分子分型（精选六篇）
分子分型 篇1
资料与方法
2011年1月-2013年12月收治确诊为乳腺浸润性导管癌、术前未行新辅助化疗、内分泌治疗或放疗及免疫组化指标ER、PR、HER-2和Ki-67完整的患者119例。
检测试剂与质量控制:所有免疫组化试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ER与PR选择阳性表达为3+的乳腺癌作为阳性对照组织, 以自身正常乳腺区域做阴性对照。由专人负责技术工作, 采用全封闭自动化监测系统。结果判读均有专职病理医师进行, 染色结果由染色强度及阳性细胞百分比组成。
病例分组:根据St.Gallen会议共识标准, 依据免疫组化ER、PR、HER-2和Ki-67表达的情况将119例乳腺浸润性导管癌病例划分分子亚型, 其中Ki-67的表达因实际工作情况, 依据St Gallen会议专家建议定为以20%为界, 定义为低表达[3]。 (1) 免疫组化结果判定标准:根据染色强度、阳性细胞数和两者计分的乘积进行判断, 分为阴性、弱阳性、中强阳性、强阳性。阳性细胞数<10%0分, 阳性细胞数10%~25%1分, 阳性细胞数26%~50%2分, 阳性细胞数51%~75%3分, 阳性细胞数>75%4分。 (2) 阳性细胞的着色强度:淡黄色1分, 黄色2分, 棕黄色3分。两计分相乘, 0分为阴性, 1~4分弱阳性, 5~8分中度阳性, 9~12分强阳性。St.Gallen具体分子分型标准定义及预后, 见表1。
统计学方法:采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析, 计量资料符合正态分布采用 (±s) 表示, 非正态分布采用中位值表表示, 计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
结果
乳腺浸润性导管癌分子亚型分布情况:在119例乳腺浸润性导管癌中, Luminal A型11例 (9.2%) ;Luminal B型70例 (58.8%) , 其中HER-2阴性23例 (19.3%) , HER-2阳性47例 (39.5%) ;HER-2过表达型19例 (16.0%) ;三阴性 (导管) 19例 (16.0%) 。与以往分型相比Luminal A型比例明显减少, Luminal B型因有Ki-67高表达增加HER-2阴性型, 比例最大, 占总数50%以上。
各亚型临床分布特点:发病年龄:本研究显示乳腺浸润性导管癌患者发病年龄23~81岁, 平均53岁, 发病年龄集中在38~73岁 (80%) 。Luminal A型平均年龄53岁, 多数位于42~63岁。Luminal B (HER-2阴性) 型发病平均年龄56岁, 多数位于43~75岁, Luminal B (HER-2阳性) 型发病平均年龄52岁, 主要位于42~60岁。HER-2过表达型平均年龄53岁, 多数集中于46~57岁。三阴性 (导管) 型平均年龄52岁, 主要位于43~60岁。将年龄分为5组经统计分析, 各分子亚型组年龄差异无统计学意义 (P=0.95, >0.05) , 见表2。
发病民族:119例乳腺浸润性导管癌病例中除有2例外籍人士外, 含汉族56例、维族42例、哈萨克族10例、回族8例、蒙古族1例。其中维族、汉族与分子亚型的关系见表3, 42例维族、56例汉族与各分子亚型间差异有统计学意义 (P=0.026, <0.05) 。
临床病理特征与分子亚型的关系:结果显示, 肿瘤大小 (P=0.003) 、组织学分级 (P<0.01) 与分子各亚型组间差异具有显著统计学意义, 年龄 (P=0.72) 、淋巴结转移 (P=0.97) 与分子各亚型组间差异无统计学意义。进一步分析显示, Luminal B型中HER-2 (-) 与HER-2 (+) 亚型之间, 与各临床亚型间差异无统计学意义, 见表3。
讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤, 随着对其认识的深入其诊治水平不断提高。目前认为仅病理组织学分类已远不能满足从本质认识该病这一要求, 亦不能适应多种治疗手段的发展。传统的影响乳腺癌预后的因素, 如肿瘤大小、组织病理学分级、淋巴结转移情况等不能对乳腺癌的不同生物学行为做出全面的判断。随着分子生物学技术的发展, 越来越多的研究证实乳腺癌预后与很多分子标志物密切相关, 这其中就包括ER、PR、HER-2和Ki-67等, 它们不仅能更准确的反映肿瘤的生物学行为、判断患者的预后, 还能够预测肿瘤对治疗的敏感度, 为肿瘤的个体化治疗提供依据。早在2000年, Perou及Serlie等就根据ER、PR、HER-2等不同基因表型将乳腺癌分为临床预后截然不同的亚群[4], 分别Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性、basal-like型 (即Triple Negative型) 及normal breast like型。Calza等分析412例乳腺癌患者得出相似的结论[5]。2004年Nielsen等率先证实在蛋白质水平对乳腺癌进行分型的可能性[6]。Carey等对496例乳腺癌患者通过免疫组织化学方法将蛋白水平分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性及basal-like型, 用以判断患者预后及指导治疗选择[7]。
基于对乳腺癌生物学亚型的认识的深入, 2011年第12届St.Gallen国际乳腺癌研讨会专家组成员采用了按照乳腺癌分类来进行治疗决策的新方法。为方便临床运用, 可根据临床病理, 而不是基因分析结果来进行亚型分类。一般情况下, 亚型分类完成后才能决定全身治疗策略。本研究利用免疫组织化学检测ER、PR、HER-2和Ki-67的表达并依据会议共识对乳腺浸润性导管癌进行分子分型。结果显示与以往分型方法相比Luminal A型比例明显减少, Luminal B型因增加HER-2阴性型变化最为明显, 比例明显升高, 占总数58.8%, 其余HER-2过表达型及三阴 (导管) 型比例均16%, 与以往分型方法无明显改变。而以已往分型方法, 国内李庆霞等对100例乳腺浸润性导管癌研究Luminal A所占比例最高[8], 达65%, 然后依次为Triple Negative型17%、HER-2阳性型11%、Luminal B型7%。也从另一个角度说明在乳腺浸润性导管癌中, 按照St.Gallen会议分型方法, 大部分患者不被认可为预后良好, 治疗上单用内分泌治疗不能满足绝大多数患者需求, 需根据实际需要选择适量细胞毒性化疗药物, 尤其是曾经可归为Luminal A型的Luminal B (HER-2阴性) 型的患者。
有关分子分型对于中国乳腺浸润性导管癌患者的临床意义的研究鲜有文献报道, 本研究显示乳腺浸润性导管癌患者发病年龄主要集中在38~73岁, 发病年龄平均53岁。各分子亚型组间无明显年龄差异 (P=0.95, >0.05) 。其中42例维族、56例汉族与分子亚型关系P<0.05, 差异有统计学意义, 与成芳等的研究结论一致[9]。其临床病理特征中肿瘤大小 (P=0.003) 、组织学分级 (P<0.01) 与分子各亚型组间差异具有显著统计学意义, 本研究病理组织学分级中, 3级中三阴性型所占比例最高达30.9%, 而HER-2过表达型与三阴性型在组织学分级3级中占52.6%, 高达50%以上, Luminal B型在组织学分级1~2级中高达71.9%;在肿瘤大小方面, Luminal B型患者肿瘤直径≤2 cm者所占比例高达77.3%, 而HER-2过表达型与三阴性型在肿瘤直径>2 cm者中所占比例高达44%, 三阴性型在肿瘤大小>2 cm中占22.7%;对淋巴结转移阳性组4型的分析显示, Luminal B型在有腋窝淋巴结转移中构成比高达60%, 明显高于其他3型。虽然差异较明显, 但统计分析显示差异无统计学意义 (P>0.05) , 在淋巴结转移方面, 本结果与国内张慧明等研究结果基本一致[10]。进一步分析中显示Luminal B型中HER-2 (-) 与HER-2 (+) 亚型之间, 与各临床亚型间差异无统计学意义。
综合以上分析, 119例样本中, Luminal B型所占比例最大, 说明Luminal B型因新增加HER-2阴性型变化较大, 共计70例, 比例高达58.8%。据研究在多基因分析中Ki-67检测预示较高增殖的基因是不良预后的标志物, Luminal B型中HER-2阴性型大部分患者需要依据激素受体的表达情况、所掌握的复发风险以及意愿选择细胞毒性化疗药物与内分泌治疗, 只有少数可单用内分泌治疗。而HER-2过表达型与三阴性 (导管) 型均需进行化疗。本研究表明, 依据免疫组化ER、PR、HER-2和Ki-67表达不同状态从蛋白水平对乳腺浸润性导管癌进行的分子分型与其临床特征关系密切, 能够反映其生物学行为, 有利于评判预后及制定个体化治疗策略。
摘要：目的:探讨乳腺浸润性导管癌 (Invasive Ductal Carcinoma of Breast) 最新分子分型与其临床病理特征的关系。方法:通过免疫组化及临床病理资料回顾性分析119例乳腺浸润性导管癌患者, 并结合文献探讨分子亚型与临床特征的关系。结果:1119例乳腺浸润性导管癌中, 年龄2381岁, 平均53岁。以Luminal B型最多见[70例 (58.8%) ], Luminal A型较以往分型方法比例降低[11例 (9.2%) ]。2各分子亚型在不同年龄组的分布上差异无明显统计学意义 (P=0.95, >0.05) ;42例维族、56例汉族与各分子亚型间差异有统计学意义 (P=0.026, <0.05) 。3临床病理特征中肿瘤大小 (P=0.003) 、组织学分级 (P<0.01) 与分子各亚型组间差异具有显著统计学意义, 年龄及淋巴结转移与分子各亚型组间差异无统计学意义 (P>0.05) ;进一步分析显示, Luminal B型中HER-2 (-) 和HER-2 (+) 亚型之间与各临床病理特征差异均无统计学意义 (P>0.05) 。结论:乳腺浸润性导管癌分子亚型与肿瘤大小、组织学分级分布差异具有统计学意义, 各分子亚型与其临床特征关系密切。Luminal B (HER-2阴性型) 因Ki-67高表达, 提示预后较差。
关键词：乳腺癌,乳腺浸润性导管癌,分子分型,临床病理
参考文献
[1]Jemal A, Siegel R Xu J, et al.Cancer statisistics, 2010[J].CA Cancer.J Clin, 2010, 60 (5) :277-300.
