抗菌肽制剂

抗菌肽制剂（精选七篇）

抗菌肽制剂 篇1

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验在浙江台州市富越农庄猪场进行。试验用母猪品种为长白与大白二元杂交种, 共计508头, 仔猪品种为上述母猪与杜洛克种公猪杂交所产杜长大三元杂交种, 共产生5 245头猪仔。试验期间所有母猪和仔猪按正常的免疫程序进行疫苗接种, 并按常规方式进行管理。

1.2 试验设计

试验采取随机分组设计, 其中试验组母猪共计251头, 其所分娩的共计2 415头仔猪作为仔猪试验组;对照组母猪257头, 其所分娩的共计2 340头仔猪作为仔猪对照组。试验所用抗菌肽制剂为深圳圣西马生物技术有限公司自主研制开发的抗菌肽粉剂, 商品名为“汉特150S”的用于母猪, 商品名为“汉特150”的用于仔猪, 抗菌肽效价为400 U/g。抗菌肽基因来源于海洋生物柄海鞘和药用植物美洲商陆。按3‰的比例将汉特150S添加到试验组母猪日粮中, 从配种开始使用;对试验组仔猪也按3‰的比例将汉特150添加到仔猪的饲料中, 从7日龄教槽开始添加直到保育舍出栏。试验期间试验组母猪饲料中不添加任何抗生素, 仔猪在断奶开始到断奶后7 d每吨饲料配合使用500 g利高霉素。对照组的母猪及其所产的仔猪按该猪场原有的预防用药方案, 在饲料添中加常规剂量抗生素 (母猪在产前产后饲料添加利高霉素1 000 g/t、阿莫西林300 g/t;母猪群每月第1周加磺胺-6-甲氧嘧啶、TMP和泰乐菌素进行日常保健用药) 。

1.3 观测指标

在整个试验期间, 观察试验猪群和对照猪群的母猪和仔猪的健康状况, 包括皮肤、被毛和眼分泌物。并记录母猪分娩的死胎数、仔猪试验期间的死亡头数, 进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽制剂对母猪生产性能的影响

在整个试验期间, 试验组和对照组的母猪发病情况无明显差异。但与对照组相比, 试验组母猪皮肤红润干净, 被毛短而整齐光亮, 眼睛清亮有神, 眼角无明显分泌物。在母猪饲喂抗菌肽饲料添加剂汉特150S后各组母猪活仔与死胎数目 (其中死胎又分为木乃伊死胎和新鲜死胎) 的统计结果见表1。可以看出, 使用抗菌肽组母猪死产率仅为5.77%, 而对照组的死产率为12.75%, 明显高于试验组。比较死胎中木乃伊死胎所占的比例发现, 使用抗菌肽作为添加剂的试验组所产的2 563头仔猪中仅有8头为木乃伊胎, 木乃伊死胎率仅为0.31%, 而使用抗生素作为饲料添加剂的对照组有192头为木乃伊死胎, 木乃伊死胎发生率达到7.16%, 为试验组的23倍。

对145头初产母猪饲喂汉特150S, 比较添加剂的使用期限对死胎发生情况的关系。结果发现, 母猪分娩的死胎数随着抗菌肽制剂使用时间的延长而明显下降, 连续使用5周以后, 母猪死胎率降到几乎为零, 而对照组初产母猪的死胎率为10%。

2.2 仔猪断奶前及保育阶段死亡情况

对母猪和新生仔猪分别全程使用抗菌肽饲料添加剂汉特150S和汉特150以后, 与对照组相比, 其试验组的仔猪生长的整齐度明显好、皮毛光亮、精神状态佳, 说明抗菌肽制剂具有综合提高猪只免疫力的功效。

从表2可以看出, 在哺乳阶段, 试验组的死亡率仅为0.34%, 而对照组的死亡率为2.35%, 为试验组的7倍。在保育阶段, 试验组的死亡率为1.31%, 而对照组的死亡率为3.65%, 其死亡率为试验组的近3倍。

3 结论与讨论

母猪分娩死胎的发生往往与怀孕母猪的健康状况有直接关系。而仔猪出生后, 由于环境变化甚大, 所以在出生后其死亡率甚高。根据国外研究人员统计, 在出生全部的仔猪中, 有30%~50%的仔猪是在断奶前夭折的[6]。因此, 提高母猪和仔猪的整体健康水平可以大大提高活仔率和新生仔猪成活率。该试验研究表明, 添加抗菌肽的分娩母猪所产死仔数显著减低, 同时所产仔猪成活率明显高于以抗生素作为添加剂的分娩母猪, 可见抗菌肽制剂能极大地提高规模化猪场养猪生产的经济效益, 提高猪群的健康水平。

抗菌肽和干扰素、补体一样是机体自身非特异性天然防御系统组成体系的重要成分之一。当机体受到病原微生物入侵时, 能迅速产生抗菌肽来杀伤入侵者, 同时也能加速免疫和伤口愈合过程。由于抗菌肽能充分激活机体的免疫反应, 所以其表现的综合防病抗病效果远非一般抗生素所能达到。试验结果表明, 使用抗菌肽制剂可以成倍地降低母猪分娩死胎率和提高哺乳及保育阶段仔猪的成活率, 说明抗菌肽制剂很可能通过调节猪体的免疫系统而显著提高母猪及仔猪健康的状况[7]。

研究发现, 相比普通抗生素, 抗菌肽的“抗菌谱”更广, 除了抗细菌外, 有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞 (对癌细胞的选择性作用可能与其细胞骨架的改变有关) , 目前在猪病临床上, 多病因混合感染的现象非常普遍, 如抗菌肽作用的广泛性可能也是能显著提高猪群健康水平的原因之一。

摘要：研究抗菌肽制剂对猪群生产性能与健康水平的影响, 结果表明:添加抗菌肽制剂的母猪试验组死产率为5.77%, 按日常用药方案使用抗生素的对照组死产率为12.75%;其中试验组木乃伊胎的死产率仅为0.31%, 对照组却达到7.16%。添加抗菌肽制剂的试验组仔猪在哺乳期和保育期的死亡率分别为0.34%、1.31%, 同期对照组分别为2.35%、3.65%;对照组死亡率显著高于试验组。可见抗菌肽制剂能显著降低母猪的死产率与提高仔猪的成活率与猪只的生产性能和健康水平。

