重组质粒（精选八篇）
重组质粒 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
2×快速裂解液(0.2mol/L Na OH,0.5%SDS,20%葡萄糖)自行配制,Taq DNA聚合酶、d NTP购自成都博瑞克生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
在克隆番茄Le NHX1(Lycopersicon esculentum NHX1)基因时,将回收纯化后的高保真PCR产物与平末端克隆载体p EASY-Blunt在室温下进行连接,然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的抗性平板上培养,得到长出单菌落的平板(具体内容另文发表)。用无菌牙签随机挑选部分单菌落到含100μg/m L氨苄青霉素的LB培养基中,37℃培养6~7h,取200μl菌液作快速裂解鉴定,剩余菌液于4℃保存。快速裂解鉴定重组质粒的程序为:取200μl菌液于0.5ml的eppendorf管中,10 000r/min离心1min,倒掉上清并用移液枪彻底吸掉残余液体,加入20μl 2×裂解缓冲液,用吸头吹打或涡旋振荡器混匀,10 000r/min离心10min,然后取5~10μl上清液,电泳检测以筛选重组质粒。为进一步说明我们所摸索的快速鉴定重组质粒方法的准确性,对于快速裂解法筛选的样品,再取1μl菌液作为模板,采用PCR扩增方法来验证两种方法的鉴定结果是否一致。
2 结果与分析
菌液在快速裂解后,经过1.5%琼脂糖凝胶电泳,由于重组质粒和非重组质粒大小不同,电泳时迁移速度不一致,故将出现在凝胶中2个不同的位置,其中重组质粒由于插入有外源片段,电泳时其位置要相对滞后(图1箭头所指位置),由图1可以看出,泳道1、3、4、6的质粒在电泳时迁移位置相对滞后,故为重组质粒,泳道2、5、7的质粒为非重组质粒。另外,在实验中还发现,若要使电泳结果更理想,在加入裂解缓冲液前最好将eppendorf管中离心后形成的菌体沉淀中的液体彻底吸干,否则电泳后在质粒的上方将会出现很亮的大分子物质杂带,在下方将会出现很亮的小分子物质杂带(图1B)。图1A中样品在在加入裂解缓冲液前,菌体沉淀中的残余菌液被彻底吸干,电泳时在质粒的上方形成大小一致且亮度较弱的基因组DNA和其他杂质条带。为了进一步验证我们所摸索的快速鉴定重组质粒方法的可靠性,分别取各个样品1μl菌液作为模板,采用PCR反应进行比较,结果发现泳道1、3、4、6出现与预期大小相符的目的片段,这再次说明了快速裂解鉴定重组质粒的可行性(图2)。
M:DNA Marker-DL2000;1-7:The recombinant plasmids to be identified.
3 讨论
目前,重组质粒鉴定主要采用PCR扩增鉴定或提取质粒再进行酶切鉴定法,采用PCR扩增鉴定重组质粒时,需要购买PCR扩增试剂和合成引物,这就相应增加了实验成本,当要对大量样品如以质粒为载体的c DNA文库克隆进行鉴定时,此缺点尤为突出,同时PCR反应需消耗大量的时间并且可能出现假阳性结果。采用酶切方法来鉴定重组质粒时,必须先提取质粒,目前质粒提取可使用经典的碱裂解法,该操作繁琐且耗时,整个过程需要配制多种试剂且操作需在冰上进行,十分不便。采用商业化的质粒提取试剂盒来提取质粒,使用相对方便但成本较高,质粒提取完成后,需要使用限制性内切酶分别对每个样品进行酶切,再次增加了实验时间和成本[4]。熊敏等在研究中,探索出了一种简单快速的直接用碱裂解电泳筛选重组子的方法,其体系中包含有悬浮液和裂解液两种组分,其中悬浮液中除了含有葡萄糖外,还含有Tris-HCl、EDTA和RNase等试剂[5],崔锦等所采用的筛选重组子克隆的快检缓冲液只有一种试剂,其成分除了含有Na OH和SDS外,还含有EDTA和Tris-HCl,试剂配置仍然相对繁琐[6],罗文永等利用苯酚/氯仿/异戊醇直接裂解细菌菌液,再通过电泳比较不同质粒的迁移位置来鉴定重组质粒,效果也不错但苯酚和氯仿具有一定的毒性,现在实验室一般很少使用这种方法[7]。我们在研究中摸索出了一种更经济、快速、准确的重组质粒鉴定方法,和其它方法所需试剂组分相比,该方法只需要将Na OH、SDS和葡萄糖按一定比例溶解于无菌水中即可配成细胞裂解液,快速鉴定时将碱性裂解液加到离心后的菌体沉淀中,菌体破碎后取上清进行琼脂糖凝胶电泳,通过比较质粒DNA的迁移位置来判断样品是否为重组质粒,省去了其他重组质粒鉴定方法的繁琐步骤,结果可靠、重复性好,对设备要求也低,适合在各常规实验室推广。
菌体中加入快速裂解液后p H值大概是12.0~12.5,此时细胞悬液将变得较黏稠,染色体DNA和蛋白质变性并与细胞壁一起缠绕形成大型复合物,此复合物进一步又被SDS包被,高速离心后容易下沉到管底,质粒却倾向被释放到上清中[8],因此电泳上样时应尽量吸取上清液。电泳过程中所用的电压尽量也不要过大,否则凝胶容易发热从而导致电泳条带弯曲变型,这对取得理想电泳结果很关键。另外,在实验中还发现,本方法对于拷贝数高且大小在10kb以下的p UC和p GEM系列质粒,鉴定效果很理想,但对于拷贝数低且大小在10kb以上的如植物表达载体p BI121质粒等,鉴定效果不是很理想,究其原因可能是大片段的重组质粒需要较长的电泳时间才能完全分开,此过程增加了电泳条带发生弥散和弯曲的机会,另外由于低拷贝数的质粒其浓度相对要低,故电泳后观察结果时条带所发出的亮度较弱,这也在很大程度上影响结果的观察。
参考文献
[1]崔静,黄爱龙,张文露.结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法[J].生物技术通报,2008,3:99-102.
[2]徐意.用组合引物PCR法简便快速筛选阳性正向克隆[J].重庆科技学院学报,2009,11(3):52-54.
[3]程桂芝,李芳.人类核糖核酸酶9基因的克隆及表达载体的构建[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(8):748-750.
[4]秦欢,汪炳华,周赤燕,等.可调控CYP4A1的逆转录病毒重组质粒的构建与鉴定[J].武汉大学学报,2009,30(1):1-5.
[5]熊敏,李青,李文涵,等.一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法[J].生物技术,2005,15(1):51-52.
[6]崔锦,李林珂,马向东.一种简便快速筛选重组子的方法[J].生物技术,2005,15(6):46-47.
[7]罗文永,陈建伟,刘彦卓,等.快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验[J].广东农业科学,2004,2:9-10.
重组质粒 篇2
博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组质粒的构建及鉴定
构建博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒.通过PCR方法扩增获得博尔纳病病毒p24基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.PCR及核酸序列测定证明博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒构建成功.构建的.重组质粒将为研究博尔纳病病毒p24基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据.
