猪链球菌2型

猪链球菌2型（精选八篇）

猪链球菌2型 篇1

1 猪链球菌2型毒力相关因子的研究现状

猪链球菌2型的致病性与多种毒力因子的作用有关。目前, 研究比较清楚的毒力因子包括荚膜多糖 (CPS) 、溶菌酶释放蛋白 (MRP) 、细胞外因子 (EF) 、溶血素、黏附素、IgG 结合蛋白、44 ku 胞壁蛋白、纤连蛋白结合蛋白、谷氨酸脱氢酶 (GDH) 蛋白、ORF2 毒力相关序列、TragG基因、透明质酸酶, 以及其他的致病性毒力岛和细菌样抑制性物质[1]。随着研究的深入, 新的与猪链球菌2型致病性相关的蛋白片段和基因序列也成为该领域研究的热点。

1.1 荚膜多糖

基于对细菌病研究的传统观念, 人们首先认为荚膜多糖是猪链球菌2型重要的毒力因子, 与细菌的致病性密切相关。I.W.Wibawan等[2]研究表明, 荚膜的存在降低了猪链球菌2型被吞噬的程度。M.A.Segura等[3]研究表明, 有荚膜的猪链球菌2型不易被吞噬, 而无荚膜的突变株则很容易被吞噬, 这说明荚膜多糖作为毒力因子具有重要的致病作用。然而, N.Charland等[4]研究表明, 有着与致病菌株相同大小的荚膜和唾液酸的非致病菌株, 并不能像致病菌株那样引起猪脑膜炎, 这说明了荚膜多糖并不是唯一的毒力因子, 除此之外还有其他因子参与猪链球菌2型的致病过程。

1.2 溶菌酶释放蛋白 (MRP) 和细胞外因子 (EF)

溶菌酶释放蛋白和细胞外因子被认为是猪链球菌的两种重要的毒力因子。溶菌酶释放蛋白又称为M蛋白, 存在于细胞表面, 溶菌酶释放蛋白可诱导细胞发生 2 种典型的形态学变化:一是诱导细胞融合形成多核巨细胞, 然后巨细胞发生凋亡;二是诱导单个细胞凋亡, 凋亡率达18%, 说明溶菌酶释放蛋白可单独作为猪链球菌2型的毒力因子[5]。细胞外因子为细胞外蛋白, 只能从培养的上清液中检测到, 它在猪链球菌2型致病中的作用还不清楚。

1.3 溶血素和黏附素

猪链球菌 2 型的溶血素是一种溶细胞性蛋白毒素, 其溶血活性与温度、血清白蛋白和氧气等因素相关, 而且猪链球菌 2 型菌株的溶血素对人的 O 型红细胞最为敏感。N.Charland等[6]研究表明, 猪链球菌溶血素除了能溶解多种动物的红细胞外, 还具有细胞毒性作用。猪链球菌的黏附素主要有 2 种, 一种是分子质量为18 ku, 能被猪链球菌识别的3己糖基酰基鞘氨醇的双糖序列, 负责猪链球菌血凝特性的特异性结合, 存在于所有的菌株中[7];另一种分子质量为39 ku, 与白蛋白有结合活力。S.Quessy等[8]研究发现, 当给小鼠注射这种黏附素时, 白蛋白含量增加, 猪链球菌菌株的毒力也增强。

1.4 其他的蛋白类因子和酶类

田云等[9]对毒力株 (HA9801) 及无毒力株 12 个基因组进行了抑制性差减杂交试验, 获得 5个新的毒力基因片段, 而且这 5 个基因片段的发现为 PCR方法检测不同毒力猪链球菌2型菌株奠定了基础。段志涛等[10]从临床分离到的所有致病性猪链球菌 2 型中发现了分泌型核酸酶 (SsnA) 基因和次黄嘌呤核苷酸脱氢酶 (IMPDH) , 通过对多种血清型猪链球菌进行活性检测和基因检测发现, 分泌型核酸酶和次黄嘌呤核苷酸脱氢酶在多种型别的猪链球菌中都存在, 但主要在链球菌 2 型中表达, 它们能明显改变细胞膜的通透性, 利于菌体穿过胞膜屏障进入细胞内增殖, 从而致病, 所以推测分泌型核酸酶和次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因可能是猪链球菌 2 型新的毒力因子。

1.5 毒力岛

研究发现, 在强致病株 O5ZY/H33 和 98HA/H12 染色体中均有1个约 89 kb的特有核苷酸片段, 通过生物信息学分析该片段具有基因组毒力岛 (PAI) 的特征, 而且此特征仅存在于中国流行株。另有研究表明, 在猪链球菌 2 型的致病过程中致病岛PAI4 和 SalK/SalR 二元调控基因都起重要作用, 但其致病机理还有待深入研究[11]。

