧发生歧化反应生成H2O2和O2, 其他酶类负责把H2O2分解为H2O, 从而避免植物受到伤害[9]。由于定位与结合的金属离子的不同, 可以将SOD分为以下3种[10,11]:①主要存在于叶绿体和细胞质中的Cu/Zn-SOD;②主要存在于线粒体的Mn-SOD;③主要存在于叶绿体的Fe-SOD。随着人们对SOD的不断研究与深入, 已经在水稻[12]、小麦[13]、甘蔗[14]、拟南芥[15]等很多植物中对其克隆成功。

王盛等[14]在甘蔗中成功克隆得Cu/Zn-SOD, 对其进行各种逆境胁迫后定量分析, 结果表明该基因的表达受到干旱、低温、高盐及氧化胁迫的诱导表达, 且主要存在于甘蔗叶片中, 与该基因定位于植物地上绿色部位的推测完全一致。

Que等[11]成功克隆到甘蔗Mn-SOD基因的全长, 进行黑穗病菌胁迫后发现该基因受到甘蔗黑穗病菌胁迫的强烈诱导, 推测该基因具有清除多余氧自由基和抗病的功能。Galune[16]对番茄进行干旱胁迫后分析Cu/Zn-SODs的变化, 结果显示干旱胁迫可以诱导Cu/Zn-SODs, 而且是番茄对干旱胁迫的重要响应途径。Lyudmila等[17]对抗性和感性小麦品种进行长期干旱胁迫研究, 并对小麦体内的抗氧化酶进行实时定量分析, 结果随着小麦的生长正常未受胁迫的小麦中Cu/Zn-SOD和Fe-SOD的活性均明显下降, 且Fe-SOD逐渐消失, 而受到干旱胁迫后的小麦Fe-SOD和Mn-SOD的活性均不断增加, 尤其是在感性品种中表现更为明显。由此推测, 不同植物中的SOD同工酶在受到干旱胁迫时活性变化与表现不尽一致。

2.2 抗坏血酸过氧化物酶 (APX)

APX是植物体内防御氧化胁迫和自身活性氧代谢的重要抗氧化酶类, 主要存在于细胞的叶绿体、线粒体和胞质中, 是一种由卟啉与肽链构成的血红蛋白。APX是抗坏血酸—谷胱甘肽循环 (ASA-GSH循环) 途径的关键作用酶, 利用其提供的电子将H2O2还原催化转化为H2O。根据APX存在位置的不同可以有以下4种:①存在于细胞质的c APX;②存在于类囊体的t APX;③存在于微体膜的m APX;④存在于叶绿体基质的s APX。

近年来, 有关APX的研究主要集中在逆境胁迫下活性的变化或转录水平基因克隆等方面, 已有拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 、大麦 (Hordeum vulgare) 、甘蔗 (Saccharum officinarum) 棉花 (Gossypium spp.) 、水稻 (Oryza sativa) 、西红柿 (Lycopersicon esculentum) 、马铃薯 (Solanum tuberosum) 等多种植物的APX基因被成功克隆和深入研究。王竹青等[18]结合电子克隆技术和RT-PCR等方法克隆到甘蔗APX基因, 该基因全长1171bp编码345个氨基酸, 并对其进行ABA、PEG、Na Cl等逆境胁迫, 结果均呈上调表达。克隆百合APX基因并将其导入拟南芥, 结果发现拟南芥植株APX酶活性和耐盐性均显著提高[19]。有研究发现APX基因的过量表达, 可明显提高转基因植株的抗旱抗氧化等抗逆境胁迫能力, 并可以有效保护膜系统遭受活性氧的侵害, 从而提高转基因植物的抗逆性和耐受性。过表达APX的转基因烟草在受到氧化胁迫和除草剂胁迫时t APX活性比野生型的提高了37倍, 不仅有效地提高了转基因烟草的抗氧化胁迫能力, 而且增强了转基因烟草对除草剂诱导和氧化胁迫诱导的细胞死亡的抗性[20,21]。盐胁迫耐受型和敏感型不同基因型的黑麦草[22], 在试验处理4 d后耐受型植株叶片中SOD和APX的活性明显提高, 而在敏感型的植株叶片中MDA、H2O2的含量明显增加, APX等抗氧化酶的活性均低于对照组。同样的情况在水稻中也有所发现[23], 高盐胁迫水稻幼苗叶片, 随后叶片中的SOD、APX、CAT等抗氧化酶的活性不断升高, 因此在植物受到各种非生物胁迫时APX在植物抵御逆境胁迫时起到了重要的作用。