关键词：抗菌肽,猪,死产率,成活率

参考文献

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鸡小肠抗菌肽的抗菌活性研究 篇2

1 鸡小肠抗菌肽的提取纯化

1.1 鸡小肠抗菌肽粗制品的提取

鸡的肠黏膜取自本实验室饲养的60日龄海兰蛋鸡。取新鲜小肠, 去脂、浆膜和内容物, 称重, 冷冻剪碎, 组织捣碎机捣碎3次, 2~5min, 再用超声波细胞粉碎机破碎10次, 5s/次。匀浆后, 隔水煮沸15min, 然后冰水浴, 使其迅速冷却, 按1:1 (V/V) 加入5%乙酸, 于4℃条件下搅拌浸提24h。次日, 将混合物于4℃条件下, 8000rpm离心30min, 取上清, 4℃保存。将沉淀物用等体积5%乙酸混合, 再次于4℃条件下搅拌浸提24h, 重复上述离心过程, 取上清, 合并2次上清液, 调整p H为7.0, 再次离心, 弃沉淀, 上清液即为抗菌肽粗制品。

1.2 样品除酸、浓缩

将上步所得的上清液注入透析袋 (MWCO为3500Da) 中, 扎紧袋口, 然后将其放入烧杯, 再向烧杯中倒入去离子水, 去离子水液面要超过透析袋, 4℃下透析除酸, 每12h换水一次, 直至透析袋外去离子水p H值大于6.0, 此时, 将透析袋放入瓷盘中, 撒上PEG-20000, 透析浓缩约3~4h后即可将透析袋取出, 将浓缩的溶液取出低温冻干, 转移至灭菌的青霉素小瓶中, 密封-20℃保存。

2 抗菌活性的检测

2.1 菌种的复苏

将已灭菌的琼脂培养基趁热倒入直径9cm培养皿中, 每个培养皿15.0m L, 凝固后放入37℃恒温培养箱培养12h, 检查有无菌落生成, 剔除被污染、不平整的培养板。将合格的培养板放入0~4℃条件下保存, 在1个月内使用。将试验用菌株接种于普通琼脂培养基, 37℃过夜培养后挑取单个菌落接种于M-H肉汤培养基, 37℃恒温摇床中培养6~8h, 与标准比浊管比较确定菌液浓度, 用空白肉汤或生理盐水调节使其相当于0.5麦氏标准比浊管, 浓度约为1~2×106CFU/m L。

2.2 抗菌活性的检测

在直径为10cm的平皿内倾倒一层营养琼脂培养基以及调整好浓度的处于对数生长期的大肠杆菌O78, 使琼脂内的细菌终浓度为106CFU/m L, 倾注厚度为1.5mm, 待琼脂冷却凝固后, 在琼脂板上打直径为3mm的圆孔, 在孔中加入上述分离过程所得到的不同阶段的抗菌肽, 每孔上样量为15μL, 将平皿倒置于37℃过夜培养, 以确定不同分离阶段样品的抗菌活性。

3 抗菌肽的抗菌活性研究

3.1 鸡小肠抗菌肽对不同细菌的抗菌活性测定

在直径为10cm的平皿内倾倒一层琼脂培养基以及调整好浓度的处于对数生长期的各株细菌, 使琼脂内的细菌终浓度为106CFU/m L, 倾注厚度为1.5mm, 待琼脂冷却凝固后, 在琼脂板上打直径为3mm的圆孔, 在孔中加入鸡小肠抗菌肽 (80μg/m L) , 每孔上样量为15μL, 将平皿倒置于恒温培养箱中37℃培养18h, 测量各组的抑菌圈直径, 用以表示抗菌活性单位。

抗菌活性单位= (抑菌圈直径-3) ×10

3.2 活菌计数法测定鸡小肠抗菌肽的杀菌率

将上述各株细菌培养至对数生长期并调整细菌浓度为2.0×105CFU/m L, 分别吸取每株细菌培养物100μL至无菌Eppendorf管中, 共两管, 一管为试验管, 一管为对照管。试验管中加入抗菌肽, 使其终浓度为80μg/m L, 终体积为200μL;对照管中加入灭菌PBS溶液, 使终体积为200μL。将各管中液体混匀后, 于37℃条件下振荡孵育30min后将各管样品分别作10、102、103、104倍稀释, 每个稀释度分别取10μL滴种于2个营养琼脂平板上, 37℃孵育18h后, 观察并记录每个营养琼脂平板上的菌落数量, 取相同稀释度的2个营养琼脂平板菌落的平均值作为该稀释度样品的菌落数量。根据稀释度和滴种量计算出每管原液中的细菌数量, 按下述公式计算杀菌率。

杀菌率= (对照管细菌数量-试验管细菌数量) /对照管细菌数量×100%

3.3 与其他抗菌药进行抗菌活性比较

采用琼脂孔穴法进行试验, 将抗菌肽与常见抗菌药以大肠杆菌O78为检测菌作抑菌对比试验。

4 实验结果

4.1 鸡小肠抗菌肽对不同细菌的抗菌活性测定结果

在细菌浓度为1×106CFU/m L, 加样量为15μL的条件下, 鸡小肠抗菌肽对大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌有较好的杀灭或抑制作用, 对巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O2的作用较弱 (表1) 。

4.2 活菌计数法测定鸡小肠抗菌肽的杀菌率试验结果

在抗菌肽浓度为80μg/m L、细菌浓度为1×105CFU/m L的条件下, 鸡小肠抗菌肽对大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌、巴氏杆菌的杀菌率较高;对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O2的杀菌率较低 (表2) 。

4.3 鸡小肠抗菌肽与常见抗菌药抗菌活性比较

采用琼脂孔穴法将抗菌肽与常见4种抗菌药以为检测菌作抑菌对比试验。结果表明, 80μg/m L的抗菌肽对大肠杆菌O78的抗菌活性较1000U/m L青霉素和4%SD-Na强, 略比0.4%链霉素和0.5%四环素差。结果见表3。

本研究试验结果表明, 鸡小肠抗菌肽对兽医临床上常见的一些致病菌有较强的抑制和杀灭作用。与传统的抗生素和化学合成抗菌药物相比, 抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性强、在动物体内无残留和毒性低等明显的优点。

参考文献

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动物源性抗菌肽抗菌机理的研究进展 篇3

1 抗菌肽的作用机理

目前, 关于抗菌肽作用机理的报道较多, 但多局限于在人工脂质膜方面的研究。人工脂质膜与细胞膜在组成和结构上存在着很大的差异, 由于细胞所处的环境和细胞膜试验条件各不相同, 研究结果不能完全代表抗菌肽在细胞中的作用方式。关于抗菌肽的作用机理可分为两个方面:一是作用于细胞膜, 扰乱膜的生物学作用;二是穿过细胞膜进入细胞, 影响其新陈代谢。其中抗菌肽和细胞膜的相互作用是研究的重点。