2 猪链球菌2型耐药性研究

临床治疗猪链球菌病常用的抗生素有庆大霉素、卡那霉素、四环素、青霉素等。近年来, 由于养殖场大量滥用抗生素, 造成猪群中耐药链球菌的存在, 使原有的敏感抗生素失去作用, 2005 年农业部兽医诊断中心的临床检测数据表明, 约 40%的猪链球菌分离株有较强的耐药性, 但未能筛选出高敏药物;约 10%的猪链球菌分离株有很强的耐药性, 仅对个别药物中度敏感性, 而对头孢类药物不敏感。造成猪链球菌2型耐药性存在的一个重要原因是由于在细菌染色体上插入了含有特定抗生素抗性的转座子序列, 另一个重要原因在于菌体含有耐药性质粒, 具有明显的地域性差异。不同国家或地区所分离的猪链球菌对其他类药物的耐药性不尽相同, 普遍存在的问题是各国家对猪链球菌耐药性的长期调查资料相对缺乏, 难以了解其耐药性的发展趋势[12]。该病血清型较多, 不同猪场发生猪链球菌病的血清型可能不一样, 对药物的敏感性也不一样, 同一血清型, 即使在同一猪场不同时期, 猪只的不同生长阶段对药物的敏感性也可能不一样;因此, 定期对菌株进行耐药性监测有利于控制和治疗猪链球菌病。

3 猪链球菌病 2 型检测方法的研究

目前, 对猪链球菌病的鉴定方法有生化鉴定、血清学鉴定及分子生物学鉴定等技术手段, 一般将生化鉴定方法作为补充。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验 (ELISA) 、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验, 其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛;分子生物学方法包括聚合酶链式反应 (PCR) 、基因芯片技术、多位点酶电泳技术, 利用核糖体分型技术, 随机扩增 DNA 片段进行多态性分析, 脉冲场凝胶电泳、分子伴侣 (Cpn60) 基因对猪链球菌进行基因分群等[13]都在猪链球菌研究中有过应用, 其中PCR、基因芯片技术应用较多。

3.1 PCR方法

L.M.Silva等[14]以 gdh 基因序列为基础建立的多重PCR能同时鉴别 1型、2型、7 型和 9 型菌株, 依据epf、mrp、sly等毒力相关基因建立的多重 PCR 能至少区分6种mrp变异株。该方法不仅可以同时鉴别1型、2型、7型和 9 型菌株, 而且具有很高的特异性, 与其余 9 种链球菌、18 种革兰阴性菌和 9 种革兰阳性菌之间不存在交叉反应, 可以作为一种快速、简便、可靠的猪链球菌检测和鉴别的方法。

3.2 基因芯片技术

郑峰等[15]针对猪链球菌cps1、cps2及cps9基因的保守区设计了特异性寡核苷酸探针, 利用基因芯片技术鉴别猪链球菌的主要致病血清型;同时选取包括 gdh、fbp、mrp、epf、sly 等毒力基因作为检测靶位点, 特异性杂交后, 在扫描仪上分别使用 cy3 和 cy5 最佳激光强度进行扫描, 通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析, 与其他分析基因表达谱技术的不同之处在于基因芯片技术可以在1次试验中平行分析成千上万个基因。

4 猪链球菌2型疫苗的开发研究

4.1 猪链球菌现用疫苗的研究现状

在国内, 猪链球菌现用的疫苗主要为多价灭活苗、氢氧化铝甲醛苗和弱毒冻干苗。虽然, 传统的疫苗在免疫防制中取得了一定的效果, 但猪链球菌 2 型的传统疫苗存在生产成本高、抗原性不断演变、容易散毒、疫苗制造过程中容易感染操作人员等缺陷, 因此仍需研制新型高效的分子疫苗。

4.2 基因工程疫苗的研究现状

李明等[16]根据猪链球菌 2 型溶菌酶释放蛋白和胞外蛋白因子 (EPF) 的基因序列, 各设计合成1 对引物, 以猪链球菌 2 型江苏分离株 (SS2-1) 的基因组为模板, 扩增 epf 基因的1 783～2 563 位序列和 mrp 基因的1 801～2 513位序列, 分别构建原核表达载体 pET32a-epf、pET32a-mrp, 确定诱导表达的2种蛋白都具有免疫原性后, 用融合蛋白 MRP-EPF 免疫新西兰兔, 以最小致死量猪链球菌强毒株 (SS2-1) 攻击, 兔的存活率达 50%, 明显高于单个表达产物, 证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原。猪链球菌 2 型溶菌酶释放蛋白和马链球菌兽疫亚种的类M蛋白同属于溶菌酶释放蛋白超家族成员, 而且2种溶菌酶释放蛋白的结构相似;因此, 将以上 2 种基因融合并高效串联表达, 研制了二联重组亚单位疫苗。对于链球菌的基因工程疫苗我国一直都在研发之中, 迄今为止, 还没有正式生产的猪链球菌 2 型基因工程疫苗, 大量的试验研究工作仍在进行中。