[2]张少华, 江泽飞.2011年St.Gallen国际乳腺癌治疗专家共识相关问题解读[J].中国实用外科杂志, 2011 (10) :918-919.
[3]王新昭, 左文述, 刘琪, 等.2013年St Gallen乳腺癌会议国际专家共识荟萃[J].中华肿瘤防治杂志, 2013, 20 (23) .
[4]Perou CM, Serlie T, Eisen MB, et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature, 2000, 406 (6797) :747-52.
[5]Calza S, Hall P, Auer G, et al.Intrinsic molecular signature of breast cancer in a population-based cohort of 412 patients[J].Breast Cancer Pes, 2006, 8 (4) :34.
[6]Nielsen TO, Hsu FD, Jensen K, et al.Immunhistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of imvasive breast cancer[J].Clin Cancer Res, 2004, 10 (16) :5367-74
[7]Carey LA, Perou CM, Livasy CA, et al.Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study[J].JAMA, 2006, 295 (21) :2492-502.
[8]李庆霞, 邢雅军, 赵静, 等.乳腺浸润性导管癌分子分型与临床特征的关系[J].肿瘤防治研究, 2013, (4) :6.
[9]成芳, 张茜, 刘卫华, 等.新疆2019例汉族、维吾尔族乳腺癌临床病理资料分析[J].肿瘤防治研究, 2010, (11) :1312-1314.
分子分型 篇2
1 材料与方法
1.1 细菌菌株
广州市1999~2005年共96株O1群和O139群霍乱弧菌代表株纳入本研究中, 这些菌株采自多次霍乱散发和暴发事件涉及的人群中, 另外还有外环境监测 (包括水体和水产品) 中分离的霍乱弧菌。来自Pulse Net China的PFGE分子量标准株Salmonella serovar Braenderup H9812用于每次PFGE的研究与分析中。
1.2 仪器和试剂
CHER Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System、GEL DOC 2000凝胶成像仪、CHEF Disposable Plug Mold、Screened Plug Cap均为BIO-RAD公司产品, PTC-220 PCR仪为MJ Reseach公司产品;限制性内切酶Not I和Xba I为NEB公司产品, Protease K为Merck公司产品, PFGE电泳中使用的Sea Kem Gold琼脂糖购自FMC公司, Na-laurylsarcosine购自Sigma公司。
1.3 致病相关基因的多重PCR检测
对4种致病毒力基因ace、tcp A、ctx A、zot采用多重PCR进行检测分析, 上海生工负责合成毒力基因的引物, 这4种致病毒力基因的引物序列、产物分子量等信息, DNA模板的粗提与制备均参照文献方法进行[1、2]。
多重PCR检测中, 设定并采用20μL的体系, 反应使用相应的PCR扩增缓冲液、Taq DNA聚合酶, d NTP混合物、Mg2+等、引物的使用浓度是10μM、最后加1.0μL DNA template。扩增反应的参数设置如下:94℃预变性3分钟, 94℃60秒、60℃60秒、72℃60秒, 反应反复进行30次, 最后于72℃extension 10分钟, 采用1%Agarose gel analysis对约10μL PCR产物进行电泳检测, 用Alpha Imager TM凝胶照相仪采集图像。
1.4 脉冲场凝胶电泳检测
按照Pulse Net USA的霍乱弧菌脉冲场凝胶电泳Molecular subtyping的快速Protocol[3], 进行检测分析。
1.4.1 制备菌株包埋琼脂小块
霍乱弧菌进行分纯后接种到APW中, 并于37℃振荡培养过夜, 用悬浮液体制备菌悬液, 在灭菌的1.5 m L Ep管中注入预温的菌液 (温度为37℃) , 蛋白酶K后进行混匀, 使其终浓度达到0.5 mg/m L, 然后加入56℃预热的1%PFGE级胶, 注入模具中, 于室温使其冷却成凝固态的胶。
1.4.2 胶块的处理和酶切
用Na-laurylsarcosine配制菌株裂解液, 加入Protease K, 用小铲子将胶从模具转到装有5m L裂解液/Protease K的50m L管里, 在54℃水浴摇床上振摇2个小时。采用预热的无菌纯水将胶块洗涤两次, 以TE缓冲液将胶块洗4回。在每个1.5m L离心管中加入100μL不含酶的缓冲液, 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5m L eppendorf管中, 于37℃水浴中孵育10~15min。然后每管更换为100μL酶切混合液, 霍乱弧菌用Not I酶切, 沙门菌H9812用Xba I酶切, 在37℃水浴中放置4小时以上。1.4.3电泳和数据分析将限制性酶切作用的胶转到粘在每个梳子齿, 在第1和第15齿上放置菌株H9812的裂解胶, 再制胶。将电泳缓冲液的制冷温度设定到14摄氏度, 调节CHEF MAPPER的参数如下:Program 1:2~10秒、13小时;Program 2:20~25秒, 6小时, 120度角。然后用溴化乙淀溶液染胶, 经脱色处理后, 用Gel Doc 2000采集图像, 采用软件对采集的图像做聚类处理和分析。
2 结果
2.1 菌株表型特征
本研究使用的霍乱弧菌为1999-2005年96株代表性霍乱菌株, 其中有42株分离自病例, 9株分离自无症状带菌者, 45株分离自珠江水和水产品等外环境, 主要为O1群和O139群霍乱弧菌, 只有1株2004年从一临床病人分离的O13群霍乱弧菌和1株2005年外环境分离的O22群霍乱弧菌为非O1非O139霍乱弧菌。未分离到O1群古典生物型霍乱菌株。96株霍乱弧菌中, 4株分离自国外输入病人 (具泰国旅游史) , 有5株为省外输入病例分离株 (稻叶型和O139群霍乱弧菌) 。96株菌株中, 56株为稻叶霍乱菌株, 24株为小川型, 14株为O139群。 (表1)
2.2 致病基因的多重PCR检测数据
本研究中采用多重PCR检测1999-2005年本地96株霍乱代表株的致病相关基因, 存在3种基因型, 包括A、B和C三型, 基因特征分别为ctx A+tcp A+ace+zot+、ctx A-tcp A-ace+zot+、ctx A-tcp A-acezot-, 除表1中所列的以外, 临床分离的霍乱弧菌为A型, 而环境分离的霍乱弧菌则多属于C型。6株从环境获得的霍乱弧菌是A型, 8株环境株为B型, 6株临床分离菌株为C型, 发现有病例具有典型临床症状却不携带ctx A等基因。
2.3 PFGE分型结果