1.1 抗菌肽与细菌细胞膜的作用

抗菌肽结合负电性细菌细胞膜并插入膜内导致膜穿孔形成离子或溶质通道, 引发细胞内水溶性物质大量渗出, 胞内三磷酸腺苷 (ATP) 下降, 细胞呼吸链受阻最终导致细菌死亡。体外研究表明, 抗菌肽有两种不同物理状态与膜结合。在低浓度时, 抗菌肽平行于脂双层, 以一种无活性状态植入磷脂分子头部, 使膜被拉伸变薄;在高浓度时, 则垂直插入脂双层, 形成跨膜孔, 具体的浓度与抗菌肽和膜脂组成相关。有3种模型可以解释抗菌肽使膜通透性增加的原因。

1.1.1 桶板模型 (barrel-stave model)

这种模型是由多个抗菌肽螺旋在膜内形成中空的螺旋束, 形成跨膜孔。抗菌肽的疏水残基排列在螺旋束外侧与膜脂相互作用, 而亲水残基排列在螺旋束内侧组成内孔, 形成一种类似离子通道的结构[2], 使内外膜电势失去平衡, 从而导致细菌细胞的死亡。对家蝇抗菌肽的研究发现, 家蝇抗菌肽使细菌表面电负性增强, 对革兰阳性菌细胞表面电荷的改变大于对革兰阴性菌的改变, 使细菌细胞表面疏水性下降。抗菌肽引起细菌细胞膜通透性迅速增加, 推测抗菌肽对细胞膜的作用机制是“形成孔洞”[3] 。

1.1.2 地毯模型 (carpet model)

这种模型是抗菌肽与阴离子的磷脂头部基团静电吸附, 积累在脂双层表面, 平行排列, 像地毯一样覆盖在膜表面。当浓度达到一定阈值时, 抗菌肽像去污剂一样使膜破裂产生微团, 形成临时的环形孔道, 最终扰乱脂双层而导致膜解体。Lockey T D等[4]从烟芽夜蛾幼虫中分离、鉴定的cecropin具有抗大肠杆菌K12D31的活性。通过电镜技术与免疫细胞化学技术可观察到该肽与大肠杆菌K12D31胞膜的结合, 在胞膜上可看到小的病灶, 病灶直径约为9.6 nm, 形成的孔洞直径约为4.2 nm。孔洞可导致胞质内容物泄漏及细菌死亡。

1.1.3 环孔模型 (toroidal-pore model)

抗菌肽分子垂直插入膜内引起外层磷脂分子排列方向随之改变, 同时水分子嵌入, 诱发了内层磷脂分子变向, 最终导致跨膜环孔形成。Magainins、protegrins蜂毒素可以诱导这种跨膜环孔的形成。这种模型不同于桶板模型, 肽分子一直与磷脂分子的亲水头部结合, 而且孔径也比前者大。

尽管膜损伤机理的说法不一, 它们之间可能存在一定的联系, 离子通道、跨膜孔乃至更进一步的膜破裂也许是一个连续的递增过程, 而且膜损伤不是抗菌肽作用的唯一机理。例如, 有些抗菌肽可以激活胞外的自溶素和磷脂酶。除此之外, 人们还发现抗菌肽存在胞内作用位点。因此, 也有学者认为抗菌肽通过细胞膜进入细胞内, 进一步影响细胞的信号传导体系、新陈代谢和基因的表达。

1.2 抗菌肽的抗菌机理

1.2.1 对核体DNA的影响

抗菌肽通过与DNA结合阻止细胞的正常转录从而扰乱了细胞的正常机能而使细胞死亡。1998年, Park C B等[5]发现蛙的一种抗菌肽Bufotin Ⅱ与昆虫抗菌肽的抗菌机理不同, 不是裂解细胞膜而是穿过膜, Buforin Ⅱ在其最低抑制浓度以下可穿透胞膜并在大肠杆菌内积聚, 然后通过与细胞DNA结合来抑制细胞的功能, 并导致细胞死亡。

1.2.2 抑制蛋白质的合成

抗菌肽穿过细胞膜通过阻止蛋白质的合成达到杀菌效果。Boman H G等通过对抗菌肽PR-39的研究发现, 其发挥抗菌作用时并不形成孔道、不裂解细菌, 而是通过抑制细胞内DNA和蛋白质的合成来杀灭细菌。比较抗菌肽cecropin P1和PR-39抗大肠杆菌的作用时间后发现, 抗菌肽cecropin P1能迅速裂解细菌, 而PR-39需8 min穿膜, 然后快速杀灭细菌, 而且与cecropin P1相比, PR-39对处于对数生长期的细菌的杀伤作用要比处于非对数生长期的细菌迅速而明显。而抗菌肽Attacin则可抑制一种特异性膜蛋白的合成[6]。

1.2.3 抑制细胞壁的形成

Harder J等[7]发现, 人的抗菌肽β-defensin-3能够抑制细菌细胞壁的形成, 使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻, 并使细胞壁穿孔, 最终导致细菌死亡。

目前, 关于抗菌肽的抗菌机理还不能达成共识, 不同学者从不同角度提出了相异的作用方式。有的学者认为抗菌肽是通过与细胞膜作用引起膜蛋白凝聚、失活, 形成离子通道, 引起膜通透性改变最后导致细菌死亡。有的学者提出抗菌肽是通过与细胞膜上存在的特异性受体以及其他因子协同作用而导致细菌死亡。有的学者认为抗菌肽进入细胞内通过影响细胞的新陈代谢引起细胞代谢受阻而导致细菌死亡。但许多研究表明, 抗菌肽的杀菌机理主要是通过作用于细菌的细胞膜, 破坏其完整性并产生穿孔现象, 造成细胞内容物溢出胞外而死亡, 但也可能是通过多种方式的协同作用而引起细菌的死亡。

2 抗菌肽的生物活性与结构关系

2.1 肽链的长度

抗菌肽链的长度一直被认为是主要的影响因素。起初研究者认为要形成跨膜通道, 最少应含20个氨基酸残基, 其后发现有些抗菌肽仅由12个氨基酸残基组成。对地毯模型的研究表明, 抗菌肽通过和膜结合后改变其稳定性从而引起细胞死亡, 不必形成跨膜通道, 这可以很好地解释上述问题。通过对肽的N-端或C-端进行酶解发现, 不同的肽在不同部位功能也不同。这可能是因为肽链长度的改变影响了抗菌肽的疏水性、二级结构以及在水溶液和细胞膜上的状态, 从而改变了抗菌肽对膜的结合能力。