5 结语

猪链球菌2型 篇2

关键词：猪链球菌；菌种；致病血清型；多重PCR；检测方法

中图分类号：S852.61 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0212-02

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种危害公共安全和现代养猪业的人兽共患病原体，有致从业人员感染的危险，猪链球菌病几乎危及所有规模化养猪国家^[1]。猪链球菌血清型众多，其中猪链球菌2型（SS2）对猪的致病性最强，流行亦最广；此外，猪链球菌 7型（SS7）和猪链球菌9型（SS9）等也是引起猪感染发病的重要血清型。谷氨酸脱氢酶（GDH）是细菌的一种十分重要的功能蛋白，其基因保守性高，点突变率极低，是病原体种属鉴定的重要诊断性抗原。Okwumabua等根据gdh基因设计猪链球菌种特异性引物，通过对306株链球菌的检测发现，目前发现的35个猪链球菌血清型中均检测出了gdh基因，而化脓链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、链球菌兽疫亚种、马链球菌均未检测出gdh基因，因此，gdh通常作为猪链球菌的一种重要检测抗原^[2]。荚膜多糖（CPS）是区分猪链球菌血清型的重要依据之一^[3]。SS2 cps2J基因仅可以与2型和1/2血清型产生杂交，显示cps2J基因为SS2的特异性基因可以作为鉴定SS2 的依据。根据SS7型、SS9型基因与其他血清型的同源性比对，选择同源性低的阅读框基因作为检测基因。本试验以我国及山东等地SS血清型流行病学调查为参考，借鉴已发表的SS gdh基因作为种特异性引物，筛选2、7、9型cps特异性基因作为检测引物，在建立单项PCR的基础上优化反应体系和反应条件，建立特异性的多重PCR检测方法，可在诊断猪链球菌的同时进行主要致病血清型的分型。并利用本研究建立的多重PCR检测方法系统地对鲁西区域SS的流行状况进行了调查与分型研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源 标准菌株HA9801（SS2）、8074（SS7）、2083（SS9）基因组DNA由南京农业大学陆承平教授惠赠。49株分离株来源于鲁西各大养猪场^[4]，马链球菌兽医亚种、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌由聊城市畜禽疫病检测重点实验室、聊城市畜禽疫病诊疗工程技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 Ex-Taq Mix、DNA marker和蛋白酶K等主要试剂均购自宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据国内外资料的报道^[5-8]，确定gdh基因保守区域为SS 种特异性靶基因，以cps基因为型特异性靶基因，设计血清2型、7型和9型检测引物（表1），由上海Sangon生物工程公司合成。

3 讨论

Arends 等对143个屠宰猪扁桃体开展了SS2 的检测研究，结果表明，荷兰SS2的带菌率在30 %以上^[9]。Breton 等对413 份屠宰猪扁桃体开展SS的分离，结果在加拿大猪场共分离到 180 株SS（分离率为43.6 %），SS2有29 株（占SS的16.1%）^[10]。Han 等对 406 个屠宰猪扁桃体进行SS的检测研究，结果从韩国猪场共分离出猪链球菌 55 株，临床9 型最多（16.4%）^[11]。可见，SS 在各国大猪场存在隐性感染的情况比较普遍。本研究结果显示，从各采样猪场不同生长阶段临床表观症状健康猪群中均检测出SS，表明鲁西地区临床表观症状健康的猪群中存在SS隐性带菌和潜在感染的威胁。

本研究结果对猪链球菌的表观症状健康猪群及患病猪群从分离率及血清型两方面反映出鲁西地区猪链球菌的流行状况。对鲁西地区分离到的49株SS PCR检测为阳性的样品进行了血清型的分型研究，鑒定出SS2、SS7和SS9 菌株的数量分别为 17株、2株和3株。SS2菌株的阳性率占SS总分离菌株的比例为34.7%，提示SS2在该地区猪群中的带菌比例相当高。鲁西地区分离到的49株SS，其相同血清型不同菌株间的毒力因子情况及不同血清型的致病性等都有待于进一步研究。

本研究建立了猪链球菌种及3种主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法，通过特异性检测和临床应用验证，表明该多重PCR方法的敏感性高、特异性强，可作为养殖一线开展猪链球菌快速诊断和流行病学调查的重要手段。

参考文献：

[1]Staats J J，Feder I，Okwumabua O，et al. Streptococcus suis：past and present[J]. Veterinary Research Communications，1997，21（6）：381-407.

[2]Okwumabua O，Persaud J S，Reddy P G. Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8（2）：251-257.

[3]Charland N，Kobisch M，Martineau-Doizé B，et al. Role of capsular sialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcus suis capsular type 2[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，1996，14（4）：195-203.

[4]王海麗，赵德明，葛长城，等. 猪链球菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：36-39.

[5]Wisselink H J，Joosten J J，Smith H E. Multiplex PCR assays for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence-associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（8）：2922-2929.

[6]Smith H E，Veenbergen V，van der Velde J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9：development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7]Smith H E，van Bruijnsvoort L，Buijs H，et al. Rapid PCR test for Streptococcus suis serotype 7[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，178（2）：265-270.