3 甘蔗ABA信号转导相关研究

3.1 ABA生物合成途径中的关键酶

近年来, 许多研究表明[24,25], C40的类胡萝卜素间接途径是高等植物体内ABA的主要生物合成途径。该途径以C40的类胡萝卜素为前体, 再由类胡萝卜素裂解成C15的化合物黄质醛 (XAN) , 最终通过氧化裂解转化成ABA[25]。在此途径中9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶 (NCED) 是催化裂解类胡萝卜素前体的关键酶, 研究表明ABA合成的类胡萝卜素前体的含量可比ABA含量高出上百倍, 可称为“类胡萝卜素前体库”, 因此NCED被认为是ABA生物合成中最重要的限速酶。植物NCED基因是一个只在特定组织表达的多基因家族, 其c DNA已在拟南芥[26,27]、甘蔗[28]、大麦[29]、花生[30]、马铃薯[31]等植物上被克隆到。转基因植物中NCED基因的过量表达能引起ABA的积累和耐旱性的增加, 过量表达甘蔗So NCED、番茄Le NCED3、拟南芥At NCED3、豆类Pv NCED1均可以使转基因植株体内ABA含量的增加, 并且显著提高了转基因植株的耐干旱的能力[26,28,32,33]。

在拟南芥中, NCED基因是一个多基因家族共有9个成员, 其中5个基因在ABA生物合成中有功能活性[34]。在这5个基因中, At NCED3被认为是响应干旱胁迫的, 在叶片中起着主要作用[37]。研究发现在拟南芥中, At NCED3的表达受到干旱胁迫的上调, 过量表达At NCED3的植物积累ABA, 并表现出蒸腾作用减弱的现象, 耐旱力增强[35]。李长宁等[28,36]运用RT-PCR及RACE-PCR技术克隆出甘蔗So NCED基因, 并扩增出So NCED基因的开放阅读框, 大小为1827 bp, 编码608个氨基酸。在不同胁迫时进行甘蔗叶片实时荧光定量PCR分析, 该基因在干旱、低温、高盐等条件的处理下均能诱导表达。So NCED基因的表达量在不同胁迫处理后到达峰值时间虽有差异, 但都有明显的上调表达。同时在甘蔗叶片和根系中发现So NCED基因表达量均能随着活性氧产生速率的升高而显著上升, 并与ABA含量的增长呈协同关系, 因此推测So NCED基因参与了甘蔗叶片和根系内源ABA合成的调控。对玉米、柑橘等作物进行研究发现[37,38,39], NCED基因的表达均可被不同逆境胁迫诱导, 且表达量与ABA含量有着协同效应, 过表达该基因能明显提高转基因植株内源ABA的含量和耐胁迫能力。

3.2 甘蔗ABA信号转导相关基因

通过对ABA信号转导通路的研究发现[40,41,42,43,44,45], 植物细胞在受到逆境诱导时可以合成内源ABA, A-BA与其受体PYR1结合后再与PP2C结合形成三元复合体, 从而抑制了PP2C的活性, 使受PP2C抑制的Sn RK2s激酶处于活性状态, Sn RK2s激酶能磷酸化ABA响应元件的结合蛋白或结合因子, 然后激活ABA应答基因的表达, 从而调控植物的生理反应和生长发育。Sn RK2s是该途径中关键的调控酶基因, 它的激活在植物响应渗透逆境胁迫时发挥着重要的作用。

谭秦亮等[46]利用RT-PCR和RACE-PCR技术, 克隆出编码甘蔗Sn RK2蛋白的基因So Sn RK2, 并对该基因进行了原核表达及蛋白纯化的分析, 在A-BA、干旱、低温等外源胁迫处理下发现在甘蔗叶片中该基因均上调表达, 推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。小麦的Ta Sn RK2.3基因被克隆后转拟南芥, 结果发现转基因拟南芥上调表达, 不仅能够改善根系生长, 而且能够显著提升耐旱、耐盐、和抗冻结能力[47]。