作 者：翟爱霞 答嵘 宋武琦 李小光 李玉军 张凤民 ZHAI AI-xia DA Rong SONG Wu-qi LI Xiao-guang LI Yu-jun ZHANG Feng-min 作者单位：哈尔滨医科大学,微生物学教研室,黑龙江,哈尔滨,150081刊 名：微生物学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MICROBIOLOGY年，卷(期)：28(3)分类号：Q93关键词：博尔纳病病毒 基因重组 PCR 序列分析
重组质粒 篇3
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
变异链球菌UA159、pMD19-T载体和大肠杆菌JM109感受态细胞(TaKaRa公司)、pEGFP-N1质粒(第四军医大学遗传教研室赠送)。
1.1.2 主要材料和试剂
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒、Mr 94 000的耐热性DNA聚合酶、SolutionⅠ连接酶、各种内切酶如HindⅢ、SalⅠ、BamHⅠ、EcorⅠ、StuⅠ(以上均购于TaKaRa公司)、LB培养液和培着基、BHI培养基和培养液、细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)、GELVIEW(BioTeke 公司)、氨苄青霉素、卡那霉素、琼脂粉、TBE(0.5×)、各种PCR引物(AuGCT 生物技术公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 pMD19-T载体中连入卡那霉素耐药基因
pEGFP-N1质粒的抗性为卡那霉素,以pEGFP-N1为模板,设计引物:5′-AATGTGCGCGGAACCCCTATTTG-3′、5′-GTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAA-3′, 建立50 μl的PCR反应体系进行PCR,得到抗卡那霉素的DNA序列(1 336 bp),DNA凝胶电泳,回收抗卡那霉素DNA片断,然后连入到pMD19-T的EcorV处,转化入大肠杆菌JM109感受态中,在含有氨苄青霉素(100 mg/L)和卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基中进行筛选,得到阳性单克隆,接着在5 ml的LB培养液中37 ℃、摇菌12 h,提质粒,得到质粒pMD19-TK。
1.2.2 变异链球菌UA159的DNA提取
用PBS复苏变异链球菌UA159冻干粉,接种于BHI培养基中,在厌氧箱内(N2:85%、CO2:5%、H2:10%)37 ℃培养48 h,挑单克隆,接种于5 ml的BHI培养液中,培养24 h,吸取3 ml菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,凝胶电泳鉴定。
1.2.3 luxS基因上下游同源臂DNA序列获取
通过Genbank查询LuxS基因上下游同源臂碱基序列,设计引物:Xup f:5′-CCCAAGCTTGAAGCGTCAAATTTCAGCGAT-3′(含有HindⅢ酶切位点),Xup r:5′-GGCGTCGACCCTTTT
GAGCGTCATCTAGTG-3′(含有SalⅠ酶切位点);Xdown f:5′-CGCGGATCCTCAACAGTAACTTCTTTTGTC-3′(含有BamH Ⅰ酶切位点),Xdown r:5′-CCGGAATTCATCAATACCTGTCAAGCTCTC-3′(含有EcorⅠ酶切位点)。以变异链球菌UA159的DNA为模板,用梯度PCR选择最佳反应条件进行扩增,得到Xup(920 bp)和Xdown(941 bp)产物。
1.2.4 pMD19-TK连入Xdown
对Xdown和pMD19-TK用BamHⅠ和EcorⅠ同时进行双酶切3 h,DNA凝胶电泳检测,并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行酶切后的DNA回收,把酶切后的pMD19-TK和Xdown按1∶3的摩尔比进行混合,加入等量SolutionⅠ、16 ℃,连接过夜,取上述10 μl转化入100 μl大肠杆菌JM109感受态中,在含有氨苄青霉素(100 mg/L)和卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基上进行阳性克隆筛选,挑单克隆摇菌,提取质粒,得到pMD19-TKD。
1.2.5 pMD19-TKD连入Xup
对Xup和pMD19-TKD用HindⅢ和SalⅠ同时进行双酶切,DNA凝胶电泳检测,并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行酶切后的DNA回收,把酶切后的pMD19-TKD和Xup按1∶3的摩尔比进行混合,加入等量SolutionⅠ、16 ℃,连接过夜,取上述液10 μl转化入100 μl大肠杆菌JM109感受态中,在含有氨苄青霉素(100 mg/L)和卡那霉素(30 mg/L)的LB培养基上进行阳性克隆筛选,挑单克隆摇菌,提取质粒,得到pMD19-TUKD。
2 结 果
2.1 pMD19-TK的鉴定
以得到的pMD19-TK为模板,以上述Kana+基因引物进行PCR鉴定,得到1 336 bp的DNA片断,由于连入的Kana+基因的序列中含有StuⅠ酶切位点,所以进行3 组双酶切分析(SalⅠ和BamHⅠ、SalⅠ和StuⅠ、BamHⅠ和StuⅠ)(图 3)。最后进行测序,结果正确。
2.2 pMD19-TKD的鉴定
①PCR鉴定:设计引物:f:5′-TGACTGGGCACAACAGACAAT-3′(位于Kana+内);r:5′-TTCACGCTCATCAATATGCCT-3′(位于Xdown内),以构建好的pMD19-TKD为模板,可以得到一段1 385 bp的DNA片断(图 1)。②酶切分析:在pMD19-TKD中Kana+基因的序列和Xdown序列都含有StuⅠ酶切位点,所以分别用StuⅠ、BamHⅠ和EcorⅠ进行酶切鉴定,得到DNA电泳结果(图 4)。通过以上鉴定初步可以认为pMD19-TKD构建成功,最后进行测序,结果正确。
2.3 pMD19-TUKD的鉴定
①PCR鉴定:用Xup的5′引物(CCCAAGCTTGAAGCGTCAAATTTCAGCGAT)和Kana+3′引物(GTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAA),以构建好的pMD19-TUKD为模板,可以得到一段2 272 bp的DNA片断(图 2)。②酶切分析:分别用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ、Sal Ⅰ和BamH Ⅰ、BamH Ⅰ和Ecor Ⅰ进行酶切鉴定,得到DNA电泳结果(图 5)。通过以上鉴定初步可以认为pMD19-TUKD构建成功,最后进行测序,结果正确。
3 讨 论
密度感应是细菌根据自身的密度,分泌一些可扩散的小分子来进行细菌之间交流的过程,在很多细菌中,AI-2分子是很重要的信号传导分子,它的合成酶LuxS广泛存在于很多种细菌中[5]。LuxS酶也是激活甲基循环的一个很重要的组成部分。
牙菌斑中的变异链球菌也受密度感应调控,变异链球菌中的luxS基因对变异链球菌的致病力起着很重要的作用,它对牙菌斑生物膜的形成、细菌的耐酸力、产酸能力、对氧的 耐受力、变 链素的合成都有调 控作用[6,7]。Merritt[8]曾经把抗红霉素的基因和luxS上下游同源臂按顺序进行连接后,连入到pUC19载体构建成pUCluxKO,再转化入变异链球菌中,成功构建了luxS突变株。本研究以pMD19-T(来源于pUC19,仅仅比pUC19多一个Ecor Ⅴ酶切位点,其余序列完全一样)来代替pUC19,用PCR的方法得到抗卡那霉素耐药基因DNA序列和luxS上下游的同源序列,然后分段连入到载体多克隆酶切位点中得到重组质粒。以便将来转化入变异链球菌中利用同源重组等位基因交换,进行luxS的敲除。
1和3:HindⅢ和SalⅠ(926 bp); 2和4:BamHⅠ和HindⅢ(2 282 bp); 5:Marker 2 000; 6:SalⅠ和BamHⅠ(1 356 bp); 7:BamHⅠ和EcorⅠ(947 bp)
在本研究中,由于抗卡那霉素的基因是连入到pMD19-T的Ecor V处,所以PCR引物设计时没加酶切位点。在连入Xdown和Xup,根据pMD19-T载体上相应的酶切位点,设计引物加入了合适的酶切位点,主要是根据以下原则:载体上的酶切位点,尽量拉开距离,因为酶切位点越近,越不易于能同时切开,并且尽量选择比较一致的缓冲液,同时在连接时,也没有选择易受甲基化影响的XbaⅠ,所以连接Xdown时,选择了BamHⅠ和EcorⅠ;连接Xup时,选择了HindⅢ和SalⅠ,并且本研究中感受态细胞选择是高转化效率的a-互补性选择宿主E. coli JM109,结果在进行双酶切连接、转化、筛选时,顺利的筛选到了阳性克隆,经过提质粒、酶切鉴定、测序结果都正确,最后成功构建了luxS基因同源重组质粒。
摘要：目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除。方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,最后将这3段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选。结果:kana+基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确。结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础。
关键词：变异链球菌,luxS基因,pMD19-T载体,pEGFP-N1质粒,pMD19-TUKD
参考文献
[1] Suntharalingam P, Cvitkovitch DG. Quorum sensing in streptococcal biofilm formation[J]. Trends Microbiol, 2005, 13(1):3-6.