[8]Okwumabua O，OConnor M，Shull E. A polymerase chain reaction（PCR） assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J]. FEMS Microbiology Letters，2003，218（1）：79-84.

[9]Arends J P，Hartwig N，Rudolphy M，et al. Carrier rate of Streptococcus suis capsular type 2 in palatine tonsils of slaughtered pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（5）：945-947.

[10]Breton J，Mitchell W R，Rosendal S. Streptococcus suis in slaughter pigs and abattoir workers[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，1986，50（3）：338-341.

猪链球菌2型 篇3

关键词：西藏地区,藏猪,ELISA,链球菌2型,流行病学调查

猪链球菌 ( Streptococcus suis, SS) 是一种重要的人兽共患病病原菌, 可引起严重的人兽共患传染病。 SS根据荚膜抗原分为35个血清型, 其中2型流行最广, 是致病力最强的一种[1]。1998年我国江苏首次报道了人感染SS病例, 发病25例, 死亡14例[2]。 2005年四川资阳、内江等地发生了大规模疫情, 发病204例, 死亡38例。猪链球菌病的特点是潜伏期短, 发病急, 病情凶险, 病死率高。

目前针对藏猪链球菌病的研究报道较少, 笔者于2014年从西藏6个不同地 市采集藏 猪血清标 本1 865份, 采用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 法检测藏猪链球菌2型抗体, 以期了解西藏地区不同地方临床健康藏猪携带猪链球菌2型的现状。

1材料与方法

1. 1病料

从西藏拉萨 ( 386份) 、那曲 ( 184份) 、林芝 ( 875份) 、日喀则 ( 184份) 、山南 ( 184份) 、昌都 ( 70份) 等地采集未接种过疫苗的藏猪血液1 855份, 分离血清、编号, 待检。

1. 2主要试剂及仪器

猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司; RT - 6100型酶标分析仪购自深圳雷杜生命科学有限公司; GNP - 9050型恒温培养箱购自上海三发仪器有限公司。

2方法

2. 1 ELISA 法

取抗原包被板, 先用稀释好的洗涤液洗板2次, 再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取100 μL加入到抗原包被板孔中。阴性对照和阳性对照各设2孔, 置37 ℃ 温育30 min。甩掉板孔中的溶液, 每孔加入稀释好的洗涤液200 μL, 静置3 min后倒掉, 并在吸水纸上拍干, 共计洗涤5次。每孔加羊抗猪酶标二抗100 μL, 置37 ℃ 温育30 min。 甩掉板孔中的溶液, 洗涤5次。每个反应孔先加底物液A 50 μL, 再加底物液B 50 μL, 混匀, 室温避光显色10 min。待显色完 成后每个 反应孔加 终止液50 μL, 10 min内测定结果。

2. 2结果判定

在酶标仪上测各孔OD630值, 试验成立的条件是阳性对照孔OD630值均≥0. 8; 阴性对照孔OD630值均 < 0. 3。

如果样品OD630值≥0. 35, 判为阳性; 如果样品OD630值 < 0. 35, 则判为阴性。

3结果与分析

从林芝地区6个不同地市 ( 拉萨、那曲、林芝、日喀则、山南、昌都等地) 采集未接种疫苗的藏猪血清1 865份, ELISA方法检测到871份为抗体阳性, 抗体阳性率为47% 。其中昌都地区藏猪链球菌抗体阳性率高达93% , 拉萨市藏猪链球菌抗体阳性率为61% , 其他分别为日喀则、那曲、林芝、山南, 抗体阳性率分别为52% 、43% 、39% 和34% , 见表1、图1。

3讨论

猪链球菌是目前主要的继发感染病原菌, 也是一种人兽共患病病原菌, 该病的发生与流行不仅严重危害我国养猪业[3], 而且严重威胁人的生命安全。目前在西藏针对猪链球菌病的流行病学调研报道较少, 笔者从西藏6个不同地市采集的未接种疫苗的藏猪血清1 865份, 应用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 方法检测藏猪链球菌2型抗体, 结果有871份为抗体阳性, 总抗体阳性率为47% 。其中昌都地区抗体阳性率高达93% 。这表明不同地区链球菌危害程度不同。 因此应该引起人们足够的重视。

本次调查发现西藏有些地区猪链球菌阳性率明显高于同期调查的其他地方, 这可能跟当地猪场饲养管理、引种以及地势有一定的关系, 需要进一步研究。 因此, 在猪链球菌病的防控中, 应当加强对该病的引种检疫以及饲养密度的管理, 避免或减少引入该病。 另外由于缺少以往在西藏有关链球菌病的调查资料, 无法分析该病在西藏地区的流行规律变化。

综上可见, 对于检测临床健康猪群猪链球菌的携带情况及其对各种抗生素的耐药情况, 为更好地监控猪链球菌耐药性、防治猪链球菌病以及有效防控猪链球菌的暴发具有重要价值。而流行病学调查研究又是制定传染病防控措施的重要依据, 今后还需大范围调研。

参考文献

[1]何永聚, 祝令伟, 冯书章.猪链球菌2型毒力相关因子及保护性抗原研究进展[J].中国人兽共患病学报, 2012, 28 (1) :66-68.