4 结语

基因克隆 篇5

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

基因克隆 篇6

近日，中科院上海生科院植物生理生态研究所植物分子遺传国家重点实验室林鸿宣院士领衔的研究团队，第一次成功分离并克隆了水稻抗高温主要基因，深入研究了其分子机理、在水稻演化史和抗高温育种中的作用。这一研究成果有望明显增强农作物的抗高温能力。

林鸿宣研究团队针对“农作物抗高温”研究进行了长达10余年的攻关，他们以生长在热带地区、具有更强高温抗性的非洲稻为研究对象，采用遗传分析和定位克隆的实验方法，成功分离并克隆到了控制非洲稻高温抗性的主要基因——高温抗性1号基因。非洲稻抗高温主要基因的成功分离与克隆，为亚洲稻抗高温能力的提高提供了重要线索和思路。研究团队通过多年田间杂交将“1号基因”导入到中国栽培的水稻品种中，研究结果表明，这一做法可明显增强亚洲稻各类品种的高温抗性。

对此，研究团队认为，“1号基因”是一个具有重要生物意义的基因位点。可以肯定，未来“1号基因”在各水稻品种、包括小麦在内的禾本科作物以及包括大白菜在内的十字花科蔬菜等不同农作物的抗高温育种中都将有广泛的应用潜力。

AIDA-1基因的克隆与鉴定 篇7

AIDA-1为革兰氏阳性菌的IV型分泌系统, 可在革兰氏阴性菌表面形成桶装结构, 展示其N-端携带的蛋白[1~3]。IV型分泌系统在革兰氏阴性菌表面展示外源蛋白的过程中, 无需其他因子的辅助, 因此是方便高效的细菌表面展示系统。该展示系统在疫苗的研制及表位筛选等方面具有很大的优势。本研究拟通过PCR方法, 获取AIDA-1基因。

2材料与方法

2.1引物设计

根据NCBI上公布的AIDA-1的序列设计了上、 下游引物。

2.2 PCR扩增

取1mL对数生长期的大肠杆菌E393, 煮沸10 min, 12000rpm离心2min, 取上清作为PCR模板[4~6]。 PCR反应体系为50μL其中包含:5μL大肠杆菌模板, 5μL PCR反应缓冲液, 1μL dNTP, 上、下游引物各1 μL, Taq酶1μL, 灭菌超纯水36μL。将PCR反应混合液混匀后, 通过如下程序进行PCR扩增:94 ℃ 4min, 94 ℃ 1min、57 ℃ 1min、72 ℃ 2min共30个循环, 72 ℃ 10min, 4 ℃ 10min。取20μL的PCR产物, 在1% 的琼脂糖凝胶中进行电泳, 条件为80V50min。

2.3 PCR产物的回收及连接

按照凝胶回收试剂盒说明回收AIDA-1产物。分别取4μL PCR产物、1μL pMD19-T simple载体及5 μL连接缓冲液, 轻轻混匀后置于4 ℃连接过夜。

2.4转化及序列测定

取10μL连接产物, 加入到100μL新鲜的DH10B的感受态细菌中, 轻轻混匀, 冰浴30min;在42 ℃水浴锅中热休克90s;立即加入800μL的LB培养基, 并轻轻混匀, 置于37℃摇床中培养50min。取400μL培养物涂布于含有IPTG、V-gal及氨苄青霉素的LB平板中, 37 ℃培养过夜。挑取平板上的白色菌落进行测序分析。

3结果与结论

通过PCR成功扩增出目的片段, 经DNA测序表明AIDA-1基因被成功克隆至T载体中。克隆的AIDA -1基因片段, 可广泛应用于革兰氏阴性菌表面展示。 该表面展示系统可以在细菌表面展示外源蛋白, 可与流式细胞术等高通量的检测及分离方法结合, 应用于疫苗的制备、生物吸附剂的研制及抗原表位的筛选等领域。 因此, 本研究克隆的AIDA-1基因为我们后期的研究提供了材料基础, 具有广泛的应用前景和应用价值。

摘要：为了克隆AIDA-1基因并对其定序, 通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1基因, 通过酶切的方法克隆到pMD19-T simple载体中, 再转化入感受态大肠杆菌, 并通过基因测序的方法测定了AIDA-1的序列。结果表明:成功克隆并测定了AIDA-1的序列, 为蛋白展示、疫苗开发提供了重要的材料。

关键词：克隆,测序,AIDA-1基因

参考文献

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[5]罗樨, 王强, 赫然, 等。大肠杆菌质粒DNA PCR模板的快速制备[J].生物技术, 2002, 11 (2) :38.