[2] Jack RW, Tagg JR, Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria[J]. Microbiol Rev, 1995, 59 (2):171-200.
[3] Xavier KB, Bassler BL. LuxS quorum sensing: More than just a numbers game[J]. Curr Opin Microbiol, 2003, 6(2):191-197.
[4]McNab R,Lamont RJ.Microbial dinner-party conversa-tions:The role of LuxS in interspecies communication[J].J Med Microbiol,2003,52(Pt7):541-545.
[5] De Keersmaecker SC, Sonck K, Vanderlevden J. Let LuxS speak up in AI-2 signaling[J]. Trends Microbiol, 2006, 14(3): 114-119.
[6]Wen ZT,Bume RA.LuxS-mediated signaling inStreptococ-cus mutansis involved in regulation of acid and oxidativestress tolerance and biofilm formation[J].J Bacteriol,2004,186(9):2682-2691.
[7]Merritt J,Kreth J,Shi W,et al.LuxS controls bacteriocin production inStreptococcus mutansthrough a novel regula-tory component[J].Mol Microbiol,2005,57(4):960-969.
重组质粒 篇4
1 材料
1.1 质粒、菌株、病毒及细胞
穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdeasy-1及E.coli BJ5183工程菌, 兰州兽医研究所惠赠;PCV-2, 河南农业大学传染病实验室保存;PK-15细胞, 购自中国典型培养物保藏中心 (武汉大学) 。
1.2 主要试剂及仪器
rTaq DNA聚合酶、KpnⅠ酶、HindⅢ酶、dNTP、蛋白酶K、DL-2 000 Marker、250 bp Ladder Marker、Wide Range DNA Marker (500～12 000 bp) 和λ/HindⅢ Marker, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;PacⅠ酶和PmeⅠ酶, 购自NEB公司;DNA胶回收试剂盒, 购自北京百泰克生物技术有限公司;台式高速低温离心机 (型号为Universal 32R) , 德国HETTICH公司产品;PCR仪 (型号为EDC-810) , 东胜创新生物科技有限公司产品;凝胶成像系统 (型号为ZS-2200) , 美国Alpha公司产品。
2 方法
2.1 PCV-2 DNA的提取
PCV-2病毒的增殖参照参考文献[8]进行, DNA的提取方法参照参考文献[9]进行, 产物保存于-20 ℃冰箱, 备用。
2.2 PCV-2 ORF2片段的扩增
根据资料报道, PCV-2 ORF2基因上有2个特异性抗原表位[10], 依据GenBank公布的EU780074序列设计能扩增含有2个特异性抗原表位的引物, 序列为上游引物P1 5′-GGGGTACCAATGGCATCTTCAACACCC-3′, 下游引物P2 5′-CCCAAGCTTATGGCGGGAGGAGTAGTT-3′, 扩增片段长度为518 bp, 在上、下游引物中分别加入了Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点 (下画线部分) 。PCR扩增体系:ddH2O 26.5 μL, 10×Buffer 5 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 5 μL, dNTP (10 mmol/L) 1 μL, 引物P1、P2 (20 pmol/L) 各1 μL, PCV-2 DNA 10 μL, rTaq酶 (5 U/μL) 0.5 μL。反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环;72 ℃ 10 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.3 PCV-2 ORF2重组穿梭质粒的构建和鉴定
PCV-2 ORF2 PCR扩增产物及pShuttle-CMV穿梭质粒分别用KpnⅠ及Hind Ⅲ双酶切, 进行胶回收纯化目的片段, 并按一定比例混匀, 加入连接试剂, 在16 ℃连接槽中连接16 h;连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α, 然后涂于含卡那霉素的LB平板上, 37 ℃培养16 h;挑取白色菌落进行增菌培养。将细菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 并提取质粒作模板进行PCR鉴定, 阳性质粒命名为rpShuttle-CMV-518。
2.4 E.coli BJ5183感受态细胞的制备
取-70 ℃保存的E.coli BJ5183菌种, 用液体LB培养基 (自制) 扩大培养, 参照参考文献[9]制备感受态细胞。
2.5 pAdeasy-1骨架质粒转化E.coli BJ5183工程菌
转化方法参照参考文献[9]进行, 制备的细菌液均匀涂抹在含有氨苄西林的LB平板上, 37 ℃培养16 h;挑取菌落, 用碱裂解法抽提质粒, 用BamHⅠ、EcoRⅠ及HindⅢ酶进行酶切电泳鉴定, 含有pAdeasy-1质粒的菌命名为BJ5183/p菌。
2.6 含骨架质粒的BJ5183/p感受态细胞的制备
参照参考文献[9], 用氯化钙方法制备BJ5183/p感受态细胞, -70 ℃保存, 备用。
2.7 重组穿梭质粒的制备
rpShuttle-CMV-518穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化后去磷酸化, 参照参考文献[9]转化入BJ5183/p感受态细胞中, 将制备的细菌液均匀涂抹在含有卡那霉素的LB平板上, 37 ℃培养20 h;挑取生长较小的菌落接种于LB液体培养基, 用碱裂解法抽提质粒进行酶切和PCR鉴定, 将阳性质粒命名为rPAd-518, 并通过化学方法转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中, -70 ℃保存, 备用。
3 结果
3.1 PCV-2 ORF2片段的PCR扩增结果
以抽提的PCV-2 DNA作模板, PCR扩增出了预期的目的条带, 见图1。
M.250 bp DNA Ladder Marker;1.重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-518;2.PCV-2细胞培养物;3.重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-518 KpnⅠ和 HindⅢ酶切鉴定;4.空白对照。
3.2 重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-518的鉴定结果
重组穿梭质粒rpShuttle-CMV-518测序结果与预期相符, PCR扩增出了预期片段。KpnⅠ及HindⅢ双酶切重组质粒, 出现了预期结果, 见图1。结果表明, 目的片段成功克隆到穿梭质粒上。
3.3 pAdeasy-1质粒转化E.coli BJ5183工程菌的鉴定结果
从E.coli BJ5183中抽提的pAdeasy-1质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后出现2条带, 见图2;HindⅢ酶切后出现8条带, 电泳能见到5条带, 见图3, 与预期相符。结果表明, 骨架质粒pAdeasy-1转化到E.coli BJ5183工程菌中并稳定存在。
M.λ/HindⅢ Marker;1.空白对照;2.BamHⅠ酶切鉴定;3.EcoRⅠ酶切鉴定;4.骨架质粒。
M.Wide Range DNA Marker (500～12 000 bp) ;1.HindⅢ酶切骨架质粒pAdeasy-1;2.骨架质粒pAdeasy-1。
3.4 重组质粒rPAd-518的鉴定结果
线性化的质粒rpShuttle-CMV-518转化BJ5183/p感受态菌后, 抽提质粒经PacⅠ酶切后, 出现明显的2条带, 见图4;以重组质粒rPAd-518作模板进行PCR电泳鉴定, 扩增出目的片段, 见图5。证明2种质粒发生了同源重组, PCV-2 ORF2片段插入到腺病毒骨架上。
M1.λ/HindⅢ Marker;1.重组质粒rPAd-518的PacⅠ酶切鉴定;2.重组质粒rPAd-518;3.PacⅠ酶切骨架质粒pAdeasy-1;4.空白对照;M2.250 bp DNA Ladder Marker。
M.DL-2 000 Marker;1.重组质粒的rPAd-518的PCR鉴定;2.骨架质粒pAdeasy-1的PCR鉴定。
4 讨论
腺病毒作为基因表达载体的研究起源于20世纪60年代初, 病毒学家观察到腺病毒基因组能承载异源性基因, 可插入外源基因进行表达。该载体系统有许多优越性:1) 腺病毒的感染宿主范围比较广泛, 包括分裂期和非分裂期的细胞;2) 插入外源基因片段比较大, 最大可插入7.5 kb;3) 腺病毒基因组较易操作, 易于制备大量病毒;4) 表达的蛋白与天然蛋白相似;5) 腺病毒颗粒比较稳定, 传代中基因组较少发生重排, 插入外源基因的病毒基因组可连续传代;6) 重组质粒转染293A细胞可以包装出腺病毒, 进行蛋白表达。