对96株霍乱弧菌采用Not I进行酶切后, 得到60个不同的PFGE型, 相同血清型霍乱弧菌通常聚为同一聚类群或相近的聚类群中, 但也有少数不同血清型菌株具有相同PFGE图谱 (相似性系数为100%) , 或聚在同一聚类群或相近聚类群中。13株O139群霍乱弧菌被分为11个PFGE型;24株小川型霍乱弧菌分成13个PFGE型;56株稻叶型霍乱弧菌分为35个PFGE型。其中21和48型为主要型别, 分别有9株稻叶型和小川型菌株属于这一型别, 其次为22型, 有7株稻叶型菌株属于这一型别。2003-2005年的菌株主要集中在5型到26型, 带菌者主要集中在6、26和38型, 输入病例分离株主要集中在6、31、38、39、44~46型。病人稻叶型分离株相互间的相似性系数均在90%以上, 而环境稻叶型分离株相互间的相似性系数在81%以上。菌株的PFGE分型存在如下特征:
(1) 临床分离株与环境分离株PFGE图谱高度同源:临床分离株与外环境分离株均存在克隆型的多样性, PFGE分型显示部分感染者分离株与环境分离株PFGE克隆型型相同或相近。水产品分离株、做水产生意的散发病例分离株和暴发疫情中的感染者分离株为相同PFGE型 (27型) 或极相近的PFGE型 (5-8型) ;河涌水分离株与当地水型霍乱暴发疫情的优势菌型为相同PFGE型 (22型) ;另外, 2001年珠江水分离株与不同年份散发病例分离株具有相近PFGE型 (29-37型, 只有1-3条带的差异, 相似性系数达95%以上) , 都显示感染者分离株与环境分离株的高度同源性。
(2) 高度同源的PFGE克隆型与临床症状存在关联:Bionumerics软件对PFGE图谱的分析显示, 不同年份的本地O139群霍乱散发病例中, 临床分类为重型的病例聚为一类 (41-43型, 相差1~3条带) ;在霍乱暴发疫情中, 存在至少2种高度同源的PFGE克隆型, 优势菌株克隆型与非优势菌株克隆型只相差1~2带, 不同克隆型可引起相同的临床症状, 也可分别引起重型和轻型病例。在疫情进程中, 早期优势克隆型 (21型) 可增加或缺失1~2条带, 转变为后期高度同源的优势克隆型 (22型) , 并主要引起重型病例。有些情况下, 引起较重的临床症状的非优势克隆型菌株 (49型) , 与优势克隆型菌株 (48型) 只相差1条带, 显示高度同源性。
(3) 输入病例与某些本地病例分离株PFGE型相同或相近:本地病例稻叶型分离株与泰国霍乱疫情稻叶型输入株具有相同 (26型) 或相近PFGE型 (38-39型) , 6株代表性的泰国输入病例及带菌者稻叶型分离株中, 1病例与1带菌者分离株具有相同PFGE型 (38型, 优势克隆型) , 与38型相比, 另一带菌者分离株在320kb处缺失了1条带 (26型) , 2003年本地一病例分离株与该带菌者分离株具有相同PFGE型 (26型) ;2002年黄沙水产市场一酒楼散发病例稻叶型分离株与38型相比, 在193kb处缺失了1条带, 相似性系数为98%。从省外病例分离株来看, 2002年本地发现的贵州感染病例稻叶分离霍乱弧菌 (31型) 与2001年流行型 (29、30、32型) 只相差1-2条PFGE带;2005年一名霍乱散发病人分离的O139群霍乱弧菌与2003年T29/30次列车病例分离株都有相同PFGE型 (44型) , 而另一病例分离的O139群菌株 (47型) 则在351kb和112k各增加1条带, 在176kb处缺失了1条带。
3 讨论
为了弄清不同来源的菌株在流行病学上的联系和意义, 本研究对所有菌株的PFGE图谱都从不同的角度进行了聚类分析, 如按血清型、致病相关基因型、噬菌体-生物型、每种血清型菌株分离的年份、来源、暴发和散发事件等, 探讨临床与环境分离株的联系及不同PFGE克隆型与临床症状的关联, 确定霍乱菌株的分子流行病学特征, 为评价疫情态势提供科学、客观的依据。另外, 本研究将多重PCR致病相关基因分型与PFGE分型两种分型方法并用, 并与流行病学资料紧密结合, 探讨各种分型结果之间的关系, 并追踪菌株的来源和变迁。
从致病相关基因型和PFGE型的关系来看, 大多数具有相同致病相关基因型的菌株经Bionumerics软件分析后聚在同一聚类群或相近的聚类群中, 如致病相关基因A型菌株聚在一起, 致病相关基因C型菌株聚在一起, 但也有少数具有不同致病相关基因型的菌株聚在相同或相近的聚类群中。
不同时间从珠江水或河涌水分离到的不同致病相关基因型霍乱弧菌的PFGE型别一般不同, 即珠江水体中霍乱弧菌存在克隆来源的多态性, 多数为自然水体中不同的克隆型。在水产品中和临床分离株中也各自存在着克隆型的多样性。在霍乱溯源中, 单纯利用流行病学资料, 很难发现临床与环境来源菌株间的关联。将流行病学资料与PFGE分子证据相结合, 则有助于发现临床与环境分离株的密切联系。2001年, 在黄沙水产市场等地做水产生意的散发病例 (有水产密切接触史和可疑水产品进食史) 与一汽公司暴发病例 (进食了黄沙水产市场来源的水产品) 的稻叶型分离株具有相同PFGE型, 表明暴发和散发菌株可能源于同一PFGE克隆型, 病例均由受到相同克隆型稻叶型霍乱弧菌污染的水产品引起, 提示霍乱弧菌从受污染水产品传递给人并引起暴发和散发的流行趋势, 且共同的可疑水产品可造成同期霍乱疫情暴发和散发的发生。2005年番禺区的河涌水与当地水型霍乱暴发病例分离株具有相同PFGE型, 提示存在着病人与环境之间的相互污染, 有可能河涌水中的产毒株感染人体, 引起暴发, 也有可能病例携带的菌株造成河涌水等外环境的污染。另外, 珠江水分离株与不同年份的散发病例分离株具有相近PFGE型 (相差1~2条带) , 这种环境与临床分离株的高度同源性表明本地区外环境霍乱弧菌仍对人群造成严重威胁。
分型结果表明, 在多数霍乱暴发疫情中, 往往存在几种高度同源的克隆型, 包括优势克隆型与非优势克隆型, 不同PFGE型间只相差1~3条带, 可能是由于单一的遗传改变, 如一个点突变、插入或缺失而造成Not I酶切位点的增加、缺失或其他改变。而当不同PFGE型之间相差4~6条带时, 可能由于2个或2个以上的遗传事件导致带型的差异。相差7条带以上时, 菌株可能为不同来源[4~5]。临床分型为重型的病例具有相同PFGE型或聚为一类, 提示这类菌株与引起轻型病例菌株不同, 很可能在基因水平上具有相同的改变, 造成毒力因子增强或产生了新的毒素, 导致病情加重。有研究者曾发现, 对从重型和轻型病例分离到鼠伤寒沙门菌的鞭毛血清分型和PFGE分析表明, 分型结果与产生重型症状的能力存在关联, 在霍乱弧菌方面还未见相关报道。因此, 本研究在国内外首次发现在霍乱弧菌PFGE型与临床症状轻重之间存在关联。在霍乱流行的发展进程中, 霍乱弧菌进入人体后, 基因水平的突变会使毒力基因的表达增强或减弱, 造成临床症状的轻重。如果基因突变使毒力下降, 或者仅表现为带菌者, 这是好的方面, 但是若毒力基因表达增强, 就可能引起多个重型病人的出现, 使霍乱流行的处理变得难以控制。而Matsumoto M等虽试图研究引起死亡病例分离株与其他病例分离株在表型及分子型别间的差异, 未发现有任何联系。因此, 需要加强霍乱监测, 随时了解霍乱弧菌基因的变化, 对霍乱流行的控制很有帮助。
另外, 研究中发现, 具有典型临床表现的病人分离霍乱弧菌, 经多重PCR检测显示, 其为基因C型, 则被定为非流行株。如果病例的症状的确是分离的霍乱弧菌造成的, 则可判断霍乱弧菌分泌的其他毒素引发腹泻、呕吐等临床表征。另有8株O1群环境分离株为致病相关基因B型 (ctx A-tcp A-ace+zot+) , 为国内外少见的型别, 具有产毒潜力, 若从有毒株获得ctx基因和tcp基因, 便可获得完整的基因簇, 可能比C型菌 (ctx-tcp A-ace-zot-型) 致病潜力更大。
参考文献
[1]李孝权, 王鸣, 易鸿, 等.O139群霍乱弧菌地方分离株的分子特征研究[J].中国人兽共患病杂志, 2005, 21.