2.2 多肽的电荷数

抗菌肽的电荷可直接影响其活性与选择毒性。通过改变肽链长度、取代肽链中氨基酸和C-端酰胺化等方法合成模拟抗菌肽, 并研究电荷对其活性的影响。当阳离子抗菌肽的电荷小于+5时, 抗菌性随正电荷数的增加而增加;当电荷大于+7时, 增加正电荷的数量对活性影响不大。Park I Y等[8]的研究表明, 正电荷数不但影响抗菌肽的二级结构和亲水性, 同时还改变了抗菌肽的三级结构及其在水溶液和细胞膜上的存在形态。另外, 不改变分子中电荷的数量仅改变Arg、Lys在分子中的位置时, 抗菌性也受影响。电荷对肽单体或多聚体的潜在影响可能包括螺旋结构的稳定化和去稳定化作用。

2.3 多肽的疏水作用

抗菌肽含有约50%的疏水氨基酸残基, 其所具的活性是亲水基团和疏水基团相互作用的结果。疏水作用对其活性的影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val数量进行的。研究表明, 增加分子的疏水性, 抗菌肽的抗菌活力和对哺乳动物细胞的毒性同时增加。这是由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用。另外, 由于疏水基团的存在, 肽链在溶液中可以通过疏水作用形成多聚体, 增加了对真核细胞膜的亲和力, 同时也增加了抗菌肽形成α-螺旋的能力, 而α-螺旋的增加又提高了抗菌肽的稳定性。Pathak N等认为, 尽管天然抗菌肽的疏水性和两亲极性具有很大的可变性, 但两亲极性在其抗微生物活性中起关键作用, 疏水性序列的大小及其氨基酸组成同样会影响其活性。

2.4 多肽的二级结构

两亲结构对抗菌肽保持活性十分必要, 对大多数肽而言, 两亲结构的破坏与α-螺旋的丧失会引起活性的丧失。研究表明, 抗菌肽必须具备两亲结构和正电荷, 利用这一原则可以设计具有抗菌活性的肽。

3 问题及展望

要进一步加速对抗菌肽的开发应用, 必须解决以下两个问题:①抗菌肽的来源, 由于抗菌肽的分子小, 直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时, 分离提纯有一定的困难, 故化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段。但化学合成抗菌肽成本高, 而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因时, 易被蛋白酶降解, 表达产物可能对宿主有害, 从而影响了基因的高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题之一。②与传统抗生素相比, 某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想, 改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。这需要进一步研究抗菌肽的结构与活性之间的关系, 为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。此外, 在生命体特别是高等生命体防御系统中, 抗菌肽的准确地位以及模式生物的研究、抗菌肽表达水平与各种病原的相关性、抗菌肽是否存在对异源动物的不良反应。随着人类科学技术的发展, 这些问题都将得到解决, 使抗菌肽的优点得到充分的发挥和利用, 抗菌肽在农业生产、食品工业、特别是医药行业都将具有广阔的应用前景。

摘要：动物源性抗菌肽是动物体抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类小分子多肽, 与传统抗生素相比在抗菌方面有着独特的作用机理。本文综述了动物源性抗菌肽的一般特性、作用机理和影响抗菌活性和结构之间的关系, 以期为抗菌肽的应用和开发提供必要的理论参考。

关键词：抗菌肽,作用机理,抗菌活性

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抗菌肽的研究进展 篇4

1 抗菌肽的分类和作用

研究发现,包括细菌、真菌、昆虫、被囊动物、两栖类动物、甲壳类动物、鸟类、鱼类、哺乳动物(包括人类)以及植物在内的所有生物体都可产生抗菌肽(Robert,2001)。在欧洲铃蟾体内分离到了抗菌肽bombinin,在非洲爪蟾体内分离到了抗菌肽magainin,随后在爪蟾的胃肠黏膜中发现了抗菌肽(Csordas等,1970;Zasloff等,1987;Kreil,1994)。从猪小肠中也成功地提取到了抗菌肽类物质(马卫明等,2004)。目前,已经从猪体内发现了至少12种不同的抗菌肽,这些抗菌肽具有不同的结构,分子量相对较小,但对多种微生物有广谱杀灭作用。根据抗菌肽前体的基因结构、氨基酸序列特征,可将猪源抗菌肽分为4类:富含保守的胱氨酸防御素(Defensins)超家族、Cathelicidins家族、Cecropins家族和NK-lysin。防御素超家族和Cathelicidin家族是目前为止在哺乳动物中发现的两个最大群体的抗菌肽家族(Zhang等,2000)。目前,已经至少从8种哺乳动物包括猪、水牛、兔等体内发现了30多种Cathelicidins。猪的Cathelicidins家族包括PR-39、Protegrins 1-5、PMAP-23、36、37。PR-39主要是通过抑制细菌DNA和蛋白质的合成来抑菌的。

前人对抗菌肽的研究主要集中在分离纯化与鉴定以及抗微生物活性等方面,关于抗菌肽对动物生长性能的影响研究很少。有研究表明,抗菌肽能促进雏鸭生长(陈晓生等,2005)。在利用鸡胚研究抗菌肽抗病毒作用的时候,有研究者意外地发现抗菌肽处理组鸡胚比空白对照组的发育快(马卫明等,2006)。

2 抗菌肽的性质和作用机制

抗菌肽分子的氨基酸大多数带正电荷,具有亲水性和疏水性两性性质,肿瘤细胞和细菌的质膜结构是其作用的靶目标。抗菌肽分子通过正电荷与质膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在脂质膜上,并能插入到质膜中去,扰乱质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序,使得膜外正电荷增多,超过阈值时导致膜去极化,致使细胞膜通透性增高,细菌不能保持正常渗透压而死亡;同时还能通过抑制细菌细胞壁的合成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,最后造成细胞壁穿孔导致细胞死亡;也可以通过干扰细胞外膜蛋白的基因转录,使蛋白质含量减少,从而抑制细菌细胞的生长。

抗菌肽对细菌和真菌都有很强的杀伤作用,能使菌体线粒体出现肿胀、空泡化、脱落、排列不规范、核膜界限不清、核破裂、内容物溢出,抗菌肽通过抑制细胞呼吸作用而将细菌杀死。抗菌肽对肿瘤细胞的核染色体有直接的杀伤作用,使肿瘤细胞的DNA出现断裂,诱导肿瘤细胞凋亡,肿瘤体积缩小。但是,由于抗菌肽不是一类均一的物质,结构和功能的差别使他们属于不同的家族,不同家族的抗菌肽成员的作用方式和机制也不完全相同。因而不存在一个统一的学说来解释抗菌肽的作用机制。