鹌鹑OBR基因部分序列的克隆测序 篇8

瘦素 (leptin) 是脂肪细胞分泌的一种肽类激素[1] , 它可以调控机体中脂类、蛋白质和糖类代谢, 能够在动物脂肪沉积、繁殖等多方面都起到重要作用[2,3,4,5,6,7]。瘦素的作用是通过靶细胞膜上的受体 (OBR) 和相应的信号转导系统实现的。OBR是Ⅰ类细胞因子超家族受体, 具有单一的跨膜结构。OBR基因转录后进行选择性剪接翻译后生成多种异构体, 它们的胞外区相同, 但胞内结构域长度和序列不同。

1 材料与方法

1.1 试验动物

沙维马特鹌鹑, 每只采血5 mL, EDTA抗凝, -20 ℃保存备用, 取20 μL血液提取基因组。

1.2 试剂

PCR试剂和rTaq酶, 购自哈尔滨伊事达生物工程有限公司, 胶回收 (小量) 试剂盒和小量质粒抽提纯化试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司;质粒PMD18-Tvector, 购自Promega公司;转化宿主细胞JM109大肠杆菌, 由东北农业大学动物遗传育种实验室制备;氨苄西林, 购自哈尔滨宝泰克公司;限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ, 购自上海华舜生物工程有限公司。

1.3 PCR引物

鹌鹑的OBR基因未见报道, 根据鸡的OBR基因对鹌鹑的OBR基因外显子设计了一对引物, 引物序列如下:F1 5′-CACTGTATGGTCCACGAGATT-3′;R1 5′-AACTGGCGTTGTTATTGCTC-3′。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取和检测

按照常规酚/氯仿抽提法进行DNA提取, 并溶于TE中, -20 ℃保存。用紫外分光光度计法检测DNA浓度, 并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度, 将DNA稀释至50 ng/μL备用。

1.4.2 PCR扩增

PCR扩增总体积为25 μL, 其中灭菌水16.3 μL, 10×Buffer (含镁离子) 2.5 μL, dNTP (10 mmol/L) 2.0 μL, 上、下游引物 (10 pmol/L) 各1 μL, rTaq聚合酶0.2 μL, DNA模板2 μL。扩增反应在PCR仪上进行, PCR循环参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 51.8 ℃复性30 s;72 ℃延伸40 s, 32个循环;72 ℃延伸7 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3 电泳及观察分析

取5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶上120 V电泳30 min, 经溴乙锭染色后在UVP凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.4.4 PCR扩增产物的克隆

将PCR扩增产物回收并从琼脂糖上割下放入1.5 mL EP管中, 经胶回收试剂盒纯化后与PMD18-Tvector载体连接之后将10 μL连接产物转化到100 μL的JM109感受态宿主菌中;取150 μL转化产物涂在含氨苄西林 (100 mg/L) 的LB平板上, 37 ℃烘箱培养10～12 h;挑取经PCR鉴定后的阳性白色菌斑放入LB液体培养基中37 ℃培养8～12 h, 然后用小量质粒抽提纯化试剂盒提取质粒。

1.4.5 质粒酶切鉴定和测序

用BamH Ⅰ-Hind Ⅲ双酶切后鉴定确认, 将鉴定确认后的质粒快速邮递到华大生物技术有限公司测序。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以鹌鹑DNA为模板进行PCR扩增, 扩增得到长约208 bp的基因片段, 阴性对照没有出现条带, 证明扩增的条带真实可靠, 见图1。

1～9.PCR扩增产物;10.阴性对照;11.DL-2 000 Marker。

2.2 测序结果

经华大生物技术有限公司测定, 鹌鹑的OBR基因外显子部分序列长度为208 bp, 现已将序列提交到GenBank上 (分析号GQ867177) 。

3 分析与讨论

将所测序列通过GenBank中的Blast比较分析, 长度为208 bp的OBR基因外显子部分序列与鸟纲中鸡形目中原鸡的同源性为100%, 与火鸡的同源性为91%, 与雁形目中绿头鸭的同源性为83%, 与雀形目中珍珠鸟的同源性为70%, 这些结果说明鹌鹑与稚科物种亲缘关系最亲, 与鸟纲其他物种也有较高的同源性, 通过与哺乳纲、两栖纲、鱼纲的动物比较, 同源性均低于50%, 而同一纲动物OBR基因之间具有很高的同源性, 如人、猪、牛、羊的OBR基因的同源性达到 80%以上, 说明OBR基因的该段序列属鸟纲特有的, 在进化上具有很高的物种特异性。