[2]Singh DV, Matte MH, Matte GR, et al.Molecular analysis of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139strains:clonal relationships between clinical and environmental isolates[J].Appl Environ Microbiol.2001, 67 (2) :910-21 (.7) :608-610.
[3]Cooper, K.L., Luey, C.K., Bird, M., Terajima, J., Nair, G.B., Kam, K.M., Arakawa, E., Safa, A., Cheung, D.T., Law, C.P., Watanabe, H., Kubota, K., Swaminathan, B.and Ribot, E.M. (2006) Development and validation of a PulseNet standardized pulsed-field gel electrophoresis protocol for subtyping of Vibrio cholerae[J].Foodborne Pathog Dis3 (1) , 51-58.
[4]李孝权, 莫自耀, 刘于飞, 等.O139群霍乱弧菌分子流行病学研究[J].中国人兽共患病学报, 2007, 23 (6) :583-86.
[5]Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol.1995, 33 (9) :2233-9.
分子分型 篇3
文献标识码:A文章编号:1001-9561 (2009) 04-0415-03
自1982年首次发现肠出血性大肠杆菌O157:H7在北美引起出血性肠炎以来, 与肠出血性大肠杆菌O157:H7病原菌相关疾病的发生率逐年上升, 尤以发达国家病例为多, 这可能与其饮食习惯和监测报告系统完善有关。大多数O157:H7肠出血性大肠杆菌的感染是食用了被牛粪污染的食物和饮水引起的, 临床症状主要表现为腹部痉挛性疼痛和出血性结肠炎。近些年已经报道过多起由肠出血性大肠杆菌O157:H7引起的暴发流行, 因儿童和老年人患者有时会在腹泻后继发诸如溶血性尿毒综合征等严重的并发症而死亡率较高。O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要血清型别, 但是其他的血清型如O111:H8, O104:H21等也能够引起人的腹泻。非O157血清型的肠出血性大肠杆菌广泛存在于我们的生活环境中, 多有在生牛肉, 猪肉, 鸡肉和奶酪等食品中被检出的报道。流行病学研究表明, 在所有的肠出血性大肠杆菌所引起的感染中, 20%~50%是由非O157血清型引起的。这些血清型的细菌也能够引起血样便和溶血性尿毒综合征, 并且在年龄幼小的患者体内发现非O157血清型的肠出血性大肠杆菌, 相对O157血清型而言有着更高的引起严重感染的危险, 因此有必要对非O157血清型的肠出血性大肠杆菌所引起的感染给予重视。比较常见的对人致病的非O157血清型包括O26:H11、O103:H22、O111:NM及O113:H21等。
肠出血性大肠杆菌的预防策略要求建立完善的预防性食品处理措施及加强对暴发的监测。地域上分散病例的流行病学之间的联系对于判明传染来源和控制疾病非常重要。暴发调查包括传统的流行病学方法和常规的实验室方法。由于人口流动性增强等客观原因, 传统的流行病学方法对于传染来源的追踪存在着很多局限。诸多分子生物学分型方法的应用, 为菌株来源的判明提供了可能。
在传统的实验室方法中, 一直采用血清学方法和噬菌体分型方法对菌株进行分型。其后, 随着新一点分型方法的引入, 质粒指纹图谱[1], 核糖体分型[2], 以聚合酶链式反应 (PCR) 为基础的分型方法, 如随机扩增多态性DNA-PCR (RAPD) [3], 扩增片段长度多态性 (AFLP) [4], 对染色体DNA酶切图谱进行分析的核酸脉冲场凝胶电泳 (PFGE) [5]及以测序为基础的多位点序列分型 (MLST) 都在肠出血性大肠杆菌检测中得到了应用。
在普通的琼脂糖凝胶电泳中, 大于一定碱基对的DNA分子会以相同的速率泳动, 称为“限制动力性”, 不能被凝胶所区分。在泳动中如果周期性地改变电场的方向, 就可以对超过限制碱基对大小的DNA分子进行区分[6]。有几种系统可以对电泳改变方向, 但是最常应用的是轮廓固定的同质电场[7]。已经有几种PFGE的商品化产品投入应用, 在凝胶中可以对小于1 000碱基对的DNA进行区分。对于酶切图谱的PFGE的阐释系统也已经建立[8]。随机扩增多态性DNA-PCR (RAPD) , 也称为AP (任意引物) -PCR, 是能够对细菌菌株进行区分的分子分型方法之一[9,10]。在这种方法中, 与引物同源的夹在反转重复序列之间的DNA片段被随机扩增[11]。由于菌株的染色体序列彼此不同, 因此电泳后扩增条带的图谱也是不同的, 这样可以对菌株进行区分。AFLPTM (扩增片段长度多态性) 技术以限制性DNA片段的选择性PCR扩增为基础, 已经在几种不同的微生物中得到了应用[12,13,14], 并且被认为是高度敏感的DNA分型方法之一。在1996年日本发生万人感染肠出血性大肠杆菌O157:H7的大流行后, 渡边治雄[15]等人应用这三种方法及噬菌体分型方法对自大阪, 和歌山和京都分离的与暴发相关联的菌株及与暴发不关联的和散发的肠出血性大肠杆菌菌株进行了分析。研究结果表明, PFGE是分离流行病学上非关联暴发和散发病例的菌株的最有力的方法。然而, 这种方法需要一天或一天以上才能得到可靠的结果。AFLP看起来可以得到与PFGE相比较的结果, 然而它需要对DNA的序列进行分析。RAPD-PCR可以快速地得到结果, 然而在对仅有极少差别菌株的区分上, 敏感性不很高。噬菌体分型是一种更为经典的方法, 但相对于PFGE而言, 也是一种敏感的方法。每一种方法都具有各自的优点和缺点, 可以根据每一个人的环境条件而加以选用。然而, 这些方法的综合应用会提高对菌株的区分能力, 并且有助于确定菌株间的相关性[14,16]。Noller[17]在对MLST的研究中发现, 虽然MLST以其易于标准化及自动化而成功地用于肺炎链球菌、沙门氏菌及脑膜炎奈瑟氏菌的分型, 但却不能够区分肠出血性大肠杆菌O157菌株, 在7个相关基因中没有发现不同, 在两个表面蛋白质基因中也只发现些微差异。
Pulse Net是在美国疾病预防控制中心倡导下成立的学术性组织, 是美国监控食品相关疾病的亚型分级网络。它由HHS/CDC、若干卫生部门及实验室于1996年组成。目标是推广标准化的病原性细菌分子分型技术, 为细菌性传染病实验室监测提供技术和方法, 以防范传染病的跨地区和国际间的传播, 有助于传染病暴发流行的调查、追踪、溯源和应对。该网络代表了病原菌监测和实验室监测应用于传染病预防控制的发展方向, 并已在一些发达国家建立起来并应用于传染病暴发流行的预警、监测和控制。Pulse Net主要功用是提供流行病学方面的食品相关病原体亚型分级。Pulse Net能识别疾病发生的潜在可能性, 尤其是那些分布广泛的病原。这在以前是不可能被发现的。目前在对肠出血性大肠杆菌的监测中, Pulse Net监测主要是采用PFGE技术。由于PFGE能够对整条染色体进行分析, 稳定性好, 分辨率高, 因而相对于其他诸多的分子分型方法而言, 近几年已作为一种肠道细菌的基础分型方法在世界范围内被广泛采用。用PFGE对肠出血性大肠杆菌进行分子分型, 建立资料库, 通过国际互联网, 在各实验室之间进行DNA图谱的快速传递与比较, 由此可以对许多地域上发生不同的病例进行流行病学上的追踪。虽然Pulsenet的成功有据可查[18], 但PFGE的数据作为连续性的片段大小的结果对于数据库的比较并不特别适合[19]。另外, 即便在应用两种核酸限制性内切酶处理后, 也通常会因为产生同样的条带而不能为密切相关的菌株提供最大限度的分辨力。因此多位点串联重复序列 (MLVA) 作为一种以串联重复序列在不同的菌株间出现的次数为基础的分型方法近年来广受关注。它在采用多种引物进行PCR后, 对扩增产物进行序列分析, 鉴别菌株间的异同, 结果比较客观, 不像PFGE基于条带的位置和数目进行判断具有主观性。目前发现二者的分辨力是一致的。MLVA是一种快速的分析多位点串联重复序列的易操作的方法, 而多位点串联重复序列是细菌的基因组快速进化的区域。MLVA包括确定多个位点的串联重复序列的数目, 因此可以对同种菌株间的基因关系的评价提供一种有力的方法。由于进化关系是在多个位点上进行估计, 这样分析的准确性很高, 且由特殊位点引起的集聚性判断的可能性就会降低[19]。另外, MLVA的输出结果非常客观, 易于对暴发快速检查的数据进行自动化计算机分析, 易于对实验室间的结果进行比较。用MLVA方法, 可以区分用其他方法不能区分的基因类型, 且从种系发生上将关系密切的菌株定义为相关菌株。