3 抗菌肽的分离和提纯

由于抗菌肽的分子小,直接从动植物组织中分离提纯天然抗菌肽存在一定的困难,因此化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段。但化学合成抗菌肽的成本高,而通过基因工程法在微生物中直接表达抗菌肽基因时易被蛋白酶降解,表达产物可能对宿主有害,从而影响基因的高水平表达。因此,如何提高生产效率、降低成本就成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题之一。另外,与传统抗生素相比,某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想,改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽的结构与活性之间的关系,为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。

4 结语

在畜牧业养殖生产及饲料中长期添加抗生素的做法目前已受到广泛的质疑,动物抗菌肽因其独特的杀菌机制和理化性质使得它在饲料中有着广泛的应用前景;同时,抗菌肽在生物技术制药、转基因技术方面也显示出诱人的潜力。

摘要：抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类具有抗微生物与一些恶性细胞的短肽,一般具有抗菌作用。本文主要综述抗菌肽的分类和作用、性质和作用机制及其分离和提纯。

关键词：抗菌肽,研究概况,综述

参考文献

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[3]马卫明,余锐萍,彭芳珍,等.猪小肠抗菌肽的提取及部分生物学活性研究[J].科学技术与工程,2004,(3):202-205.

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抗菌肽:治疗阴道炎的研究 篇5

1 材料及方法

1.1 柞蚕蛹：

由大连生物技术研究所提供的柞蚕蛹(品种33)。剖开茧壳得到滞育的柞蚕蛹。注射灭活大肠杆菌诱导产生抗菌肽;或用超声波处理诱导得抗菌肽;穿刺蛹体，离心，上清液为免疫血淋巴，含抗菌肽300单位/m L。

1.2 重组抗菌肽：

将合成的抗菌肽CAD基因转化于毕赤酵母中表达，发酵得到重组抗菌肽[1]，发酵液含抗菌肽6000单位/m L。

1.3 抗菌肽的提取与纯化：

将免疫血清或重组抗菌肽发酵液，加热100°C(水浴)30分钟，离心，取上清液。通过阳离子交换树脂CM-Sepharose FF柱层析，用甲酸(乙酸)盐缓冲液梯度洗脱，收集抗菌肽活性组份，真空浓缩，超滤脱盐，用喷雾干燥得到抗菌肽制剂[2]。

1.4 抗菌肽杀菌谱：

根据消洗剂手册的要求，对金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、黑色芽孢杆菌、白色念珠菌及阴道毛滴虫的试验，证实其广谱性[3][4]。

1.5 抗菌肽的安全性试验：

包括急性、长期(40周)毒理试验。“三致”试验及过敏性试验等，证明其安全性。

1.6 抗菌肽消洗剂的配方优化：

根据消洗剂手册的要求和抗菌肽的特性优化配方，制成消洗剂及栓剂使用。

1.7 临床观察：

包括动物模型和临床试验。

2 试验结果

2.1 抗菌肽制备工艺路线

由柞蚕蛹免疫血清制备的抗菌肽制剂，效价为3000单位/克，重组抗菌肽制剂为50000单位/克。

2.2 抗菌肽的杀菌谱：

在LB培养基上接种病原微生物，打孔(2.7mm)，注入5ul抗菌肽制剂，37℃培养过夜，保存于4℃，测定杀菌圈的直径。结果见表1。

抗菌肽对阴道毛滴虫的杀灭效应，阴道毛滴虫是感染阴道的一类原生动物，圆形或椭圆型，有伪足及波动膜。抗菌肽作用10～30分钟，虫体结构呈粗颗粒状并崩溃。

2.3 抗菌肽的安全性：

抗菌肽的安全性检验。委托深圳市疾病预防控制中心完成。按急性毒性试验。GB15193.3-94;40周喂养试验，GB15193～13-94;Ames试验，GB15193.4-94;小鼠骨髓微核试验，GB15193.5-94;小鼠精子畸型试验，GB15193.7-94及显性致死试验，GB1519.9-94。结论是：小鼠口服急性毒性试验及大鼠40周喂养试验，均属无毒的物质。对体细胞及生殖细胞无诱变作用，对Ames试验及显性致死试验均属阴性。

作为消洗剂，调查了天然抗菌肽、重组抗菌肽及杆菌肽锌、恩诺沙星等药物的有效浓度及有效作用时间的试验。结果见表2。试验表明天然抗菌肽与重组抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄葡萄球菌的有效浓度为0.05μg/m L，作用时间为3分钟。比杆菌肽锌及恩诺沙星有明显的优势。

天然抗菌肽:0.01、0.05、0.1ug/mL;重组抗菌肽:0.01、0.05、0.1ug/mL;杆菌肽锌:0.01、0.05、0.1ug/mL;恩诺沙星:0.01、0.05、0.1ug/mL;*三个重复的菌落

抗菌肽对家兔皮肤刺激性试验及眼角膜刺激反应均属阴性。皮肤处理无红斑亦无水肿现象。对兔眼角膜试验，未出现浑浊，虹膜。结膜无出血及水肿现象。以上试验表明抗菌肽作为阴道消洗剂的安全性及格，尚未发现毒性现象。

2.4 抗菌肽阴道消洗剂的配方：

参考有关消洗剂手册要求，经多次试验，确定其优化配方如下。

抗菌肽阴道消洗剂的配方:

抗菌肽制剂 500mL

吐温80 20mL

薄荷乳剂(2%) 480mL

薄荷油调配，根据“中国药典”方法调配:

薄荷油 20mL

吐温80 20mL

乙醇(95%) 600mL

蒸馏水 360mL

将天然抗菌肽或重组抗菌肽的纯化制剂，用无菌水稀释成3000单位/m L的溶液，作为配制消洗剂及栓剂的原料，按照配方调制成消洗剂及栓剂，产品中保持抗菌肽有效杀菌剂量为1500单位/m L，即有良好杀菌作用。参看表2.3的结果证明制剂的有效性。

抗菌肽阴道栓剂的配方:

抗菌肽制剂 500mL

吐温80 20mL

薄荷油(2%) 100mL

辅料乳剂 380mL

调配成栓剂，控制pH，用注射器或塑料管注入阴道内施药。制剂抗菌肽相当1500单位/m L。

2.5 抗菌肽杀菌效价检验：

1981年，按Hultmark的方法检验，主要是液体LB培养基中接入EcoliK12D31，约0.30OD，对照区注入灭活的抗菌肽，试验区注入同体积的抗菌肽。37℃温育30分钟，速冷，用分光光度计测定两管的OD570mμ，抗菌肽效价单位按下式讲三。