本试验通过摸索, 对腺病毒同源重组方法进行了改进。通过两步转化试验, 分别将穿梭质粒和骨架质粒转化到E.coli BJ5183中进行了同源重组。首先, 用CaCl2法把E.coli BJ5183工程菌制备成感受态细胞, 通过化学方法把骨架质粒转化到E.coli BJ5183感受态细胞中, 筛选出稳定的含有骨架质粒的E.coli BJ5183, 并制备出含有骨架质粒的E.coli BJ5183感受态细胞;其次, 把含有目的片段的重组穿梭质粒线性化后去磷酸化, 也用化学方法转化到含有骨架质粒的E.coli BJ5183感受态细胞中, 筛选出阳性菌, 用碱裂解法抽提质粒, 进行酶切鉴定, 确定获得重组质粒。因为E.coli BJ5183中含有recA重组酶, 所以重组质粒在其中不能稳定存在, 因此把重组质粒用化学方法转化到大肠杆菌DH5α工程菌中, 这不但有利于重组质粒的稳定存在, 也便于大量提取重组质粒。
骨架质粒和穿梭质粒间存在两种同源重组方式:一种是2种质粒的左臂与右臂之间的重组;另一种是发生在两者的ori与右臂同源序列间。本试验两者同源重组属第1种, PacⅠ酶酶切产生1条4 500 bp的条带 (若是第2种情况, 酶切后会产生1条3 000 bp的条带) 。本试验利用腺病毒载体系统, 通过两步化学转化的方法, 实现穿梭质粒和骨架质粒在E.coli BJ5183菌中同源重组, 成功地把PCV-2 ORF2片段插入腺病毒重组质粒中。该方法简单方便, 节省时间, 不需昂贵仪器, 在普通实验室均可以进行, 为国内相关实验室从事相关试验提供了一个很好的参考方法。
参考文献
[1]DANTHINNE X, IMPERIALE M J.Production of first generationade-novirus vectors:a review[J].Gene Ther, 2000, 7 (20) :1707-1714.
[2]NASZ I, ADAM E.Recombinant adenovirus vectors for gene therapyand clinical trials[J].Acta Microbiol Immunol Hung, 2001, 48 (3/4) :323-348.
[3]MIZUGUCHI H, KAY M A, HAYAKAWA T.Approaches for genera-ting recombinant adenovirus vectors[J].Adv Drug Deliv Rev, 2001, 52 (3) :165-176.
[4]HEHIR K M, ARMENTANO D, CARDOZA L M, et al.Molecularcharacterization of replication-competent variants of adenovirus vec-tors and genome modifications to prevent their occurrence[J].J Vir-ol, 1996, 70 (12) :8459-8467.
[5]GRAHAM F L, PREVEC L.Manipulation of adenovirus Vectors[M]//In:Murry EJ, ed.Gene transfer and expression protocols (Methods in Molecular Biology, Vol 7) .Clifton, NJ:Humana Press, Inc, 1991:109-128.
[6]HE T C, ZHOU S, Da COSTA L T, et al.A simplified system for gen-erating recombinant adenovirus[J].Proc Natl Acad Sci, 1998, 95 (5) :2509-2514.
[7]ZENG M, SMITH S K, SIEGEL F, et al.AdEasy system made easierby selecting the viral backbone plasmid preceding homologous re-combination[J].Bio Techniques, 2001, 31 (2) :260-262.
[8]陈陆, 杨霞, 王江辉, 等.猪圆环病毒2型 (PCV2) 河南分离株进化分析及ORF2基因的表达[J].农业生物技术学报, 2009, 17 (4) :561-566.
[9]J萨母布鲁克, D W拉塞尔.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂, 译.北京:科学出版社, 2002.
重组质粒 篇5
1 材料与方法
1.1 虫体DNA与主要试剂
牛新孢子虫基因组DNA, 延边大学预防兽医学实验室保存;pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、rTaq酶、X-gal等, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.2 引物的设计与合成
根据GenBank上登录的NcSRS2基因序列 (登录号为AF061249) 设计了1对特异性引物 (上海英骏生物技术公司合成) , 序列为上游引物P1 5′-CGGAATTCCATTAGGTTCGGAAACATGGC-3′ (下划线部分为EcoRⅠ酶切位点) ;下游引物P2 5′-GCTCTAGACGTGATCAGTACGCAAAGATTG-3′ (下划线部分为XhaⅠ酶切位点) 。
1.3 目的基因片段的扩增
以提取的牛新孢子虫基因组DNA为模板, PCR扩增体系 (25 μL) :模板DNA 1 μL, 10 pmol/L P1、P2各1 μL, 10×Buffer 2.5 μL, dNTP 2.5 μL, Taq DNA聚合酶0.25 μL, ddH2O 16.75 μL。反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 80 s, 共30个循环;72 ℃ 7 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 再用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物, 纯化的PCR产物于-20 ℃保存, 备用。
1.4 目的基因的克隆及鉴定
将回收的目的基因与克隆载体pMD18-T于4 ℃连接过夜, 转化大肠杆菌感受态细胞, 从含Amp的LB平板上挑选阳性克隆, 摇菌过夜后, 提取质粒DNA进行 PCR、双酶切鉴定。将PCR和酶切鉴定为阳性的克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 并用DNASis序列分析软件将目的基因与GenBank中发表的基因序列进行同源性比较。
1.5 pVAXⅠ-NcSRS2重组质粒的构建及鉴定
重组克隆质粒pMD-18T-NcSRS2与pVAXⅠ载体同时进行EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后, 用T4 DNA连接酶连接过夜, 转化至大肠杆菌感受态细胞, 从含Amp的LB平板上挑选阳性克隆摇菌, 过夜后提取质粒DNA进行 PCR和双酶切鉴定。
2 结果
2.1 目的基因片段的扩增结果
以提取的牛新孢子虫基因组DNA为模板, 经PCR扩增出大小为1 227 bp的目的基因片段 (见图1) , 与预期结果一致。
M.DL-10 000 Marker;1.NcSRS2基因PCR扩增产物;2.水对照。
2.2 重组pMD-18T-NcSRS2质粒的鉴定结果
以初步鉴定为阳性的重组克隆质粒为模板进行PCR扩增, 结果表明:扩增的片段与目的片段大小一致 (见图2) ;同时对重组克隆质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定, 出现与预期片段大小一致的2条目的条带 (见图3) 。测序结果表明, 亚克隆得到的牛新孢子虫NcSRS2基因片段大小为1 227 bp, 与GenBank中发表的NcSRS2 (登录号为AF061249) 核苷酸序列的同源性为99%。
1, 2.牛新孢子虫DNA PCR产物;3.PCR扩增水对照;4.pMD-18T-NcSRS2重组质粒PCR产物;M. DL-2 000 Marker。
M.DL-2 900 Marker;1, 2.pMD-18T-NcSRS2重组质粒;3, 4.pMD-18T-NcSRS2重组质粒酶切产物。
2.3 重组质粒pVAXⅠ-NcSRS2的鉴定结果
将双酶切的NcSRS2和pVAXⅠ真核表达载体连接, 提取重组质粒进行 PCR和酶切鉴定。结果表明, PCR扩增出1 227 bp的目的条带 (见图4) , EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切得到2 999 bp和1 227 bp的2条目的条带 (见图5) , 说明目的基因片段已成功地克隆到pVAXⅠ真核表达载体上。
1, 2.重组表达质粒pVAX1-NcSRS2的PCR扩增产物;3.水对照;4.空白对照;M.DL-2 900 Marker。
M1. DL-2 900 Marker;1, 2.重组表达质粒pVAX1-NcSRS2酶切产物;3, 4.重组质粒pVAX1-NcSRS2。
3 讨论
目前, 对犬新孢子虫的研究取得了长足的发展, 一些重要的功能基因得到了克隆, 如Nc-P36 (Nc-SAG1) 、Nc-P43 (NcSRS2) 等。有研究表明, NcSRS2表面蛋白主要是在速殖子和缓殖子阶段表达, 表达蛋白在介导虫体黏附和入侵宿主细胞的过程中发挥着重要作用, 而且该蛋白可作为ELISA试验中一种有效的抗原成分和新孢子虫疫苗的一种候选抗原[2]。
重组质粒的构建主要是进行亚克隆, 从原来的含有NcSRS2基因片段的质粒pMD-18T-NcSRS2获取目的基因片段, 然后插入表达载体pVAX1中。为了确定pMD-18T-NcSRS2和pVAX1连接的正确性, 在构建真核表达质粒前进行了鉴定, 从而使试验更为严谨。
目前, 常用核酸疫苗的表达载体有pVAXⅠ、pcDNA3、pIRES、pJW4303等, 这些表达载体均含有PCMV启动子, 但在质粒大小上存在差异, 其中以pVAXⅠ最小, 只有2 999 bp, 其他载体均在5 000 bp以上, 且pVAXⅠ是去除了pcDNA3上与其在大肠杆菌中复制无关的序列及其在真核细胞中表达外源基因无关的序列后改造而成的, 因此试验选择pVAXⅠ载体来构建NcSRS2基因真核重组质粒, 为牛新孢子虫NcSRS2基因核酸疫苗的研究奠定了基础。
参考文献
[1]王春仁, 鹿凌岩.一种新发现的原虫病:新孢子虫病[J].中国兽医杂志, 1997, 23 (8) :54-55.