OBR基因在禽类和哺乳动物中所转录异构体的数量是不同的。目前, 在禽类中仅发现2种异构体——长受体和短受体, 而在哺乳动物小鼠中有6种异构体——OBR-a、OBR-b、OBR-c、OBR-d、OBR-e、OBR-f。在氨基酸水平上, 鸡leptin长受体与哺乳动物leptin长受体约有50%的同源性, 而且在各组织表达部位也有较大的差异。这说明OBR氨基酸序列也具有很高的物种特异性。

4 小结

研究利用PCR技术对鹌鹑OBR基因部分序列进行了克隆, 并且将该序列提交GenBank上, 通过序列比较, 鹌鹑的OBR基因与鸟纲中鸡形目的原鸡、火鸡的同源性分别为100%和91%, 与鸟纲中其他目中动物也有较高的同源性, 但是在与哺乳纲、两栖纲、鱼纲动物的OBR基因相比时, 同源性均很低, 说明OBR基因在进化上具有一定的物种特异性。试验只是对鹌鹑OBR基因进行了初步探索, 希望为OBR基因的进一步研究提供重要的参考价值。

参考文献

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基因克隆 篇9

生肌调节因子MRFs是脊椎动物早期发育中重要的调控基因,其作用是调控和决定肌肉的生成,该家族均具有一个保守的碱性螺旋- 环- 螺旋结构( bHLH)[6 -7]。生肌调节因子MRFs家族共有4个主要成员,分别是MyoD、Myf - 5、myogenin、Mrf - 4。 MyoD基因是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主要调控基因,它的主要作用是促进骨骼肌的形成和分化, 缺少MyoD基因可导致成肌细胞无法正常增殖和分化[8]。静止期肌肉卫星细胞向成肌细胞转化需要MyoD基因的参与,其他类型细胞转化成肌细胞也同样离不开MyoD基因的参与,它能促进肌细胞进一步融合,分化成成熟的肌纤维。在肌肉发育过程中, Myf - 5和MyoD是生肌过程所需要的转录因子中最先起作用的。李永平等[9]研究表明,敲除小鼠的MyoD、Myf - 5基因,会导致成肌细胞形成失败,因此使得小鼠头和躯干的骨骼肌发育不健全。

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交( ISH) 是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、 细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位[10]。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了方法,为从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效工具。

1材料

试验所用鲤鱼胚胎,均来自中国水产科学院黑龙江水产研究所,取发育完整的24 h去膜鲤鱼胚胎,设计合成的MyoD引物,见表1。体外转录法标记的MyoD探针,1年生鲤鱼,受精后6,12,24,48 h鲤鱼胚胎。

2方法

2. 1试验前的处理

取发育24 h的鲤鱼受精卵,用4%多聚甲醛固定后去卵膜,将胚胎浸泡在甲醇中-20 ℃保存。

2. 2 RNA的提取

取鲤鱼肌肉组织,加入液氮充分研磨,加入55 ℃ 预热的Tripure( Roche) 1 mL使骨骼肌组织充分裂解,移出上清液,加入氯仿抽提,异丙醇沉淀RNA, 75% 乙醇洗涤后沉淀的RNA用适量无RNA酶水溶解,变性凝胶电泳检测RNA质量,测量总RNA浓度和纯度,-80 ℃冰箱中保存,备用。

2. 3 MyoD基因的克隆

设计MyoD基因引物,以鲤鱼肌肉cDNA为模板,对其进行扩增,将扩增片段与载体连接后转化,经测序,克隆片段为所需MyoD基因片段。

2. 4体外转录法标记MyoD探针

通过测序结果判断片段插入方向,用T7/SP6引物对片段大量扩增,最后利用探针标记试剂盒( Roche) 标记MyoD基因探针。

2. 5鲤鱼整体的原位杂交

杂交第1天: 受精24 h的鲤鱼胚胎分别用25% 、50% 、75% 的甲醇复水,之后经过氧化氢和蛋白酶K处理,重新用4% 多聚甲醛固定,在杂交液中70 ℃ 杂交至少16 h以上。