A0:对照管OD570mμ;A:测定管OD570mμ;

据卫生部药政司批准的抗菌肽检测暂行标准(97) XL–29号。

抗菌肽固体1克，溶放10mL无菌水中，离心，取上清液作检测样本。在液体LB培养基中，加入250单位/m L硫酸链霉素，同时接入EcoliK12D31。将6.5mL预热培养基，注入7.5cm直径培养皿中，放冷，用2.7mm直径的打孔器打孔，每孔注入抗菌肽样本5μL。阳性对照为Sigma公司的Cecropin B，阴性对照为无菌水。37℃培养过夜。冷冻，测定抑菌圈直径。每处理重复3次。按下式计算。

杀菌效价(单位/克)=2x×1000

y、a：抗菌肽抑菌圈直径(mm);

B:Cecropin抑菌圈直径(mm);

2.7：孔穴直径(mm);2.1：抑菌圈直径与抗菌肽浓度的比值。

2.6 抗菌肽的临床试验：

2.6.1 治疗铜绿假单胞菌感染：

某医院收治5名铜绿假单胞菌的病员。主诉阴道局部发痒、红肿、疼痛、分泌物增多，棉签抽检确认为耐药性铜绿假单胞菌感染。对多种抗菌素的耐药性检测结果，见表4。

决定用抗菌肽阴道消洗剂1500单位/m L，用导管导入阴道内，每次10～15m L，一日3次，连续5天，辅以头孢霉素2.5g/日静注。其余2例用生理盐水注入阴道，以头孢霉素4克/日静注作对照，经5日治疗住院观察。用抗菌肽治疗的3例已有效果，用棉揩子检验阴道内分泌物，未发现铜绿假单胞菌，第5天痊愈出院。对照区2人改用抗菌肽剂治疗亦得到痊愈。

2.6.2 治疗阴道毛滴虫感染：

某医院收治阴道毛滴虫感染病院，主诉外阴搔痒，白带增多，有时疼痛。有尿频、尿急等症状。棉揩子检验及窥器检查，取出乳样白带，涂片，赖氏染料染色，可见短杆状或卵型的病菌及活动的阴道毛滴虫。进一步用30%氢氧化钠滴于标本上处理15分钟，仍见到白色念珠菌分生孢子及菌丝体。可确诊为多重感染的阴道炎症。随机组织38人作门诊采用不同药物治疗，观察其效果。5～7天为一个疗程。复诊检验，结果见表5

从表5可见5000单位的抗菌肽栓剂对白色念珠菌及阴道毛滴虫的阴道炎有较好的疗效。

3 讨论

抗菌肽作为一种新型外用药物原料，配制成乳剂及栓剂，对治疗女性阴道炎症有较好的疗效。它的特点是安全性好，无毒副作用，适应范围广，包括多种耐药性细菌，如铜绿假单胞菌及金黄葡萄球菌，白色念珠菌(真菌)及阴道毛滴虫(原生动物)均能有效。

开发抗菌肽作为外用新药仍然要做许多临床前的准备工作。当前尚未制定统一的质量技术标准，参考卫生部提出的暂行标准，尚待完善。只能经过多方面的努力制定标准才能投产应用。其次抗菌肽来源广阔，从天然柞蚕蛹提取较易，但得率低。用基因过程发酵生产重组抗菌肽，可大规模发酵生产，产品稳定，成本较低。但申报生物制剂的药物原料，归入二类西药范围，批准过程仍然要做大量的临床前的试验。希望得到药理、毒理、药效等多方面的努力，才能获得批文，将成为我国拥有自主知识产权的新药。

参考文献

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[3]黄自然, 郑庭辉, 梁怡彰, 等.柞蚕抗菌肽的抑菌效应[J].科学通报, 1983, 10:622～624.

抗菌肽多基因表达技术与策略 篇6

1 多基因共表达系统

多基因共表达系统是将2个或2个以上的单个相同或不同抗菌肽基因通过特定连接点或结构连接构建到特定的表达载体中形成高效表达系统。这样的表达构建,已经发展出多种多样的技术,对分子质量较小的抗菌肽表达很有价值。首先,无论对相同抗菌肽基因还是不同抗菌肽基因完整地构建在同一载体上,在数量上都实现了重复,一经表达,蛋白质的长度和重量就会得到增加。如果设计了分离、纯化水解点,表达的抗菌肽理论上应该是完整的,会随着抗菌肽基因数量增加来直接增加表达量的数倍,这样的基因表达称为融合表达,也可称为基因串联,其表达产物为肽聚合体(multimer)。如果设计的是有独立启动子调控表达单个基因的多个顺式作用元件串联在一起的多基因表达系统,则为多拷贝表达系统,它是提高产量的一种表达方法,在外源基因表达方面应用较多。

其次,在对表达的抗菌肽分子进行分离和鉴别时,由于表达量增加,无论是质粒中转录子mRNA还是翻译后的产物分离、提取和分析都在一定程度上降低难度、节约成本。此外,将具有多种不同抗菌活性的抗菌肽基因共同表达,有可能扩大抗菌肽的抗菌谱,增加抗菌肽的稳定性,并且得到具有多重抗菌活性的抗菌肽,将几个具有协同调控作用的相关基因共同表达,还有助于对外源蛋白表达进行综合调节。J.R.Shin等[1]将一个抗菌活性强,细胞毒性小的抗菌肽Buf IIIb与Lpp-Omp A串联,可以改善抗菌肽基因工程菌的生理代谢水平,降低抗菌肽表达产物对其宿主菌的毒性作用,有助于提高抗菌肽基因工程菌目标代谢产物的产量。

当然,表达产物的活性是否能达到预期,还与具体设计的方案和采用技术的不同而不同。如牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense基因的串联构建,表达的产物只抑制大肠杆菌活性[2]。利用口蹄疫病毒2A将荧光蛋白d Tomato的基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中,再置于p PIC9K载体AOXI启动子的下游,构建出分泌型重组酵母表达载体p PIC9K-d Tomato-2A-3M,得到具有抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌活性的抗菌肽[3];鸡Av BD5-Av BD10双分子蛋白的抗菌活性高于Av BD5的活性[4]。