重组质粒 篇6
1 材料和方法
1.1 主要试剂与材料
ExTaq酶购自Takara公司,病毒DNA提取液购自达安基因股份有限公司;硅胶膜型TMPCR产物纯化试剂盒购自赛百盛公司,质粒提取纯化试剂盒购自申能博采公司;质粒表达载体pGEX-4T-1和宿主菌JM109由本实验室保存;PVDF膜购自美国罗氏公司;单克隆抗体及多克隆抗体购自ViroStat公司,标记二抗购自KPL公司。
1.2 引物的设计与合成
根据HSV-2 g G编码基因(Us4)基因序列(Genbank中NC_001798),针对该片断的免疫优势表位区,用Primer Premier5.0软件设计特异性引物序列如下:上游引物P1:5'-CGGAATTCCTTCGGCAG TATGGAGGGTGTC-3';下游引物P2:5'-CGCTCGAG TGGGTGCGTCTTTGGGT-3'。其中在上游引物中增加一个EcoRI酶切位点(下划线部分),在下游引物中增加一个Xho I酶切位点。由上海生工生物技术服务有限公司合成。
1.3 模板DNA的制备
用棉签蘸取门诊确诊的生殖器疱疹患者(血清HSV-2 IgG、HSV-2 IgM阳性,疱液HSV-2 DNA荧光定量PCR拷贝数在6.08×106以上)的疱液,用病毒DNA提取液提取HSV-2 DNA(按说明书操作),-20℃保存备用。
1.4 P CR扩增及切胶纯化
PCR扩增体系为50μL,含有上下游引物终浓度各0.2μmol/L,d NTPs终浓度200μmol/L,10×Buffer for Ex Taq 5μL,模板2μL,ExTaq酶1.25U,灭菌去离子水补足50μL。按照94℃变性50 s,60℃退火1 min,72℃延伸1.5 min的程序扩增30个循环。用1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物,凝胶成像系统观测并记录结果。在长波紫外灯下切下目的条带,用硅胶膜型TMPCR产物纯化试剂盒提纯目的DNA。
1.5 重组质粒的构建及鉴定
将目的基因与质粒表达载体pGEX-4T-1连接,并转化宿主菌DH5α。用申能博采质粒提取试剂盒提取并纯化重组质粒,PCR初步鉴定后,委托上海博亚公司完成序列测定。
1.6 目的基因的表达及免疫印迹鉴定
将重组阳性菌在37℃下培养至A=0.4～0.6,加诱导剂IPTG至终浓度1.0 mmol/L,诱导目的基因表达,同时以空载质粒菌、重组前的质粒菌及无IPTG诱导重组质粒菌作为阴性对照;分别在诱导1、2、3 h时收获菌株后用SDS-PAGE上样缓冲液处理。表达产物经SDS-PAGE电泳分离后,电转至PVDF膜上,用鼠抗HSV-2 g G片断的Mc Ab及羊抗HSV-2多克隆抗体检测目的蛋白的特异性及免疫反应性。具体方法见文献[9]。
2 结果
2.1 特异的rFgG-2基因的扩增
对患者疱液HSV-2基因组用特异性引物PCR扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测。产生的目的基因片断在1 242 bp左右,与预期结果相符,初步证实该引物可特异地扩增出免疫优势表位片断,见图1。
2.2 重组质粒的鉴定
在Amp平板上挑取单克隆菌落,对提取的质粒用PCR鉴定,扩增出一条长1 242 bp的目的基因片断。表明该质粒为插入g G-2片断的阳性重组子,见图2。
2.3 rFgG-2蛋白的S DS-P AGE电泳分离及免疫原性鉴定
与空载质粒菌、重组前的质粒菌及诱导前的重组质粒菌比较,诱导后重组质粒菌在分子量约66.2kD处出现颜色很深的特异性蛋白条带,与预测的大小相符,见图3。对该产物进行免疫印迹检测,非诱导表达条件下的表达产物未见与Mc Ab反应条带;而在诱导产生的rFgG-2蛋白与Mc Ab及多克隆抗体均出现明显的反应条带,见图4、图5。表明诱导表达的rFgG-2与Mc Ab及多克隆抗体具有良好的免疫原性和免疫反应性。
3 讨论
单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染可检测型特异的病毒抗原、病毒DNA和型特异的HSV抗体而进行实验诊断。由于多数HSV-2感染无症状。因此,检测HSV-2特异抗体在HSV-2感染的诊断中尤其重要。
单纯疱疹病毒糖蛋白G(g G)基因是HSV-1与HSV 2型间差异最大的一个糖蛋白基因,是抗HSV体液免疫应答的主要靶位。因此,可作为HSV型特异性血清学诊断的标准抗原。LILJEQVIST[10]等人利用纯化的分泌型g G-2(sg G-2)得到4种单克隆抗体,结果发现这四种单克隆抗体识别的抗原表位为线性抗原表位,位于sg G-2的羧基端。这提示sg G-2具有HSV-2型特异性,可用于血清分型诊断。因此,本研究根据HSV-2-g G的氨基酸序列克隆免疫优势表位片段,构建含有目的基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-g G),以此来提高蛋白抗原的免疫原性与特异性;表达的重组蛋白用于HSV抗体的检测,可减少假阳性结果的出现,达到早期诊断、早期治疗的目的。
pGEX-4T-1是一种可以高效地表达插入的外源基因并带有tac启动子的融合蛋白表达载体。本研究表达的HSV-2 g G重组蛋白融合有载体上的GST(glutathione s-transferase)蛋白,但GST蛋白并不影响目的蛋白的抗原性与特异性,这为HSV-2-g G/GST融合蛋白的大量制备纯化与进一步研究奠定了基础。对于该段蛋白的纯化,与其他抗原的比较,与Ⅰ型疱疹病毒或其他病毒抗体是否有交叉反应及其免疫检测试剂的研制,有待于进一步的研究。
摘要：目的通过基因工程技术,构建含有目的基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-gG)。方法用PCR技术扩增HSV2-gG基因的免疫优势表位片断;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果PCR法扩增出1242bp的DNA片断;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1242bp的DNA片断。SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论重组质粒HSV2-gG-pGEX-4T-1的成功构建及表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础。
关键词：HSV-2-gG,重组质粒,基因表达
参考文献
[1]张学军.皮肤性病学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2004:222.[1]ZHANG XJ.Dermatology and Venereology[M].6th ed.Beijing:People's Medical Publishing House,2004:222.Chinese
[2]Sexually transmitted diseases treatment guidelines2002.Centers for disease control and prevention[J].MMWR Recomm Rep,2002,51:1-78.