[2]沈健, 孙建中, 尤玉民, 等.一起人-猪链球菌感染性综合征暴发的流行病学调查[J].中华流行病学杂志, 2001, 22 (2) :154-155.

一例猪脑炎型链球菌病的诊治 篇4

1 临床症状

发病猪主要为脑膜炎症状, 一般出现突然发病, 四肢行动失调、盲目转圈、空嚼、磨牙、尖叫、倒地不起、四肢抽搐、肌肉震颤、两耳直竖、头往后仰等神经症状, 后躯麻痹继而倒地不起, 四肢做划水状;体温升高至40℃~42℃, 食欲废绝, 排球状粪便, 鼻孔有浆性鼻汁流出;临死时温度下降, 昏睡至死。有的病猪关节出现不同程度的肿胀。

2 病理变化

对病死猪进行剖检, 主要见脑膜充血, 出血, 脑切面有针尖状出血点, 脑脊液浑浊, 脑实质有化脓性脑炎病变。腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结肿大出血。关节肿胀部位有黄白色分泌物。

3 实验室检验

取病死猪的脾、脑组织进行涂片, 可见成链状排列 (长短不一) 或单个圆形或椭圆形的革兰氏阳性球菌。根据发病猪的年龄、发病原因和临床症状、病理变化以及实验室检验结果, 可以诊断此病为链球菌病。

4 治疗

治疗脑膜炎型链球菌病时宜抓紧时间, 越早治愈率越高, 选用药物时要慎重和适当提高剂量。宜选用能通过血脑屏障、对革兰氏阳性菌敏感、能治疗全身感染的药物, 如磺胺类、青霉素类。还配合一个很重要的药物—地塞米松, 虽然它不能根本治疗, 但是当它和足量的抗生素如阿莫西林合用时, 能减少机体因毒素而引起的过敏反应, 恢复血脑屏障、脱水、利尿及恢复中枢神经系统功能, 对脑水肿有治疗意义, 尤其在猪只生命濒危期使用。采用的治疗方案为:一边颈部肌肉注射复方磺胺嘧啶注射液 (首次用量加倍) ;另一边颈部肌肉注射阿莫西林粉针和地塞米松, (注意:磺胺类药和青霉素类药不能混合用, 两者混合会有酸碱中和反应, 致使药物失效) 。对发烧严重的猪只配合用清开灵注射液和安痛定;同时给病猪喂服猪用维多利, 以加速康复。

小猪特别是体重在15~25kg的多发。在本轮治疗中, 治愈了40头, 有5头因治疗时已是发病第2d起, 错过了最佳治疗时间, 因而未能治愈。治愈的这40头猪, 经第1d用药, 猪只神经症状明显好转, 情绪也基本稳定, 经3~5d用药后, 能达到基本恢复健康的状态:精神、食欲、运动等均恢复正常。

5 预防

今年以来猪脑膜炎型链球菌病发病率高, 死亡率也高。常突然发病, 一旦出现临床症状时治疗往往较为艰难, 常常未等抗菌药发挥作用, 猪已死亡。因此, 防治该病应“预防为主, 防重于治”。

5.1 加强饲养管理

注意保持营养的均衡, 尽量减少各种应激因素, 加强猪舍通风, 适当降低饲养密度, 避免过度拥挤, 增强猪群的抵抗力。

5.2 重视猪场环境清洁和消毒工作

猪舍和栏架应避免有尖锐物品存在, 以防划伤子猪皮肤而发生感染。

5.3 免疫预防猪群正确采用猪链球菌弱毒疫苗进行免疫。

5.4 药物预防

关节炎型猪链球菌病诊治实例 篇5

关键词：关节炎型,链球菌,诊治

近几年, 随着青水乡生猪饲养方式的转型, 生猪饲养从散养向小规模粗放型转变。但卫生条件差、管理落后, 一些少发的生猪疾病也开始多发。最近, 该乡发生了几例关节炎型猪链球菌病, 病变症状典型。现将该病的诊治情况报道如下。

1 发病情况

笔者诊治的2例关节型猪链球菌病分别发生于2014年4月份和5月份, 3头小猪断乳后10 d左右发病, 患猪体重20~25 kg, 同窝其他猪没有出现类似症状, 病程3~4周, 在此病例之前该乡已有其他户有散发病例。

2 临床症状

患猪体温升高 (41℃以上) , 稽留热, 出现四肢腕关节和跗关节肿大, 有的关节出现2~3个脓肿灶, 关节局部温度增高, 触摸有疼痛反应, 站立困难, 喜卧, 穿刺可抽出黏液性脓汁。严重者不能站立, 采食困难, 粪便干硬成球状, 黑灰色, 心跳加快。