MLVA作为近年来新出现的一种分型方法, 已经在一些细菌的分型中有所应用, 如流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、炭疽杆菌、布鲁氏杆菌、结核分枝杆菌等。MLVA在国外的研究开展较多, 在国内只在结核分枝杆菌有过分型的报道。对于肠出血性大肠杆菌, 仅对O157, O55血清型有过分型的研究, 对其他的血清型尚未见相关报道。Keim[19]在对O157及O55血清型肠出血性大肠杆菌的多位点串联重复序列的研究中, 采用已发表的29种引物, 对56株细菌进行了分型的研究。结果发现位点的多态性是0.23~0.95, 等位基因的数目在2-29之间。通过与PFGE的分型结果对比发现, 两种方法的基因相似性高度相关, 且对于PFGE分型类似值近似1.0的菌株, MLVA具有更为细致的区分能力。Noller[20]在对O157肠出血性大肠杆菌的MLVA的分型研究中, 在7个位点中发现6-30个等位基因。研究结果表明, MLVA具有与PFGE相同的敏感性, 且具有更好的特异性。Lindstedt[21]对O157的MLVA进行分型, 表明MLVA实验快速, 各步骤都可自动化且对O157菌株具有高的分辨力。
亚太区病原细菌分子分型网络于2003年成立后, 每年召开一次会议, 先后在美国、中国香港、日本和中国南京举办。于2006年12月19~21日在江苏南京举行的第四次亚太区病原细菌分子分型网络Pulse Net Asia Pacific工作会议上, 亚太区的13个国家和地区 (澳大利亚、菲律宾、韩国、马来西亚、孟加拉、日本、泰国、新西兰、印度、越南及我国大陆、香港和台湾地区) 及美国疾病预防控制中心 (CDC Atlanta) 、美国公共卫生实验室协会 (APHL) 、加拿大卫生部国家微生物实验室的约32名代表参加了会议。在美国CDC的倡导下, 包括日本, 新西兰及我国香港在内的几个国家和地区的代表在2005~2006年对MLVA在肠出血性大肠杆菌O157中的应用进行了尝试, 并且在会议上发表了各自的研究结果, 为丰富Pulse Net的实验室网络监测技术提供了新的思路, 也为这种分子分型方法在肠出血性大肠杆菌检测中的推广应用奠定了基础。
分子分型 篇4
1资料与方法
1.1 一般资料
2010年1月-2012年12月在本院乳腺科接受手术并经病理证实的乳腺癌患者, 选择病历资料记录完整、准确、规范, 术前未行新辅助化疗、内分泌治疗或放疗, 相关检查未发现癌肿远处转移者作为研究对象, 共116例, 其中浸润性导管癌108例, 髓样癌4例, 小管癌1例, 黏液腺癌2例, 化生性癌1例。年龄31～81岁, 平均年龄49.5岁。
1.2 方法
观察指标:患者的年龄、病理类型、腋窝淋巴结转移数目。按照2011年St.Gallen国际共识, 依据临床免疫组化方法检测浸润性乳腺癌组织中激素受体 (ER、PR) 及HER-2、Ki67的表达结果, 对乳腺癌进行分子分型[1]。Luminal A型:ER和 (或) PR阳性, HER-2阴性以及Ki67≤14% ;Luminal B型:ER和 (或) PR阳性, HER-2阳性或阴性但Ki67>14% ;HER-2阳性型:ER阴性, PR阴性, HER-2阳性;三阴性乳腺癌 (Basal-like型) :ER、PR和HER-2均阴性。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件建立数据库并进行统计分析, 非连续性变量、等级资料采用Kruskal-Wallis检验。
2结果
2.1 腋淋巴结转移率
全组116例乳腺癌患者中, 46例术后病理证实发生腋窝淋巴结转移, 转移率39.66%。腋淋巴转移1～3枚的32例, 4～8枚的19例, 9枚以上转移的12例。
2.2 腋淋巴结转移与肿瘤分子分型的关系
116例乳腺癌患者中Luminal A型14例, 淋巴结转移2例, 转移率14.29%;Luminal B型61例, 淋巴结转移25例, 转移率40.98%;HER-2阳性型28例, 淋巴结转移15例, 转移率53.57%;Basal-like型13例, 淋巴结转移4例, 转移率30.77%。Luminal A型与其他三组比较, 转移率低, 差异有统计学意义, P<0.05。Luminal B型较Luminal A型淋巴结转移率高, 差异有统计学意义, P<0.05。HER-2阳性型与其他三组比较, 转移率偏高, 差异有统计学意义, P<0.05。
3讨论
2000年Perou[2]等在分子水平将乳腺癌分为:管腔型、正常乳腺样型、HER-2高表达型、基底细胞样型。之后的研究中又根据HER-2、Ki-67的表达将管腔型又分为Luminal A型和Luminal B型[3,4]。2011年3月St.Gallen乳腺癌国际会议达成共识中, 采用免疫组织表型替代基因表达以划分乳腺癌分子亚型[1]。推荐选择雌激素受体 (ER) 、孕激素受体 (PR) 、人表皮生长因子受体2 (HER-2) 及Ki-67这4项肿瘤分子标记物检查对乳腺癌分子分型进行区分, 各亚型具有不同的病程进展、治疗反应和预后。本文在于探讨不同分子亚型的乳腺癌患者其腋窝淋巴结转移是否具有相关性。
本研究中116例乳腺癌患者中Luminal A型14例, 淋巴结转移2例, 转移率14.29%;Luminal B型61例, 淋巴结转移25例, 转移率40.98%;HER-2阳性型28例, 淋巴结转移15例, 转移率53.57%;三阴型13例, 淋巴结转移4例, 转移率30.77%。这一结论提示:乳腺癌中Luminal A型淋巴结转移率低, 预后好。Luminal B型较Luminal A型淋巴结转移率高, 差异有统计学意义。HER-2阳性型淋巴结转移率偏高。Carey[5]等研究显示, HER-2 (+) 型乳腺癌淋巴结转移率为56%, 显著高于其他亚型。三阴型乳腺癌预后最差, 但淋巴结转移率不高。高德宗[6]等发现, 三阴型乳腺癌的组织学分级较高, 但腋窝淋巴结的阳性率低。淋巴结转移是决定乳腺癌预后的主要特征之一。转移癌的淋巴结数目对预后的影响已相当明确。淋巴结无转移者5年生存率86.0%, 转移淋巴结1～3个5年生存率47.8%, 4～7个为33.7%, 8个以上为21.3%[7]。分子分型和腋窝淋巴结转移数目的结合使用能够更进一步预测乳腺癌患者的预后, 为患者个体化治疗方案提供依据。
总之, 乳腺癌分子分型和腋窝淋巴结转移之间存在相关性。Luminal A型淋巴结转移率低, Luminal B型淋巴结转移率较之为高, HER-2阳性型淋巴结转移率更高。虽然三阴型乳腺癌预后最差, 但其淋巴结转移率却不高。
参考文献
[1]Goldhirsch A, Wood WC, Goates AS, et al.Strategies for sub-type-dealing with the diversity of breast cancer:highlights ofthe st gallen international expea consensus on the primary ther-apy of early breast cancer 2011 (J) .Ann Oncol, 2011, 22 (8) :1736-1747.