[3]IKOMA M,LILJEQVIST JA,GROEN J,et al.Use of a fragment of glycoprotein G-2produced in the baculovirus expression sys-tem for detecting herpes simplex virus type2-specific antibodies[J].J Clin Microbiol,2002,40:2526-2532.
[4]GRABWSKA AM,JENNINGSUN R,LIANG P,et al.Im-munhtion with phage displaying peptides representing single epi-topes of the glycoprotein G cangive rise to partial protectve im-munity to HSV-2[J].Virol,2000,269:47-53.
[5]MARSDEN HSK,MURRAY,MJ SMITH IW.Identification of an immunodominant sequential epitope in glycoprotein G of herpes simplex virus type2that is useful for serotype-specific diagnosis[J].J.Med.Virol.,1998,56:79-84.
[6]LILJEQVIST JAE,TRYBALA B,SVENNERHOLM S,et al.Lo-calization of type-specific epitopes of herpes simplex virus type2glycoprotein G recognized by human and mouse antibodies[J].J.Gen.Virol.,1998,79:1215-1224.
[7]GRABOWSKA,A.,C.JAMESON,P.LAING,S,et al.Identifi-cation of typespecificdomains within glycoprotein G of herpessimplex virus type2(HSV-2)recognized by the majority of pa-tients infected with HSV-2,but not by those infected with HSV-1[J].J.Gen.Virol.,1999,80:1789-1798.
[8]PARKES DL,SMITH CM,ROSE JM,et al.Seroreactive recom-binant herpes simplex virus type2-specific glycoprotein G[J].J Clin Microbiol,1991,29(4):778-781.
[9]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW,著.黄培堂,译.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学技术出版社,2002:8.[9]SAMBROOK J,RUSSELL DW,editor in chief.Huang peitang,translated.Molecular Cloning[M].3rd ed.Beijing:Science and Technology Publishing House,2002:8.Chinese
重组质粒 篇7
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
pc DNA3.1-Hsp70/CD80真核表达质粒为本实验室前期构建保存,质粒p VAX1、感受态细胞E.coliDH5α购于Invitrogen公司,人胚肾细胞293T细胞购于中国科学院细胞库,SPF级雌性健康BALB/c小鼠20只购自第三军医大学[合格证号SCXK(渝)2007-0003],限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ、T4连接酶购自New England Biolabs,DNA胶回收试剂盒购自大连宝生物公司,Endofree Plasmid Giga Kit购自Qiagen公司,Lipofectamine LTX and Plus Reagen购于Invitrogen公司,鼠抗结核杆菌Hsp70单克隆抗体购自Lifespan Biosciences公司,鼠抗人CD80单克隆抗体购自Abcam公司,Western blot试剂购自上海碧云天生物公司,总RNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京天根生化科技有限公司,Ta Ka Ra RNA PCRKi(tAMV)Ver.3.0购自大连宝生物公司;Sso Fast Eva Green Supermix购自Bio-Rad公司,BIO-ROD核酸蛋白成像仪,i Cycler iQ Real-time PCR扩增仪。
1.2 方法
1.2.1重组质粒p VAX1-Hsp70/CD80的构建与鉴定HindⅢ和XbaⅠ酶切既往构建的质粒pc DNA3.1-Hsp70/CD80和载体PVAX1,将目的基因Hsp70/CD80定向连接入已酶切p VAX1中,构建质粒p VAX1-Hsp70/CD80,酶切鉴定后由上海生工生物工程有限公司进行测序。将p VAX1-Hsp70/CD80质粒转化入DH5α。用QIAGEN公司去内毒素级质粒大量提取试剂盒,按说明书提取纯化的质粒DNA。
1.2.2 p VAX1-Hsp70/CD80体外瞬时表达收集对数生长期的293T细胞,接种于6孔细胞培养板,使细胞汇合度达到50%~80%时,按LipofectamineLTX and Plus Reagen转染试剂说明书进行转染。分别于转染后24、48和72 h收获细胞,加入裂解液释放蛋白质,离心取上清,与5×上样缓冲液混匀并煮沸使蛋白质变性。SDS-page电泳,转膜。分别加入Hsp70、CD80一抗4℃孵育过夜,洗膜后二抗孵育1 h,加入化学发光试剂置于核酸蛋白成像仪成像。
1.2.3 p VAX1-Hsp70/CD80体外稳定表达转染后培养24 h,按1×104个 / 孔接种于96孔细胞培养板,并进行有限稀释。培养24 h后加入1 000 mgG418筛选。筛选10~14 d后,有大量细胞死亡,可见有抗性的克隆出现,以500 mg G418维持,扩增培养。获得的稳定转染细胞系命名为293T-HSP70/CD80。Western blot检测Hsp70、CD80蛋白表达。方法同上。
1.2.4动物实验近交系BALB/c小鼠20只,饲养于独立通风换气笼具(individually ventilated cages,IVC)中。动物按注射时间分为7 d组、15 d组、30 d组、180 d组,共5组(每组3只)。7 d组、15 d组、30 d组和180 d组小鼠股四头肌分别注射p VAX1-Hsp70/CD80质粒和7.5 g/L布比卡因混悬液(4∶1)125μl,含质粒100μg,注射125μl生理盐水代替。对照组小鼠分别于注射后7、15、30和180 d处死,并取眼球血以及肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织冷冻储存 -80℃备用。
1.2.5 RT-PCR检测Hsp70和CD80在小鼠体内的表达从肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织中提取RNA,按总RNA提取试剂盒说明书进行操作。按Ta Ka Ra RNA PCR Kit说明书制备c DNA模板,并进行PCR反应。引物序列:HSP70上游引物CGTCGTCTCGGTTCTGGAAGGTG,下游引物CATTGAAGTAGGCGGGCGTCGTG;CD80上游引物ACACGGAGGCAGGGAACATCACC,下游引物TGGGCGCAGAGCCAGGATCACA。PCR结果行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.6Real-time PCR检测小鼠 脾脏组织 中IFN-γ和IL-4表达从脾脏中提取总RNA,逆转录制备c DNA。进行Real-time PCR反应。引物序列:IFN-γ上游引物:AACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG,下游引物:GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG;IL-4上游引物:TTTTGAACGAGGTCACAGGAGAGG,下游引物:CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG;β-actin上游引物:AGGGTGTGATGGTGGGAAT,下游引物:CTCGGTGAGCAGCACAGG。反应完成后用Bio-Radi Q5软件进行分析,按照Pfaffl法计算相对表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间差异用方差分析,以P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒 p VAX1-Hsp70/CD80 构建与鉴定
经内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切前后的琼脂糖电泳,电泳结果符合预期,表明其建立成功。见图1。送上海生工生物工程有限公司测序后证实该质粒构建成功。