3 实验室检查

3.1 显微镜检查

取患猪关节液涂片, 革兰氏染色镜检, 可见单个或短链状排列的革兰氏阳性球菌, 菌体周围有荚膜。

3.2 细菌分离培养

采集患猪关节液、关节囊肿物病料, 分别接种于普通培养基和血琼脂培养基, 在37℃恒温箱中培养, 24 h后观察菌落。该菌在普通琼脂培养基中菌落生长不良, 在血琼脂培养基中可见表面光滑、灰白色、半透明的露珠状圆形菌落, 取分离培养的细菌涂片, 革兰氏染色后镜检, 可见单个或短链状排列的革兰氏阳性球菌。

3.3 药敏试验

按常规纸片法对分离菌进行药敏试验, 结果该分离菌对头孢噻呋高敏;对链霉素、阿莫西林、林可霉素中敏;对庆大霉素、青霉素低敏。

4 诊断

根据临床症状, 结合实验室镜检结果, 确诊为链球菌病。

5 防治措施

5.1 患猪治疗

将患猪及时隔离并进行治疗, 对有关节炎的猪用头孢噻呋、链霉素进行治疗, 按每千克体重3 mg头孢噻呋钠加1 mg硫酸链霉素肌肉注射, 每天2次。对关节有脓肿的, 用链霉素加盐酸普鲁卡因周围封闭注射, 等脓肿变软、成熟后切开排除脓汁, 用0.1%高锰酸钾冲洗后涂以碘酊。经过治疗, 1周后患猪症状减轻, 可起身站立, 但仍行走困难;2周后, 症状消除, 患猪行走恢复正常。

5.2 健康猪群管理

饲料中添加清瘟败毒散饲喂健康猪, 每头猪每天25 g, 预防健康猪感染, 连用1周。待患猪痊愈后, 全场生猪注射链球菌弱毒苗。

6 体会

1) 根据笔者诊治及所见病例, 关节炎型猪链球菌病多呈散发, 主要危害1~2月龄仔猪, 少见全窝暴发, 临床上以侵害四肢关节、跛行、采食困难、高热稽留为特征, 50 kg以上大猪群未见发病。

猪圆环病毒2型培养条件优化试验 篇6

1材料与方法

1.1细胞及病毒

PK15细胞:中国兽医药品监察所

猪圆环病毒:自行分离鉴定

1.2病毒含量的测定

将病毒液用2%牛血清MEM做10倍系列稀释, 取104、105、106 3个稀释度, 每个稀释度接种96孔细胞培养板培养的PK-15细胞各5个复孔, 在37℃条件下培养, 用IFA方法进行染色, 计算TCID50

1.3病毒繁殖条件的优化

1.3.1病毒接种剂量本试验采用同步接毒法, 分别按1%、2%、3%、5%和10%剂量同步接种PK-15细胞, 同时在培养液中添加3mmol/L D-氨基葡萄糖, 置于37℃培养, 144h后收毒, 将收获的病毒液反复冻融3次, 3000r/min, 离心10min, 取上清液, 测定毒价, 确定最佳接毒剂量。

1.3.2 D-氨基葡萄糖浓度的确定本试验按5%剂量同步接种PK-15细胞, 分别添加终浓度为0、0.5mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、6mmol/L、8mmol/L的D-氨基葡萄糖, 置于37℃培养, 144h后收毒, 将收获的病毒液反复冻融3次, 3000r/min, 离心10min, 取上清液, 测定毒价, 确定D-氨基葡萄糖的最佳浓度。

1.3.3病毒的最佳收毒时间的确定按5%剂量同步接种PK-15细胞, 培养液中加入终浓度为3%的D-氨基葡萄糖, 置于37℃培养, 分别于0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h收获病毒液, 反复冻融3次, 3000r/min, 离心10min, 取上清液, 测定毒价, 确定病毒的最佳收获时间。

2结果

2.1病毒接种剂量

由表1可以看出, 病毒接种剂量在1%~5%时, 随着接种剂量的增加, 病毒的毒价也增加, 当病毒接种剂量达到5%时, 病毒含量为106.6 TCID50/m L。当病毒接种量达到10%时, 病毒含量只为106.0TCID50/m L。由此可见, 确定以5%毒种剂量接种细胞繁殖病毒。

2.2 D-氨基葡萄糖浓度的确定

由表2可以看出, D-氨基葡萄糖浓度在0~3mmol/L时, 病毒的毒价随着D-氨基葡萄糖浓度的升高而升高, 当D-氨基葡萄糖浓度超过3mmol/L时, 病毒毒价逐渐下降, 因此, 在培养液中添加3mmol/LD-氨基葡萄糖时, 最适合病毒增值。

2.3病毒的最佳收毒时间的确定

由表3可以看出, 在接种后144h收获病毒液, 病毒的毒价最高。当培养至168h时, 病毒液的毒价降至105.3TCID50/m L。因此, 最佳收获时间确定为144h。

3讨论

某猪场猪2型圆环病毒感染的诊断 篇7

1 材料与方法

1.1 病料

解剖疑似PMWS病死猪, 采集肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结等组织作为病料。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据已发表的PCV2的ORF2序列, 设计合成了一对检测引物, 产物长度为265 bp。