杂交第2天: 杂交后胚胎分别在溶液Ⅰ( 50% 甲酰胺,5 × SSC pH值为4. 5,1% SDS) 、溶液 Ⅱ [0. 5 mol/L NaCl,10 mmol/L三羟基氨基烷( Tris) - Cl pH值为7. 5,0. 1% Tween20]、溶液Ⅲ( 50% 甲酰胺pH值为4. 5,2 × SSC) 中顺次洗涤,之后室温封闭60 ~ 90 min,加入地高辛抗体( 1 ∶ 2 000 ) ,4 ℃ 孵育16 h。

杂交第3天: TBST( 8 mg/mL NaCl,0. 2 mg/mL KCl,25 mmol / L Tris - Cl pH值为7. 5,0. 1% Tween20) 彻底洗涤后,4 ℃ 过夜。

杂交第4天: 室温下洗涤胚胎3次,加入显色液中室温避光显色,显色完成后PBS洗涤胚胎终止反应,并用50% 甘油透化30 min,显微镜下观察并拍照。

3结果与分析

3. 1 MyoD基因的克隆

从4个不同1年生鲤鱼样品的肌肉中提取RNA,并反转录为cDNA,用GAPDH引物检测cDNA样品,见图1。利用Primer Premier 5. 0软件设计MyoD特异性引物,对反转录的cDNA进行特异性扩增,根据电泳结果可知,特异性片段长度约为250 bp, 与目的片段长度( 219 bp) 相近,可初步确定其为所需目的片段,见图2。选择条带较好的2号cDNA作为模板,大量扩增MyoD片段,并利用胶回收试剂盒回收特异片段,经检测回收片段大小符合预期结果, 见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.PCR阳性产物;2~5.PCR产物;6.PCR阴性产物。

M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。

3. 2 MyoD基因的检测

M. DL - 2 000 Marker plus; 1. 胶回收片段。

将胶回收片段与T3载体连接后转化,挑取4个单菌落,用LB液体培养基扩大培养,并提取质粒。 以质粒为模板,用MyoD特异引物扩增目的条带,其中阳性模板是1年生鲤鱼肌肉cDNA,扩增片段长度与阳性产物一致,初步显示扩增片段即为所需片段, 见图4。选择3号质粒送基因公司测序,并将测序结果在NCBI Blast上与已发表的参照序列进行比较分析,结果显示,所克隆的MyoD基因片段与NCBI上鲤鱼MyoD基因参照序列的同源性达100%,说明试验所克隆的基因片段确实为MyoD基因片段,见图5。 测序结果表明,目的片段的连接方向是正向插入,利用T7/SP6引物检测测序方向是否正确,其中上游引物/SP6( 上/SP6) 和下游引物/T7( 下/T7) 能扩增目的片段,而上游引物/T7 ( 上/T7) 和下游引物/SP6 ( 下/SP6) 不能扩增目的条带,见图6。符合预期要求,说明片段确实为正向插入。

M.DL-2 000 Marker;1.PCR阳性产物;2~5.挑取的4个单菌落扩大培养后所提取的质粒;6.PCR阴性产物。

3. 3鲤鱼整体原位杂交的显色结果

通过鲤鱼胚胎整体原位杂交试验可以清楚地观察到受精后24 h鲤鱼胚胎中MyoD基因的表达情况,试验结果显示,与未加入探针的阴性对照相比( 见图7A) ,在鲤鱼近轴部位的体节中,MyoD基因表达非常明显,成条带状贯穿背部至尾后缘。另外,在鲤鱼早期胚胎的头部及眼睛周围,MyoD基因也有明显表达,同时心脏部位及下腹部也发现少量MyoD基因表达,但表达并不如体节中强烈,而且在早期鲤鱼胚胎的脑部后缘也发现有MyoD基因的表达,但其显色较微弱,表达不明显( 见图7B、C、D) 。