2.2 Western blot 检测 p VAX1-Hsp70/CD80 转染
293T细胞的蛋白质真核瞬时表达和稳定表达结果见图2,转染24、48、72 h后稳定转染293T细胞均有33和72 k D左右的蛋白表达;转染前293T细胞无表达。
2.3 p VAX1-Hsp70/CD80 m RNA 体内表达分布
RT-PCR检测接种7和15 d肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织均有Hsp70和CD80表达。接种30 d肌肉、肺和肝有Hsp70表达,未见CD80表达。180 d均未检测出Hsp70/CD80表达,见图3。
2.4 Real time PCR 检测 IFN-γ 和 IL-4 基因表达
结果显示,注射p VAX1-Hsp70/CD80质粒7和15 d后IFN-γ有高水平表达,且高于对照组(P <0.05)。注射p VAX1-Hsp70/CD80质粒180 d后IFNγ基因表达降低,与对照组比较差异无统计学意义。见图4。
3 讨论
分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)包含多个T细胞和B细胞表位,可激活效应细胞产生免疫应答,具有免疫优势抗原的特点。还具有结合和呈递抗原肽的作用,能够干扰多种细胞内炎症信号通路,从而抑制炎症反应[6],调节机体的免疫平衡[7]。CD80(B7-1)表达于活化的B、T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞及外周血单核细胞,具有免疫活化功能,是重要的共刺激分子之一。CD80与其共刺激配体CD28和 / 或CTLA-4是活化T淋巴细胞时的刺激因子,在体液免疫和细胞免疫中发挥重要的全面活化作用[8]。有研究表明[9],CD80与其配体CTLA-4结合会对致敏过程中变应原特异性调节性T细胞产生抑制作用。本实验中,将拼接的结核杆菌HSP70和人CD80编码基因定向连接于p VAX1中,经酶切和测序鉴定构建质粒p VAX1Hsp70/CD80成功。应用阳离子脂质体介导法将重组质粒p VAX1-Hsp70/CD80转染入293T细胞,经G418筛选后,获得阳性克隆,通过Western blot鉴定,证实Hsp70和CD80在该细胞水平均有表达。
重组质粒 篇8
EB病毒(epstein-barr virus,EBV)是一种广泛存在的人类疱疹病毒,与鼻咽癌有密切关系[2]。大量研究结果证实,EB病毒是鼻咽癌的重要诱发因子[3]。目前已知由EB病毒基因组编码的抗原主要包括早期抗原(EA)、壳抗原(viral capsid antigens,VCA)、膜抗原(MA)、核抗原(EBNA)、潜伏膜蛋白(LMP)、ZEBRA等。其中EBV VCA抗原是NPC的重要诊断抗原,而目前针对NPC患者的VCA-Ig A抗体的相关靶抗原分子仍无法充分定位,因此利用DNA重组技术寻找理想的基因工程EBV VCA抗原用于制备诊断试剂,是临床诊断EBV感染的迫切需要[4]。E-BV BLRF2基因位于编码MA的BLLF1开放读码框架之前,全长489 bp(76637~77125),为晚期启动子所调控,编码一种分子量为23 k D的VCA蛋白质,且其氨基酸序列与其他疱疹病毒没有显著的同源性,可望成为新一代的诊断抗原,用于人群中EB病毒感染的血清学诊断。此外,毕赤酵母表达系统具有高效、稳定、易于操作等特点,在大规模生物制品生产中占据非常重要的优势,是近年来发展最具潜力的真核表达系统[5,6]。
本实验应用聚合酶链式反应(PCR)扩增出EB病毒BLRF2基因片段,并插入到毕赤酵母表达载体p PICZαA中,成功构建重组表达质粒p PICZαA-BLRF2,并用毕赤酵母成功表达了P23重组蛋白,为进一步研制新型诊断试剂及亚单位疫苗奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自Takara公司;巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC ZαA均由笔者实验室保存;B95-8细胞株由中山大学附属肿瘤医院馈赠;限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ、Taq DNA聚合酶、d NTP、Mg Cl2、T4 DNA连接酶均为Formentas公司产品;细胞基因组DNA提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒及Access RT-PCR试剂盒(Promega公司);质粒提取试剂盒(Roche);抗生素Zeocin(美国Invitrogen公司);蛋白胨及YNB购自Difco公司;引物合成和DNA序列测定均由Invitrogen公司完成;PCR仪(美国MJ Research PTC200);凝胶成像分析系统(美国UVP GDS-8000);电穿孔仪(美国Bio-Rad);菌体生长培养基(BMGY)、甲醇诱导表达培养基(BMMY)均依据美国Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression Kit配制;其他常用试剂为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计
采用引物设计软件Primer primer5.0设计引物,在上下游引物中分别引入Eco RⅠ和XbaⅠ限制性内切酶识别位点及保护碱基。其正义链引物(P1)序列:5'-GTCGAATTCATGTCAGCTC-CACGCAAAGTC-3';反义链引物(P2)序列:5'-GTCT CTAGATAATCAGAAATTTGCACTTTC-3'。
1.2.2 EB病毒DNA获取及目的DNA扩增
B95-8细胞用含10 g/L胎牛血清(FBS)、100 u/m L青霉素和100μg/m L链霉素的RPMI-1640培养液,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培养。取对数增殖期的细胞提取全基因组DNA做为模板,PCR扩增489bp的BLRF2基因。
1.2.3 重组酵母表达载体的构建及转化后酵母菌表型鉴定
将PCR产物插入p PICZαA载体构建p PICZαA-BLRF2,酶切电泳及DNA序列分析鉴定重组质粒,具体操作见相关公司手册。重组质粒p PICZαA-BLRF2经SacⅠ线性化,电穿孔法转导酵母菌GS115(mut+,His-),涂菌于含100μg/m L ZeocinTMYPDS平板上,30℃培养3~10 d。挑取其中15个转化子,PCR法筛选阳性重组子,并使用MMH和MDH平板筛选mut+表型。
1.2.4 重组酵母菌株的诱导表达
将经筛选为阳性的重组酵母菌株接种于BMGY液体培养基中,30℃(250 r/min)振摇培养约16~18 h,当600 nm吸光度(A)值A600=2~6时离心收获细胞,并重悬于BMMY液体培养基中,30℃(250 r/min)振摇培养,每24 h补充甲醇到终浓度为0.5%诱导表达。在开始诱导表达后的12、24、48、72和96 h各时间点分别取样1 m L于1.5 m L EP管中离心,分离培养上清。同时提取以上各时间点的酵母菌的总RNA,按照Access RT-PCR试剂盒说明书操作,逆转录成c DNA并以P1/P2为引物进行PCR反应,并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.5 重组蛋白P23的鉴定
将上述经鉴定表达量最高时间点收集的上清液经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,转移至PDVF膜上,3%的脱脂牛奶封闭,加入EBV阳性血清,4℃孵育过夜后,加入HRP标记的羊抗人Ig G(Chamicon公司),化学发光显色。同法检测空质粒转化酵母的表达产物作为对照。
2 结果
2.1 目的片段的PCR扩增
以EBV DNA为模板扩增,PCR产物凝胶电泳在250~500 bp之间出现1条特异性条带,与预期的片段大小489 bp相同(见图1)。
1:BLRF2基因扩增产物;M:DL2000 DNA Marker
2.2 重组质粒的构建和鉴定
目标片段及质粒进行酶切和连接,连接产物转化的平板中能筛选到大约30~60个重组子。挑取10个菌落以PCR进行初步鉴定,由图2可见1~10号菌落初步鉴定为重组质粒阳性菌落。将阳性克隆扩大培养,抽提质粒并凝胶电泳(见图3),在图中能够清晰地分辨出重组质粒单酶切后琼脂糖电泳显示,酶切条带在3 000~4 500 bp之间,与载体加上目的片断之和(4.1 kb)序列大小一致;重组质粒双酶切后的大片段与空载体双酶切产物片段的迁移速率一致,而小片段与PCR产物的迁移速率一致。基本上可以确定重组的质粒中含有所需的目的片段。重组质粒测序结果证实,BLRF2基因正确插入到酵母表达载体p PICZαA的Eco RⅠ和XbaⅠ位点之间,密码子阅读框准确无误,该重组质粒构建成功。
2.3 重组质粒转化的毕赤酵母菌Mut表型的鉴定
重组质粒转化毕赤酵母并行PCR鉴定(见图4),通过PCR鉴定发现除8号菌落为阴性菌株外,其他转化子均为阳性菌株。将鉴定为阳性的毕赤酵母菌及Mut+、Muts标准菌株的培养液,分别点种在MMH和MDH固体培养基上,于30℃培养2 d后,观察菌落的生长状况。结果显示,11个重组质粒转化的毕赤酵母菌为Mut+表型。
2.4 目的基因在毕赤酵母菌中的表达及RT-PCR检测
产物电泳结果显示,在甲醇诱导后的第12、24、48、72和96 h,均有目的基因m RNA的表达,于第72 h达到高峰;而空载体转化的毕赤酵母菌在甲醇诱导后各时间点均未检出目的基因m RNA的表达(见图5)。
2.5 重组P23蛋白的鉴定