上游引物:5'-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3'

下游引物:5'-CCGCACCTTCGGATATACTG-3'

引物由上海生工生物技术有限公司合成。使用前溶于超纯水中, 稀释至100μmol/L, 工作浓度为20 pmol/L, -20℃保存。

1.2.2 病毒DNA的提取

取1 g病料组织, 放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次, 使细胞充分破碎, 制成悬浮液, 反复冻融3次。4℃6 000 r/min离心15 min取上清, 加入蛋白酶K至终浓度150 mg/L, SDS至终浓度0.5 g/L, 50℃水浴消化3 h。加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) , 混匀, 4℃12 000 r/min离心10 min, 小心吸取上清, 再用等体积酚∶氯仿∶异戊醇提取液提取1次, 直至中间蛋白层清亮。吸取上层水相加入1/10体积3 mol/L NaAC及2倍体积的无水乙醇, -20℃沉淀过夜。4℃12 000 r/min离心10 min, 再用70%乙醇洗涤沉淀2次, 弃上清液, 超净台内吹干, 将沉淀溶解于pH 8.0 TE缓冲液中。

1.2.3 PCV2 ORF2基因片段的PCR扩增

建立25μl反应体系:10×PCR Buffer 2.5μl, dNTP Mixture 2μl, 上、下游引物各0.5μl, 上述提取的DNA模板4μl, Taq酶0.15μl, 加超纯水至25μl。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min;52℃退火1 min;72℃延伸1 min, 30个循环;72℃延伸7 min。PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 临床症状

患病猪临床表现为精神沉郁, 食欲减退, 体温40℃左右, 生长发育不良, 渐进性消瘦, 被毛粗糙, 肌肉萎缩, 皮肤与可视黏膜中度苍白。大部分病猪表现呼吸困难、咳嗽等呼吸症状, 有些有腹泻症状, 体表淋巴结特别是腹股沟淋巴结肿大。

2.2 病理变化

剖检可见全身淋巴结肿大出血, 切面硬度增加, 尤其是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、支气管淋巴结及颌下淋巴结。肺脏肿胀, 呈弥散性、间质性病变, 有的硬如橡皮, 严重出血病例整个肺呈紫褐色。肝脏有不同程度的萎缩, 严重病例肝小叶结缔组织增生明显, 有的可见肝硬化。脾脏肿大, 切面呈肉样变化。肾脏水肿, 呈灰白色, 有的肾表面有大小不等的出血点。回肠和结肠段肠壁变薄, 盲肠和结肠黏膜充血和出血。

2.3 PCR扩增结果

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。结果表明, 利用PCR方法扩增出了265 bp的目的片段, 与预期片段大小相符, 见图1。

3 小结

猪2型圆环病毒病是目前严重威胁养猪业发展的一种病毒性传染病, 发病仔猪以呼吸道症状为主, 由于PCV2感染所引起的各类疾病的临床症状和病理变化并不典型, 因此使该病的临床确诊十分困难, 所以最好借助实验室手段来进行最后的确诊。PCR是一种快速、简便、特异和易于操作的方法, 得到了广泛的应用, 在PCV2诊断方面也取得了巨大的进步。本次发病在临床初步确诊的基础上, 采用PCR方法进行了实验室诊断, 最终确诊为猪2型圆环病毒感染。

目前, 还没有完全有效的疫苗可以预防PCV2的感染。PCV2损害患畜免疫器官, 使机体抵抗能力下降, 易继发附红细胞体、放线菌杆菌、支原体、链球菌等, 所以使用单一疫苗免疫很难奏效。及时有效的做好其他常见疫病的免疫接种, 如猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病等, 可以提高猪群的免疫水平, 增强机体对PCV2的抵抗力。

云南省猪圆环病毒2型感染状况调查 篇8

1 材料与方法

1.1 待检血清

2007年7月份—2008年6月份, 采集云南省部分区县猪场不同时期和不同生长阶段的未经PCV-2疫苗免疫猪群的血样381份, 分离血清, 置于-20 ℃冰柜中保存, 备用。

1.2 主要试剂及仪器

猪圆环病毒IgG抗体快速检测试剂盒, 购自深圳市绿诗源生物技术有限公司;ELX800型酶标仪, 美国Biotek Instrument Inc公司产品。

1.3 PCV-2抗体的间接ELISA血清学检测

使用方法及检测结果观察按照试剂盒说明书进行。

1.4 结果判定

以空白孔调零, 在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.6, 阴性对照孔平均OD630值小于0.2。样品OD630值大于0.42判为阳性;样品OD630值在0.38～0.42之间判为可疑;样品OD630值小于0.38判为阴性。

2 结果 (见表1)