M. DL - 2 000 Marker; 1. T7 / SP6; 2. 上 / T7; 3. 下 / T7; 4. 上 / SP6; 5. 下 / SP6。

A.鲤鱼整体原位杂交阴性胚胎;B,C,D.鲤鱼整体原位杂交结果。

3. 4检测MyoD基因在鲤鱼早期胚胎中的表达

从受精后6 h、12 h、24 h、48 h鲤鱼胚胎中提取RNA,并反转录为cDNA,通过GAPDH表达调平后, 检测MyoD基因在早期鲤鱼胚胎中的表达。经检测发现,鲤鱼胚胎内MyoD基因的表达量随发育时间的延长逐步增加,在24小时时达到最高,而在48小时时表达量下降,见图8。

M.DL-2 000 Marker;1.6 h;2.12 h;3.24 h;4.48 h。

4讨论

MRFs基因家族的发现及其生理功能的研究不仅揭示了肌肉发育的分子生物学机制,也为在动物生产中同时获得高净肉率和高肉制品品质提供可能。 其中MyoD基因是生肌调节因子MRFs家族4个成员之一,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因, 对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行[11 -12]。1987年, Devis首次发现并获得MyoD基因cDNA,对生肌调节因子的研究越来越受到人们的重视[13],目前已克隆获得包括人、大鼠、小鼠、牛、鸡、绵羊、扬子鳄、爪蟾、 鲤鱼、虹鳟、斑马鱼、奥利亚罗非鱼、鳕鱼、文昌鱼等多种脊椎动物的MyoD基因,但对于该基因的研究主要集中在基因的结构和医学诊断上,而对于该基因在肉用动物生产中肌肉发育调控的研究还未受到重视[14 -17]。因此,试验选择鲤鱼为研究对象,对鲤鱼MyoD基因进行克隆和序列分析,以期为鲤鱼肌肉发育调控的机理及肉质改良奠定基础。

试验以受精24 h的鲤鱼胚胎为试验材料,提取RNA,反转录为cDNA; 并以cDNA为模板,设计特异性的MyoD上、下游引物,进行大量扩增,根据电泳比对结果,特异性片段长度约为250 bp,与设计引物长度相符,可以代表MyoD基因,同时对目的片段进行回收,并标探针。用标记后的MyoD探针对受精后24 h鲤鱼胚胎整体原位杂交,可以直观地观察到MyoD基因在鲤鱼胚胎中脊髓两侧近轴细胞对称表达,在心脏部位及下腹部也有表达。说明MyoD基因在鲤鱼早期胚胎发育过程中就开始表达并发挥作用, 对鲤鱼的生长发育具有重要意义。为了检测早期鲤鱼胚胎中MyoD的表达,试验提取不同发育时期鲤鱼胚胎的RNA,并反转录为cDNA,检测MyoD基因的表达,发现在6 h、12 h、24 h、48 h各时期均有表达, 表达量随发育时间的延长而增加,在24小时时表达量最高,到48小时时开始下降。

综上所述,为了进一步探索MyoD基因对鲤鱼肌肉发育的具体调控机制,应当对不同发育时期鲤鱼MyoD基因的表达进行进一步研究,建立鲤鱼MyoD基因表达的时间谱,并参考模式生物斑马鱼中MyoD基因的研究进展,对鲤鱼中MyoD基因的作用机制进行研究,为改良鲤鱼肉质品质和质量奠定基础。

摘要：为了研究成肌分化因子(MyoD)基因在鲤鱼发育中的功能,采用鲤鱼完整早期胚胎作为试验材料,通过对MyoD基因的克隆,利用整体原位杂交技术,从个体水平研究其在鲤鱼早期发育中的表达情况,明确该基因在鲤鱼胚胎早期的表达部位。结果表明:MyoD是生肌调节因子MRFs家族(MyoD、Myf-5、myogenin、MRF4)的重要成员,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD基因的表达不仅能促进肌细胞的发育,还能使其他类型细胞转化成肌细胞,并能促进肌细胞进一步融合,分化成成熟的肌纤维。

基因克隆 篇10

目前, 尚未见有关于兔musclin基因的研究报道。本试验利用RT-PCR技术克隆了兔musclin基因, 并将序列提交Gen Bank收录 (EF547185) , 为进一步研究musclin在兔骨骼肌中的生物学功能提供了一些基础资料。