[2]Perou CM, Sodie T, Eisen MB, et al.Molecular portraits of hu-man breast tumours (J) .Nature, 2000, 6797 (406) :747.
[3]Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al.Gene expression pat-terns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses withclinical implications (J) .Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98 (19) :10869.
[4]Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al.Repeated observation ofbreasttumor subtypes in independent gene expression data sets (J) .Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100 (14) :8418.
[5]Carey LA, Perou CM.Livasy CA.et al.Race, breast cancersubtypes, and survival in the carolina breast cancer study (J) .JAm Med Assoc, 2006, 295 (21) :2492-2502.
[6]高德宗, 余之刚, 唐鲁兵, 等.Basal-like型乳腺癌临床病理特征与预后分析 (J) .中华普通外科杂志, 2008, 23 (5) :347-349.
分子分型 篇5
1 不同基因分型技术在结核分枝杆菌中的应用比较
近年来，IS6110限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)指纹技术被广泛作为结核病分子流行病学研究的经典工具。已经证实该技术在结核病暴发监测和以人群为基础的疾病传播研究中对不同结核分枝杆菌分离株有很高的鉴别能力[2,3,4]。但由于该技术研究数据重复性较差，步骤繁杂，所以所得结果在不同实验室之间较难比较，而且该技术在研究IS6110低拷贝菌株(IS6110拷贝数<5)或IS6110缺陷型菌株中结果较差[5,6]，难以准确揭示菌株间的流行病学联系[7,8,9]。研究[10,11,12]显示在一些非外源性感染的结核病病人中也能观察到一个以上的IS6110杂交带变化，同时发现IS6110 RFLP稳定性受菌株遗传背景影响。为弥补IS6110 RFLP技术的不稳定性，通常要求IS6110 RFLP定义的细菌群落至少有一个杂交带的差别，这亦减小了该技术的适用范围。
以聚合酶链反应(PCR)为基础的间隔寡核苷酸分型(spoligotyping)技术可克服IS6110 RFLP在IS6110低拷贝菌株中分辨率不足的弱点，减少菌株的错误分型。但是spoligotyping对菌株的分辨能力同样存在较大局限[13,14]。且与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向[15]。
一些多位点序列分型技术：多态性富含GC重复序列技术(polymorphic GC-rich repetitive sequence,PGRS)及IS1081直接重复与主要多态性串联重复序列(IS1081 direct repeat and major polymorphic tandem repeat)技术等，虽可用于基因分型，但其基因序列多态性不足限制了对菌株的分类功能[16]。
MIRU技术是近年来发展起来的以PCR为基础的分型技术。MIRU为40～100bp的DNA元件，通常以串联重复形式散布于结核分枝杆菌复合群中。H37Rv基因组中含有41个MIRU区，其中有12个具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间存在差异。MIRU技术利用不同菌株之间这12个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。由于该方法对结核分枝杆菌的鉴定结果以数字表示，结果分析简单明了，便于对不同实验室之间结果比较，且其分辨力与IS6110-RFLP技术相近，只需一天即可完成对菌株的鉴定，被认为是最具潜力的分型方法，已被美国CDC推荐为结核分枝杆菌基因分型的首选方法。
2 MIRU基因分型技术原理、方法、结果分析及其优势
2.1 MIR U技术建立原理
利用基因组中特定位点上同相重复序列可变数(variable-number tandem repeat,VNTR)进行基因分型是在真核生物中应用比较广泛的技术，其提供的分型结果简单清楚，易于比较。1997年Supply等[17]分析比较了卡介苗和结核分枝杆菌senX3-reg X3基因序列，在其基因间隔区域发现存在重复序列并运用SOUTHERN杂交和同源性分析表明不同结核分枝杆菌的基因组中都分布有多个类似的重复序列。研究显示在卡介苗、麻风分枝杆菌及结核分枝杆菌中，这些重复序列有75%同源性。根据重复序列中缺失区域的大小将其分为三型，第一型为77bp左右，重复序列中没有缺失;第二型和第三型分别有24bp和15bp的缺失，麻风分枝杆菌略有不同，为23bp和16bp的缺失。结核分枝杆菌基因组不同位点中，重复序列以不同的数目和组合出现。散布在结核分枝杆菌基因组中，类似人类小卫星序列的可变数目的串联重复序列被定义为MIRUs(Mycobacterial interspersed repetitive units)，每个位点重复序列为1～8个。
2.2 MIR U的实验方法
MIRU实验方法简单易行，在一般设备配置的分子生物学实验室就可以完成。根据参考文献[18]的方法，在20μL PCR反应体系中包括引物4μM各2μL,DNA模板5ng。反应条件：预变性94℃5分钟;40个循环;94℃变性30s;58℃退火复性30s;72℃引物延伸7min。PCR产物用2%Agarose凝胶电泳分离，最后通过与分子量标志物比较推算出各片段大小。
2.3 MIR U的结果分析
由于每个位点的MIRU类型基本固定，而扩增片段中除MIRUs以外的侧翼序列高度保守，因而将扩增所得片段减去侧翼序列长度，就可以推算该位点有几个MIRU[18]。对不同结核分枝杆菌菌株的同一MIRU位点进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳分离，然后与DNA分子量标准和H37Rv标准菌株比较，计算出各菌株和标准菌株相差多少个该位点上特定类型MIRU倍数，以确定不同菌株各位点的数字结果。
2.4 MIR U基因分型技术优越性
2.4.1 简便快速，可操作性强
该方法速度远远超过其他用于结核分枝杆菌基因分型的方法包括IS6110-RFLP、Spoligotyping等，所用设备和软件也较易获得，适用于大规模菌株基因型鉴定。另外，MIRU结果采用通用的数字形式，便于全球范围结核病分子流行病学的研究[19,20,21]。尤其重要的是MIRU技术弥补了IS6110-RFLP的不足，能够鉴别IS6110拷贝数较少的菌株，而这些IS6110低拷贝菌株广泛存在于印度、泰国、马来群岛和越南等国家[22]，使得基因分型的范围大大扩大。
2.4.2 可重复性及可靠性较强
只有具备足够的多态性及稳定性的分子标志物才能在不同时间，不同条件下对不同菌株进行准确分型。高度多态性的标志物往往低估流行病学的联系，而多态性不足可能引起种属较远的菌株之间错误的联系，从而过高估计疾病传播的速度。基因转换、同源性重组和复制滑动等都促使结核分枝杆菌基因组发生遗传变异。相关研究显示，在基因谱较远的BCG亚组菌株在无菌水中培养30年以上，经历几百次进化过程后，其中的11个MIRU位点多态性仍然保持不变，仅有MIRU4位点的多态性在一些菌株中发生变化[23]，提示MIRU位点所在区域作为分子标志物有很好的时间稳定性。多项研究表明，MIRU位点对结核分枝杆菌分型特异度、可重复率和灵敏度都达到100%，这是其他基因分型技术都无可比拟的。
2.4.3 分辨力高
结核分枝杆菌的12个MIRU位点，第二到第八个等位基因相同，相应能产生16 000 000个不同的组合。Lee等[24]发现MIRU在IS6110低拷贝菌株中有很好的鉴别能力。Kwara[15]研究表明，与Spoligotyping相比MIRU具有更高的鉴别能力和流行病学意义。多项研究同时指出，以MIRU为基础的分型方法能够充分地将菌株区分，具有良好的鉴别能力，分型能力已接近IS6110-RFLP技术。