共检血清样本381份, 其中阳性血清158份, 总阳性率为 41.5 %。哺乳仔猪的PCV-2抗体阳性率在不同类型猪中最高, 为45.8 %, 所检测的9个地区中PCV-2抗体阳性率最高的为52.6%。用SAS进行统计分析, 结果表明, 不同地区之间猪群PCV-2抗体阳性率无显著差异 (P>0.05) ;以时期、地区、猪类型为3个因素, 分析其对PCV-2抗体阳性率的影响, 结果表明, 时期、地区2个因素对PCV-2抗体阳性率无显著影响, 而不同类型猪对阳性率有显著影响。泌乳仔猪和后备母猪的PCV-2抗体阳性率差异显著 (无互作三因素方差分析) 。

3 讨论

(1) PCV-2和与其相关的猪病已在全世界范围内发生和流行, 给养猪业造成了严重的影响。欧阳素贞等[3]报道在豫北地区4个城市的多个猪场不同日龄猪群中的总阳性率为40.6%。宋建国等[4]对甘肃省酒泉、张掖、武威、兰州、临夏、白银、定西七市 (州) 及青海省大同地区进行了PCV-2感染血清学调查, 发现PCV-2抗体阳性率为58.45%。本试验结果表明, 云南省各地区猪群PCV-2 的感染分布仍较广, 且抗体阳性率也处于较高水平。

(2) Junghyun K等[5]对PCV-2感染的季节变化进行2年的回顾性研究发现, 每个月均有PMWS病病例的发生, 但高峰期出现在4— 6月份。而赵茂荣等[6]的研究表明, 冬、春、夏、秋四季PCV-2抗体的阳性率依次递减。本研究结果与之不完全相同, 不同时期感染调查结果显示:除断奶仔猪2007年下半年PCV-2 抗体阳性率比2008年上半年的略低外, 其他生长阶段猪群的2007年下半年PCV-2抗体阳性率均高于2008年上半年。这可能与云南省气候类型丰富多样和复杂的地理环境有关, 也可能与本次试验取样的猪场的饲养管理条件不同有关。

(3) 有研究表明, 在同一群体内, 猪的年龄越大, PCV-2抗体阳性率越高[7], 本次的调查结果与以上结论稍有不同。本试验结果显示, 哺乳仔猪的PCV-2抗体阳性率 (45.8%) 高于断奶仔猪的PCV-2抗体阳性率 (41.6%) , 而断奶仔猪的PCV-2抗体阳性率又高于育肥猪的抗体阳性率 (39.7%) 。这种差异可能与母源抗体的水平有关。Allan G M等[8]发现, PCV-2在猪群中既存在水平传播也存在垂直传播, 即哺乳仔猪可以从母体获得抗体。本次调查中各采样区县经产母猪的PCV-2抗体水平都较高 (44.0%) , 经过垂直传播后哺乳仔猪的血清抗体阳性率也较高;随着母源抗体的逐渐减少甚至消失, 育肥猪表现出较低的PCV-2抗体阳性率。本次试验所出现的这种猪年龄与PCV-2抗体阳性率的不同, 与垂直传播有关还是与取样个体及样本数量有关, 还需要进一步证实。

摘要：为了解云南省猪圆环病毒2型 (PCV-2) 的感染状况, 试验采用间接ELISA方法对从云南省部分规模化猪场采集的未经PCV-2疫苗免疫的猪只血样进行抗体阳性率检测。结果表明:所有被检猪场均存在PCV-2感染, PCV-2抗体总阳性率为41.5%。哺乳仔猪PCV-2抗体阳性率最高, 为45.8%;后备母猪最低, 为35.7%。表明云南省规模化猪群中存在较为严重的PCV-2感染和流行。

关键词：云南省,猪圆环病毒2型,流行病学调查,ELISA

参考文献

[1]MEEHANB M, MCNEILLY F, TODD D, et al.Characterization ofnovel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs[J].Journal of General Virology, 1998, 79:2171-2179.

[2]OPRIESSNIG T, THACKER E L, YUS, et al.Experimental repro-duction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs bydual-infection withMycoplasma hyopneumoniaeand Porcine circo-virus type 2[J].Vet Pathol, 2004, 41:624-640.

[3]欧阳素贞, 张福良, 王双山.豫北地区猪圆环病毒2型感染的血清学调查[J].安徽农业科学, 2008, 36 (4) :1451-1452.

[4]宋建国, 高生智, 魏润生.规模化猪场猪圆环病毒2型 (PCV2) 的血清学调查[J].中国兽医科技, 2004, 34 (12) :26-28.

[5]JUNGHYUN K, HAN-KOOK C, TAEWON J, et al.Postweaningmultisystemic wasting syndrome of pigs in Korea:prevalence, micro-scopic lesions and coexisting microorganisms[J].J Vet Med Sci, 2002, 64 (1) :57-62.

[6]赵茂荣, 杨汉春, 郭鑫, 等.北京地区规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查与分析[J].中国兽医杂志, 2007, 43 (12) :85-86.

[7]TISCHER I, BODE I, PETERS D, et al.Distribution of antibodies toPorcine circovirus in swine population of different breeding farms[J].Archives of Virology, 1995, 140 (4) :737-743.