2 多基因共表达系统的种类

多基因共表达策略主要依靠启动子启动机制实现提高表达量的目的,而构建共表达体系是实现高效表达的基础。质粒共表达体系的构建常采用两种方法:第一种是由一个或多个启动子同时表达多个目的基因,形成单个表达盒系统;第二种是构建多个表达盒系统,即让每个表达盒都含有完整的独立表达单元。

2.1 单一启动子驱动的抗菌肽多基因表达

单一启动子驱动的多基因表达系统是将多个顺反子基因置于同一个或多个相同启动子控制之下,构建出含有相同表达单元的共表达体系。这种共表达对于表达数量较少的几个基因表达效率较高,在不同表达体系的研究中效果不同。从方法上研究,单一启动子驱动的表达系统比较简便、灵活、常见。单一启动子控制的抗菌肽表达在大肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、植物及动物等生物中都有应用,以大肠杆菌为宿主的融合表达应用较多。尽管存在着位置效应,但是由于多数载体中含有增强子,最大限度避免了基因沉默的现象,这样的启动子主要有CMV、SV40、T7、p MC1、PGK、PIC等。

表达盒是一种模块元件,它可以赋予多个同样的顺反子在同一质粒中独立同向连接,组装后每个基因都带有各自独立的启动子、核糖体结合位点、终止子等一整套表达调控元件构成独立的表达子顺式元件,并将多个表达盒置于同一个表达载体构成由同一种启动子介导的多基因高效表达体系。由多表达盒构建出单个载体转化宿主后,可产生多种不同mRNA转录,进而翻译出蛋白,基因的表达相对独立,可以表达多个相同的蛋白单元,实现多个基因的共表达。这种表达避免了由一个启动子驱动多个基因而造成的基因表达不均衡,也能提高表达效率,该种方法用毕赤酵母的p PIC系质粒构建抗菌肽高效表达的情况比较多[5]。

2.2 两个以上的多启动子驱动的多基因表达

多启动子驱动的表达是由多个不同功能的启动子共处一个表达质粒进行调控表达的系统。它不仅可以同时从两个方向同时启动,也可以根据启动子的表达类型先后启动、同向或不同向启动抗菌肽表达。其主要目标是启动精确表达,强调表达控制的多样性、表达效率的高效性[6]。如原核细胞表达系统的种类较多,但应用抗菌肽表达的系统主要有λPRPL-PT7、CpxR/Cpx A系统[7]。真核表达系统的CMV、p GAP质粒均具有这样功能。目前,能够应用于抗菌肽表达的主要是p GAP系毕赤酵母系载体,是双启动子表达系统[8,9,10,11]。CMV作为穿梭质粒可以将荧光蛋白GFP与抗菌肽epinecidin-1融合在斑马鱼中表达[12]。双启动子表达系统一方面能够独立地启动两个独立的基因表达,并达到表达量高于单个启动子驱动两个基因的表达;另一方面双启动子表达系统能够分离融合标签和目标蛋白,可能有利于分离和纯化[13]。多启动子驱动的表达系统在自然界生物细胞内普遍存在,其中对原核表达系统研究与开发较多,主要应用于非抗菌肽外源蛋白表达,尚处表达系统开发阶段。

2.3 双质粒共表达

将两个不同外源基因分别构建到两个含有不同抗性的表达载体上,同时将这两个重组的表达质粒同时转入同一个宿主中进行蛋白的表达是双质粒共表达体系的核心内容。此技术的关键在于:两个共表达的质粒要携带相同的启动子、不同的抗性、不同的复制系统。双质粒共表达系统可分为两种,第一种是复制子相同的不兼容性的双质粒,另一种是复制子不同的兼容性的双质粒。复制子相同的不兼容质粒在大肠杆菌中应用较多,而复制子不同的载体很难找到。由于在大肠杆菌中可以共存复制子不同的相容双质粒,能够保证在传代培养的过程中质粒不丢失;因此,第二种方法在以大肠杆菌为宿主的原核表达系统中,具有很大的优势。目前,此表达系统对抗菌肽外源蛋白表达的应用未见报道。

3 多基因共表达策略

3.1 目标蛋白伴侣的基因设计

大多数生物细胞合成活性蛋白质时,是以前体蛋白质形式合成,其组成是目标肽基因片段前加上一段伴侣性的基因片段,后者亦称之为分子伴侣,即前导肽类片段。其作用是:可以有效增加小分子多肽的肽链长度,降低被蛋白酶降解的可能性;利用前导肽的折叠功能,降低小分子多肽对宿主菌毒性作用,形成的聚体空间结构可能会有效屏蔽单体产物毒性,如将一小段聚肽基因与抗菌肽基因串联,可以表达出包涵体的抗菌肽聚合体,融合蛋白产量占总蛋白产量的30%[14,15]。而将一段酸性肽基因与阳性抗菌肽连接成2基因串联融合子,共表达肽可以减轻抗菌肽毒性[16,17]。

目前商业化的表达载体多含有标签基因序列,或含有便于识别表达的多聚体,加上标签蛋白基因片段,更便于分离,如GSTtag、HIS tag、SUMO等,已经得到广泛使用[18]。此外,研究者在抗菌肽伴侣式基因设计时充分利用不同基因片段的功能。在以酵母为宿主的真核系统中,将猪β防御素2和猪γ干扰素(PBD-2和Po IFNγ)串联融合在一起,置于表达载体p PICZαA的控制下顺利表达,因表达产物活性受融合表达和重组基因肽链折叠的限制,未能表现出高抗菌活性[19]。而h Bmp4的前导肽与成熟肽在毕赤酵母中融合表达,表达后可直接获得成熟肽。

最近几年研究者们更趋向于自身抗菌肽片段融合表达形成聚肽的方法,来提高抗菌肽产量,同时达到降低对细胞毒性的设计。如Aloferon-1抗菌肽基因串联式表达,融合了14个Aloferon-1基因在p ET42a上[20],抗菌肽CM4在p ET32中构建最好是3个串联[21]。抗菌肽Buf IIIb与Lpp-Omp A串联时是以Buf IIIb重复基因与Lpp-Omp A形式串联,Lpp是一个脂蛋白,Omp A是一膜蛋白,当该基因串联表达后,由于属于分泌型的表达,Lpp-Omp A蛋白最后分泌出嵌在胞膜上,与膜蛋白Omp A相连的抗菌肽聚体Buf IIIb,且露出宿主菌胞膜表面,该蛋白聚体随着宿主菌进入可以裂解的环境条件下就会释放单体肽,发挥抗菌肽作用,而且这样的构建,能表达的菌株不需要进行蛋白质的分离纯化而释放出单体,就可以发挥抗菌功能,省去了分离纯化生产工序。