1 材料与方法

1.1 酶与试剂

试验所用到的引物、酶等试剂均购于宝生物 (大连) 有限公司, 仅RNA提取试剂-动物RNAout购于绵阳高新区天泽基因工程有限公司。

1.2 肌肉素基因的克隆

1.2.1 引物设计与合成。

依据大鼠的m u s c l i n基因序列 (NM_207612) 设计了上游引物, 牛电子克隆的osteocrin基因序列 (X M_5 8 8 3 9 0) 设计了下游引物, 分别为:F 1:5’-AGATGCTGGACTGGAGATTGGC-3’, R1:5’-GGAATCCATTAGCCTCTG GAATTTG-3’。引物在宝生物 (大连) 有限公司合成。

1.2.2 肌肉组织中总RNA的提取。

取0.1g兔的骨骼肌组织, 采用RNA OUT提取总RNA, 溶解于15µL DEPC水中备用。

1.2.3 RT-PCR扩增、反转录体系:

反应程序为:25℃10min, 42℃60min, 72℃15min, 后冰浴2min, 得到c DNA, 以此为模板进行PCR扩增目的基因。反应程序为:95℃预变性5min, 然后95℃变性30S, 50℃退火30S, 72℃延伸45S, 最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并纯化。

1.2.4 DNA序列测定。

将筛选出阳性克隆取三份, 送由北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。

1.2.5 DNA序列分析序列分析。

在NCBI网站中运行blast、Signal P3.0 Server、DNAstar及Bio XM软件分析。

2 结果与分析

2.1 兔肌肉素的RT-PCR扩增及克隆

以兔骨骼肌中的总RNA为模板, 利用肌肉素特异的上下游引物, 采用RT-PCR的方法, 扩增得到相应的基因, 1%琼脂糖凝胶电泳检测的结果表明, 得到了长度为409bp的目的片段 (图1) 。

2.2 兔Musclin的c DNA序列

克隆的兔Musclin基因包含一个完整的开放阅读框架 (open reading frame, ORF) , 全长为409bp, 编码由132个氨基酸残基组成的Musclin前蛋白, 其中酸性氨基酸为22个, 碱性氨基酸为24个, 分子量为14.72k Da, 等电点为10.099。预测的信号肽区为27~28个氨基酸.成熟的Musclin由104~105个氨基酸组成。通过预测的氨基酸序列分析, 在序列中含有“KKKR”结构 (下划线1) 和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域 (下划线2) , 结构特征 (见图2) 。

3 讨论

3.1 兔Musclin基因c DNA序列的种属差异

兔Musclin基因 (Gen Bank No.EF547185) 的ORF与小鼠、大鼠、人、猪和鸡的同源性分别为78.2%、79%、87.9%、98.2%和46.7%.

3.2 兔Musclin基因氨基酸序列的种属差异

兔Musclin的氨基酸序列与小鼠、大鼠、人、猪和鸡在基因进化方面的关系:兔和猪的同源性较高, 小鼠和大鼠的同源性较高, 而鸡的与以上五种的同源性较差。兔Musclin基因预测的氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、猪和鸡的同源性分别为87.9%、74.2%、73.1%、96.2%和56.8%。

有关musclin的生物学功能尚不十分清楚。Nishizawa H, et al. (2004) [1]研究证实, 进食影响musclin的表达, 禁食48h后, 小鼠腓肠肌中musclin的m RNA表达几乎消失, 重新进食后24h, m RNA表达恢复;STZ诱导的胰岛素缺陷小鼠腓肠肌musclin的m RNA表达显著降低;在胰岛素抵抗小鼠模型musclin的m RNA表达均显著升高;离体实验中发现胰岛素和IGF-1呈浓度依赖的升高肌细胞musclin的m RNA表达, 而肾上腺素、异丙肾上腺素及forskolin则明显降低musclin的m RNA表达;在C2C12细胞, musclin明显的抑制胰岛素促进的葡萄糖的摄人及糖元的合成。因此, musclin可能是肌细胞的能量调节因子。PPARγ激动剂Troglitazone可诱导人肌细胞Musclin的表达, 但其信号传导途径尚不清楚[10]。

本试验克隆了兔musclin基因, 为下一步musclin基因的全长克隆和musclin生物学功能的进一步研究奠定了基础。

参考文献

[1]Nishizawa H, Matsuda M, Yamada Y, et al.Musclin, a novel skeletal muscle-derived secretory factor[J].J Biol Chem, 2004, 279 (19) :19391-19395.