3 MIRU基因分型技术在结核病分子流行病学中的应用
3.1 探索结核病传播的流行关系
结核病分子流行病学是监测结核病传播的有效途径，它是建立在“感染相同菌株的患者有相同的传染源既存在流行病学联系”假设基础之上的。近年来，在评估结核病近期传播方面引用了“簇”(cluster)的概念，“簇”代表的是具有高度相似或相同DNA特征的一组结核分枝杆菌。成簇病人所感染的结核菌往往来自相同的传染源，如果两株菌株基因型完全相同，那它们就属于同一个基因分型簇。人群中成簇的比例越高，提示这个地区相同基因分型簇的结核病患者是由共同的传染源引起的，有暴发流行可能，与之对应的菌株就是当地流行的优势菌株。Mailis等[25]利用MIRU方法发现在委内瑞拉的土著人群结核病患者结核菌分离株中成簇的比例高于73%，患结核病的人数较多与平均发病率高结果一致。通过成簇率的高低可以反映出MTB的传播情况。
成簇组的患者被假定属于同一个传播链，结核病防治人员就可以对相因的患者进行随访，迅速确定结核病传播的位置，有效进行干预控制结核病的流行。
成簇的危险因素可以通过比较成簇组和独立组的频数和患者相关特征被评价。基因分型数据结合流行病学资料通过长期的监测分析，可以对一个区域的结核病病例的传播范围，途径，程度等进行全面评估。对于非成簇，分型独特的结核菌株，可能是由于初始感染的菌株再激活引起疾病复发，既内源性复燃所致。
3.2 对结核病高危人群防治进行指导，评价TB控制效力
传统的结核病流行病学在研究结核分枝杆菌与结核病关系时，常常使用“黑箱”理论[26]，使得结核分枝杆菌与结核病发病过程关系不清楚。利用MIRU技术结合流行病学信息可以比较全面地阐明结核病自然发病史，即暴露-发病连续带(exposure-disease continuum,EDC)，从而揭示“黑箱”秘密。
成簇病例的比例反应TB的控制措施的效果。瑞士一项研究[27]表明苏黎世3年期间只有17.5%的病人成簇，提示近期传播水平低于其他国家，表明苏黎世TB控制效果较好。
3.3 监测结核病暴发流行，确定流行优势菌株
结核病的暴发流行是由同一病原株的病例簇引起的，因此利用MIRU基因分型方法追踪结核病传染源和查找传播途径是防控结核病暴发流行的一个重要手段。Freeman[28]以及Schmid[29]等均利用MIRU基因分型技术在结核病暴发流行方面进行了应用。
通过MIRU基因分型方法可以分析多种结核分枝杆菌亲缘关系图，了解该地区传播的优势菌株，描绘不同地区、不同毒力、不同耐药菌株的遗传发育树。
通常情况下，高感染地区的菌株比低感染地区的菌株DNA多态性少。国内，石荔等[30]利用MIRU技术对收集到的217株西藏地区结核分枝杆菌进行分析，结果显示西藏地区MTB存在明显的基因多态性，主要基因型为北京家族基因型。许卫国等[31]对江苏省的168株MTB样本进行了MIRU分型，VIII型为主要流行型。蒋毅等[32]对福建105株MTB基因分型的初步研究发现I型是当地的主要流行型。这些研究也印证了具有独特分子特征的不同基因家族存在各自不同的地区性分布和致病性。
对耐药菌株的基因分型能够在一定程度上确定耐药株是本地流行菌株或是“外来”菌株，分型数据的定量分析也有助于鉴定和预测未来疾病优势菌株。
分子分型 篇6
关键词：伤寒沙门菌,副伤寒沙门菌,耐药,电泳,凝胶,脉冲场,细菌分型技术
伤寒、副伤寒是由伤寒沙门菌和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起的急性全身系统性传染病, 其传染性强, 病程长, 易复发, 疾病负担较重。近6年来, 北京市伤寒和副伤寒疫情维持在较低水平, 每年均只有散发病例出现。为更好地掌握伤寒和副伤寒沙门菌流行状况及用药情况, 我们对北京市肠道门诊监测系统分离到的17株伤寒和副伤寒沙门菌进行药敏分析, 并采用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 方法对分离菌株进行分子分型研究, 对不同来源的伤寒和副伤寒沙门菌之间进行相关分析, 为全面掌握伤寒和副伤寒沙门菌的分子流行病学特点, 合理指导临床用药, 以及预防控制伤寒和副伤寒提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
2008—2013年北京市肠道门诊监测系统中收集并分离出伤寒、副伤寒沙门菌共17株, 其中伤寒沙门菌4例, 分别为2010年2例, 2013年2例;甲型副伤寒沙门菌2例, 分别为2011年1例, 2012年1例;乙型副伤寒沙门菌8例, 分别为2009年4例, 2010年2例, 2011年1例, 2013年1例;丙型副伤寒沙门菌3例, 分别为2008年1例, 2011年2例。
1.2 主要试剂与仪器
①主要试剂:培养基SS、LB、M-H琼脂及药敏纸片 (英国Oxoid公司) 、微量生化管 (北京友康基业生物公司) 、VITEK GNI鉴定板 (法国bio Mérieux公司) 、沙门菌诊断血清 (泰国S&A公司) 、Seakem Gold琼脂糖 (美国Cambrex Bio Science Rockland公司) 、蛋白酶K (德国Merck公司) 、限制性内切酶Xba I (美国New England Biolabs公司) 。②主要仪器:VITEK浊度仪 (法国bio Mérieux公司) 、实验用去离子水系统 (美国Millipore公司) 、SW22型水浴摇床 (德国Julabo公司) 、5415D型台式高速离心机 (德国Eppendorf公司) 、脉冲场凝胶电泳仪及配套设备 (美国Bio-Rad公司) 、凝胶成像系统 (美国Bio-Rad公司) 。
1.3 方法
①菌株的生化鉴定和血清分离:从SS选择性平板上直接挑取数个可疑菌落, 接种在三糖铁琼脂中, 接种方法先于斜面划线后穿刺直立段, (36±1) ℃培养过夜。斜面红色、底层黄色产气、硫化氢阳性为可疑沙门菌。用VITEK全自动生化分析仪进行鉴定, 确定为沙门菌属后, 用沙门菌诊断血清进行分型, 有些菌株需要连续诱导, 才能确定鞭毛第2相H抗原的型别 (用生理盐水做对照) 。②伤寒和甲副沙门菌鉴定:按照中华人民共和国卫生行业标准WS 280-2008《伤寒、副伤寒诊断标准》进行生化鉴定和血清学分型。 (2) 药敏试验采用WHO推荐的Kirby-Bauer法, 从孵育了16~24 h的LB琼脂平板上, 挑出单个菌落, 直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。在15 min内, 用无菌棉拭子蘸取调好的菌液, 在MH培养基表面涂布接种, 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。纸片一旦与平板接触, 不应再移动, 37℃孵育18~20 h以后, 测量各药敏纸片抑菌圈直径, 与美国临床实验室标准化协会 (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute) 2009年标准进行比较, 作出结果判断。以大肠埃希菌 (ATCC25922) 作为质控菌株。③PFGE分型:按照伤寒、副伤寒防治手册中参照国际食源性病原细菌分子分型监测网络Pulse Net中沙门菌脉冲场电泳标准分型的标准操作方法[1], 对17株伤寒、副伤寒沙门菌菌株进行分子分型。沙门菌标准株H9812作为相对分子质量标记。内切酶Xba I (40 U) , 37℃酶切3 h。电泳条件:电压6 V/cm, 脉冲时间从2.2~63.8 s, 线性转换, 转换角度120°, 电泳时间19 h, 电泳温度14℃。PFGE电泳图谱中, 每条泳道代表l株菌, 在限制性内切酶的切割下, 不同的菌株会呈现不同的条带数和片段大小。电泳图像经过统一的相对分子质量标准进行校准, 将条带数和位置相同的菌株归为同一PFGE型别。
1.4 统计学分析
全部数据录入excel 2003进行统计分析;用Bio Numerics软件对电泳图像进行数据分析, 得出聚类树状图。聚类图类型根据非加权配对算术平均法 (unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA) 构建, 相似率为100%的认定为同一PFGE型, 小于100%的认定为不同的PFGE型。
2 结果
2.1 一般情况
17株伤寒、副伤寒沙门菌男女比例1.83∶1, 以男性为主。年龄分布0~10岁占35.29%, 其次为21~30和31~40岁, 分别均占17.65%。