重组有p PICZαA-BLRF2的酵母菌株GS115经诱导表达后在培养基中可检测到大小约为23 k D的蛋白(见图6),这与P23蛋白的分子量大小相符,同时将整合有空质粒的酵母细胞诱导表达作为阴性对照,在其培养基中未检测到相应大小的条带。Immunoblot显示在Mr为23×103处出现1条特异性带,与预测的BLRF2重组蛋白的-Mr相符(见图7)。
1~10:平板中单克隆菌落的菌液PCR结果;11:基因组DNA为模板的阳性对照;12:未加模板的阴性对照;M:DL 2 000 DNA Marker
M:250 bp DNA Ladder Marker;1:p PICZαA-BLRF2重组质粒XbaⅠ单酶切;2:p PICZαA-BLRF2重组质粒Eco RⅠ/XbaⅠ双酶切;3:p PICZαA空质粒双酶切;4:BLRF2基因的PCR扩增产物
M:250 bp DNA Ladder Marker;1~8,10~16:平板中单克隆菌落的菌液PCR结果;9:未加模板的阴性对照;17:基因组DNA为模板的阳性对照
M:DL 2 000 DNA Marker;1~5:重组质粒转化的酵母菌裂解液的RT-PCR产物(甲醇诱导12、24、48、72和96 h);6~10:空质粒转化的酵母菌裂解液的RT-PCR产物(甲醇诱导12、24、48、72和96 h)
M:Protein Marker sm1841;1:表达的p PICZαA-BLRF2/GS115培养上清;2:表达的p PICZαA/GS115培养上清
1:表达的p PICZαA-BLRF2/GS115培养上清;2:表达的p PICZαA/GS115培养上清
3 讨论
EB病毒为疱疹病毒科γ病毒属的成员之一,与多种疾病的发生有关,尤其与鼻咽癌关系密切。EB病毒的血清学检测作为NPC的辅助诊断手段,在提高NPC的诊断率及早期发现率方面发挥了重要作用。现临床上往往同时检测针对EB病毒不同抗原的多种抗体,如VCA抗体、EA抗体和EBNA抗体。但目前这些抗原所建立的ELISA检测方法灵敏度、特异性等方面尚不尽人意。为此,寻找灵敏度高、特异性强的抗原来筛查和诊断鼻咽癌成为当前迫切需要解决的问题。
大量研究证实,NPC患者的VCA抗体的消长与疾病的发生发展密切相关,因此VCA抗体对NPC的诊断有较高的价值。但VCA家族结构复杂,目前已知的与抗原性有关的抗原主要包含大分子量的衣壳蛋白P150(Bc LF1)、糖蛋白gp125(BALF4)和包膜蛋白P143(BNRF1)以及小分子量的P18(BFRF3)、P40(Bd RF1)和P23(BLRF2)。大分子量蛋白表达困难,相关研究报道较少,而小分子量VCA蛋白因其易于表达,在基因工程抗原的制备中备受青睐。P23由BLRF2基因编码,属于VCA类蛋白,在EB病毒复制过程中P23的表达介于EA和VCA之间。HINDERER等[7]已证实P23可以在原核表达系统中进行表达,但原核表达系统尚存在蛋白翻译后修饰体系不完善、提取纯化效率低、表达产物的生物活性较低等难以克服的缺陷[8]。而笔者实验采用的是巴斯德毕赤酵母表达系统,作为目前应用最广的表达系统之一,具有可进行类似哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰,其表达的重组蛋白具有同天然蛋白相识的生物学功能,以及极少分泌自身蛋白、更利于分离与纯化等优势,已逐渐取代原核系统应用于多种病毒抗原的外源蛋白的表达[9,10]。
笔者实验室已应用该表达系统成功表达多种乙肝病毒抗原及EB病毒抗原,在理论和技术上都十分成熟并取得一定成果。如李朝霞等[11]成功构建了p PIC9-c Ag重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBc Ag。胡波等[6]利用毕赤酵母系统获得在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的p PICZa-BALF4(s)生产酵母工程菌株。
研究采用基因工程技术,以编码EBV衣壳蛋白P23的BLRF2作为目的基因,选用毕赤酵母表达载体p PICZαA构建了P23的真核表达载体,电转入毕赤酵母菌中并用甲醇诱导表达目的重组蛋白,经Western blotting证实P23蛋白成功表达,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的p PICZαA-BLRF2生产酵母工程菌株,为下一步制备新型特异诊断试剂提供了条件,并为进一步研制EB病毒基因工程亚单位疫苗打下了基础。
摘要：目的 构建pPICZαA-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础。方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定。结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白。结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZαA-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础。
关键词：EB病毒,重组蛋白,分泌表达,毕赤酵母
参考文献
[1]曾希,王承龙.鼻咽癌血清EB病毒IgA检测的临床分析[J].中国现代医学杂志,2010,20(6):879-885.[1]ZENG X,WANG CL.Clinical analysis of serum EBV-VCA-IgAin NPC patients[J].China Journal of Modern Medicine,2010,20(6):879-885.Chinese
[2]LO KW,TO KF,HUANG DP.Focus on nasopharyngeal carcino-ma[J].Cancer Cell,2004,5:423-428.
[3]THORLEY-LAWSON D.EBV the prototypical human tumorvirus-just how bad is it[J].J Allergy Clin Immunol,2005,116(2):251-261.
[4]NYSTAD T,MYRMEL H.Prevalence of primary versus reacti-vated Epstein-Barr virus infection in patients with VCA IgG,VCA IgM and EBNA-1-antibodies and suspected infectiousmononucleosis[J].J Clin Virol,2007,38(4):292-297.
[5]MACAULEY-PATRICK S,FAZENDA ML,MCNEIL B,et al.Heterologous protein production using the Pichia pastoris expres-sion system[J].Yeast,2005,22:247-270.
[6]胡波,李朝霞,盛平,等.EB病毒VCA基因片段在毕赤酵母中的表达及临床应用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2010,30(4):365-370.[6]HU B,LI ZX,SHENG P,et al.Expression of VCA genes ofEpstein-Barr virus in Pichia pastoris and clinical application[J].Chin J Microbiol Immunol,2010,30(4):365-370.Chinese
[7]HINDERER W,LANG D,ROTHE M,et al.Serodiagnosis ofEpstein-Barr virus infection by using recombinant viral capsidantigen fragments and gene fusion[J].J Clin Microbiol,1999,37:3239-3244.
[8]文淑萍,刘霆,陈玉祥,等.毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段[J].中国现代医学杂志,2005,15(12):1820-1827.[8]WEN SP,LIU T,CHEN YX,et al.Expression in pastoris ofN-terminal fragment of human bactericidal/permeability increas-ing protein[J].China Journal of Modern Medicine,2005,15(12):1820-1827.Chinese
[9]TRINH LB,PHUE JN,SHILOACH J.Effect of methanol feedingstrategies on production and yield of recombinant mouse endo-statin from Pichia pas toris[J].Biotechnology&Bioengineering,2003,82(4):438-444.
[10]吴学敏,单颖,李华,等.pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建[J].中国现代医学杂志,2009,19(18):2773-2779.[10]WU XM,SHAN Y,LI H,et al.Construction of Pichia pastorisexpression vector pGAPZ A/HD5[J].China Journal of ModernMedicine,2009,19(18):2773-2779.Chinese