2.2 药敏结果
17株伤寒、副伤寒对3代头孢菌素类药物头孢他啶敏感率达100%, 头孢噻肟和头孢曲松敏感率均为93.75%, 对氟喹诺酮类药物环丙沙星敏感率为93.75%, 对萘啶酸耐药率达23.53%。其中伤寒、乙型和丙型副伤寒沙门菌对链霉素中介率较高, 分别为100%、75%和100%。乙型副伤寒沙门菌对3代头孢菌素类药物均有耐药菌株出现, 对环丙沙星敏感率达87.5%。伤寒、甲型副伤寒及丙型副伤寒沙门菌对3代头孢菌素类抗生素敏感率为100%。伤寒和甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌对广谱第4代头孢菌素类抗生素头孢吡肟敏感率均达100%。见表1。从不同年龄段分析耐药结果显示, 小于10岁年龄组的6株除均对链霉素中介外, 余抗生素均敏感。其他各年龄组药敏结果无明显差异。从多重耐药进一步分析显示, 3株仅耐1种抗生素, 2株为1种抗生素耐药和1种抗生素中介, 2株为多重耐药株。2株多重耐药株均为乙型副伤寒沙门菌, 其中1例为57岁男性患者, 对氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松耐药, 对链霉素及阿莫西林/克拉维酸钾中介, 余抗生素敏感。另1例62岁女性患者除对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟敏感及环丙沙星中介外, 其余抗生素菌均耐药。见表2。
2.3 PFGE结果
对17株伤寒、副伤寒沙门菌菌株进行PFGE, 有1株菌降解, 其余均得到清晰的PFGE图谱, 图谱聚类分析见图1。经聚类分析显示, 16株伤寒、副伤寒沙门菌分为15种PFGE带型, 带型分布较分散。4株伤寒沙门菌中有3株相似系数>60%, 1株距离较远。2株甲型副伤寒沙门菌相似系数>80%, 同源性较强。8株乙型副伤寒沙门菌中有5株相似系数较高, 达65%以上;同源性较强, 其中2株带型完全一致;但样本采自不同的区县, 不同的月份, 没有共同的流行病学史。3株丙型副伤寒沙门菌有2株相似系数约为>80%, 同源性较强, 另1株距离较远。
3 讨论
本研究中2008—2013年北京市肠道门诊监测系统共收集伤寒沙门菌和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌共17株, 显示北京市近6年伤寒、副伤寒感染率较低, 且无聚集性疫情。对17株伤寒、副伤寒沙门菌流行病学资料分析显示感染以男性为主, 年龄以0~10岁为主, 与低龄幼儿的自身免疫系统发育不够完善较为易感有关[2];并且5岁以下幼儿也是病毒性腹泻易感人群[3], 因此, 应加强对低龄儿童感染性腹泻的监测和防控。本研究药敏结果显示, 0~10岁年龄组对第3、4代头孢菌素类抗生素敏感率高达100%, 因第3、4代头孢菌素类抗生素不良反应少小, 且患者年龄小于18岁禁用喹诺酮类药物[4], 提示第3、4代头孢菌素类抗生素尤为适用于低龄伤寒、副伤寒沙门菌感染患者。但在使用头孢菌素类抗生素药物的同时, 也易引起产超广谱β-内酰胺酶、Ampc酶等一系列多重耐药菌的产生[5], 故应慎重选择并加强耐药监测, 同时重视少数耐药菌株的出现。本结果还显示, 喹诺酮类抗生素中的第1代喹诺酮类药物萘啶酸耐药率较高, 而氟喹诺类药物环丙沙星敏感率较高, 这与纪金铃等[6]报道的沙门菌耐药情况相一致, 提示环丙沙星仍可作为成人临床治疗伤寒、副伤寒沙门菌感染的首选药物。进一步分析结果显示环丙沙星耐药菌株主要集中在乙型副伤寒沙门菌, 同时乙型副伤寒沙门菌较之伤寒及甲、丙副伤寒沙门菌对三代头孢菌素类药物耐药也较多, 提示伤寒、副伤寒沙门菌血清型与抗生素耐药相关, 与之前对沙门菌耐药研究结果相似[4]。有报道称, 在美国发现了首例耐第3代头孢菌素 (头孢曲松) 的沙门菌感染病例, 同时也分离到耐13种药物的沙门菌株[7]。本结果中2株多重耐药菌株均来自较大年龄患者, 其中1株耐三种抗生素, 另1株耐9种抗生素仅对第3、4代头孢菌素类抗生素敏感, 对环丙沙星中介, 提示多重耐药仍是当前面临的主要难题。氟喹诺酮类及第3代头孢菌素类抗生素是治疗伤寒、副伤寒沙门菌感染的重要药物[1], 本研究与此相一致, 遗憾的是本研究病例较少, 但随着对喹诺酮类和第3、4代头孢菌素类抗生素等的耐药监测以及研究病历的增多, 将对科学合理用药提供更为有力依据。
目前PFGE是国际上公认的食源性传染病暴发流行确认的重要手段, 已被应用于多种病原体的监测分析中[8]。PFGE分型方法直接针对整个细菌染色体DNA进行分析, 它从整体上反映了不同菌株全部基因的相关性。PFGE分辨力高, 重复性好, 是目前最理想的分型方法, 常作为评价其他分型方法的参考标准[9]。本研究采用美国Pulse Net标准操作方法, 对伤寒、副伤寒沙门菌进行了PFGE分型, 所有菌株都可得到10~20条左右的条带。16株伤寒、副伤寒沙门菌分为15种PFGE带型, 反映了北京市带型分布较分散, 呈现多样性, 揭示近6年北京市伤寒、副伤寒沙门菌感染者仅是散发病例的原因。从聚类分析图上可以看出, 4株伤寒沙门菌中4种带型, 其中3株相似系数约为60%;另一株距离更远, 其型别多, 变异大, 充分体现了伤寒沙门菌的基因多态性。2株甲型副伤寒沙门菌相似系数较近, 体现了甲型副伤寒沙门菌同源性较高。8株乙型副伤寒沙门菌中有5株相似系数达65%以上, 同源性也较强, 其中2株带型完全一致, 但样本采自不同的月份, 不同的区县, 没有共同的流行病学史, 并非聚集性疫情。3株丙型副伤寒沙门菌有2株相似系数约为88%, 另一株距离也较远。本结果提示, 北京地区伤寒、副伤寒仍处于散发状态。本结果也显示, PFGE是研究伤寒、副伤寒沙门菌分子流行病学中基因分型的一种很灵敏的方法, 帮助确定病例之间的亲缘关系, 从而有利于确认和处理在大范围内呈散发特征的暴发事件的溯源调查[10]。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
参考文献
[1]卫生部疾病预防控制局, 中国疾病预防控制中心.伤寒、副伤寒防治手册[M].2版.北京:人民卫生出版社, 2006:35.
[2]何战英, 窦相峰, 刘桂荣, 等.北京市2008—2009年沙门菌感染性腹泻现况研究[J].中华流行病学杂志, 2010, 31 (12) :1438-1439.
[3]于秋丽, 申悦霞, 谢贇, 等.2007-2010年河北省卢龙县婴幼儿腹泻患者A组轮状病毒感染监测[J].国际病毒学杂志, 2011, 18 (5) , 153-156.
[4]张新, 刘桂荣, 黄芳, 等.2008—2010年北京市沙门菌血清型和药物敏感分析[J].中国预防医学杂志, 2011, 12 (11) :899-901.
[5]Chen S, Zhao S, White DG, et al.Characterization of multiple antimicrobial resistant salmonella serovars isolated from retail meats.Appl Environ Microbiol, 2004, 70 (1) :1-7.
[6]纪金铃, 崔恩博, 郭桐生, 等.10年间北京地区腹泻患者沙门菌亚型分布和耐药分析[J].中国卫生检验杂志, 2011, 21 (12) :2937-2939.
[7]Winokur PL, Vonstein DL, Hoffman LJ, et al.Evidence for transferof CMY-2 Amp C beta-lactamase plasmids between Escherichia coli and Salmonella isolates from food animals and humans[J].Antimicr Agents Chemothera, 2001, 45 (10) :2716-2722.
[8]曲梅, 张新, 王小莉, 等.阿贡纳沙门菌引起的聚集性腹泻病例监测及分析[J].疾病监测, 2013, 28 (3) :193-196.
[9]Gaul S B, Wedel S, Erdman MM, et al.Use of pulsed-field gel electrophoresis of conserved Xba I fragments for identification of swine Salmonella serotypes[J].J Clin Microbiol, 2007, 45 (2) :472-476.