3.2 多基因融合表达的连接点设计

多基因表达产物无论是聚体形式存在,还是存在于活的细胞里,最终都是以单体形式发挥作用。尽管在抗菌肽的设计过程中使用融合技术实现了高通量表达,去除标签和前导肽再分离出单体肽的技术操作还是比较难[22]。单体抗菌肽能够释放一方面取决于其作用的靶标环境,另一方面能否释放还受制于自身单体间的连接点的结构与特性。若将多个相同或不同的目标基因序列直接首尾顺次连接,基因序列之间可能存在着空间位阻的排斥效应,容易造成串联基因的不稳定。因此,将多个目标基因序列中间彼此用一个仅起连接作用的柔性序列连接起来,构成串联基因序列是实现多聚体表达的前提。

为了便于串联成更多的蛋白质聚合体,又便于识别分离,一些研究者利用各种裂解特性的基因序列或氨基酸序列,如buforinⅡ基因与酸性肽基因连接点采用修饰magainin的干扰序列(MMIS)cys密码子,也可以在基因间设置甲酸识别序列以便在具体蛋白间有裂解蛋白序列[22,23]。Buf IIIb串联序列的裂解点是胃蛋白酶裂解点Leu编码序列,连接到每个单体的C端。胰蛋白酶能识别AAK序列,构建胰岛素A链和B链的裂解点采用了该片段,获得有活性的胰岛素[24]。用肠激酶作为抗菌肽裂解识别点的设计也收到一定效果,在抗菌肽PR-39和Protegrin-1(PG-1)串联融合表达时,构成的GST-PR-39-PG-1聚体肽就是使用肠激酶识别片段(NG)[25]。此外,抗菌肽多聚体的单体间也有用凝血因子Xa作为切割位点的识别序列[26],如抗菌肽Perinerin采用了凝血因子Xa作为切割位点的识别序列,通过切割获得活性肽[27]。王秀青等[27]通过Kex2(AAAAG)酶切位点将3个天蚕素抗菌肽的基因串联在一起并克隆入p PICZαA之上,通过SacⅠ线性化后电转入SMD1168中,经检测,串联体的表达量与单倍体比较明显增多,但是抑菌活性未呈现明显的倍数关系,分析可能与Kex2的酶切效率有关,或与载体表达条件、多聚体的串联数有关。研究表明,并非是串联单元数越多,蛋白的表达量就越高,抑菌活性增加,蛋白的表达量可能与基因的结构、宿主分泌蛋白的能力、串联数与表达载体的包含能力以及串联体数对基因结构的影响等因素有关,不同的抗菌肽最多能串联的数量和蛋白的表达量之间的关系尚没有相关数据说明。

3.3 构建多拷贝表达盒

构建多拷贝表达载体发挥作用的关键基因片段通常是同尾酶和互补非对称性黏性末端设计。表达盒构建的基本方法分为体内构建和体外多拷贝构建两种方法。

体外构建即是定向地体外构建多拷贝表达载体后,用抗性平板筛选多拷贝转化子的过程。即采用具有相同黏性末端的互为同尾酶的限制性内切酶来实现串联体的连接,可以随意增加基因的拷贝数。技术的关键在于:在目的基因的N端和C端分别设计并添加同尾酶,然后将目的基因整合入表达载体形成重组质粒,用此二酶与载体相应位置上的酶分别配对并酶切重组质粒,分别回收含有单拷贝基因的大片段和小片段进行连接,即可获得两拷贝的基因串联体,采用同样的方式可获得各种拷贝数的基因串联体。该方法具有低浓度抗性筛选和高定向性的双重优势。常使用的同尾酶有XbaⅠ和NheⅠ、Bam HⅠ和Bg IⅡ、AvrⅢ和PstⅠ、XbaⅠ和Nhe等。王婷婷等[28]通过PCR方法扩增家蝇Defensin的基因片段,将此目的片段整合入克隆载体,然后用一对同尾酶XbaⅠ和NheⅠ进行反复的酶切和连接产生多拷贝串联体,再将此串联体置甲醇酵母分泌表达载体p PIC9K中,最终获得了高达8拷贝数的串联体,实现了多个基因在一个质粒中的共表达,每个基因的表达都是独立的,这种表达方式可以回避基因中存在的常用限制性内切酶所带来的限制。

体内构建既是将表达载体一次性线性电转化后转入宿主菌,然后用抗性平板直接筛选不同拷贝数的转化子,是利用可自然产生多拷贝自融合串联体扩增系统的过程。如酵母系统中将携带的Zeocin或卡那霉素抗性的表达载体以及整个表达盒一起整合入毕赤酵母基因组中,然后通过高浓度的抗性筛选,筛选出的菌株高拷贝的可能性最大,毕赤酵母表达系统的载体多具有这样的功能。原核表达系统中进行基因多拷贝时采用T4连接酶和同尾酶,如合成P113基因时使用高保真Taq酶进行PCR扩增,由于模板为重复片段,在变性后退火时存在多种选择,经30~35轮循环后,产物为2至数百拷贝串联体的化合物,然后连接平端载体,可以筛选出含有10个拷贝数的串联重组体[29]。

表达盒串联是目前比较前沿的方法,由于共表达的基因含有独立的表达元件,会使表达单元串联的体积过大,影响表达效果。而且各个表达单元与载体携带的启动子不同,不同启动子之间可能会有不同程度的相互干扰。但对于不同启动子、靶细胞甚至是细胞克隆来说,干扰作用和程度也不是绝对的[30]。并非质粒中表达单元的数量越多表达量越高,有资料表明,多拷贝质粒构建少至两个多至上百个表达单元的情况均存在,表达量和表达单元数目之间不存在明确的倍数关系,其中表达单元能否表达可能与表达单元的数目和基因结构的稳定性有关[14],也可能与表达机制有关。如Z.Zhong等[31]构建了2,4,8拷贝的h BD2表达载体,发现2拷贝的表达量最高,可达760 mg/L。

4 小结

抗菌肽制剂 篇7

1 抗菌肽的抗菌作用机理

不同种类的抗菌肽, 对细菌的作用机理不尽相同。目前, 人们对抗菌肽的作用机理有不同的认识, 并没有达成共识, 学术界主要趋向认同以下两种作用机理。

1.1 抗菌肽破坏细菌的细胞膜

抗菌肽能与细菌细胞膜表面相互作用, 可以使细菌胞膜通透性发生改变而起到杀菌作用[1]。阳离子抗菌肽的正电荷区域与细菌细胞膜上的负电荷区域相互作用, 使抗菌肽分子的疏水端插入胞膜的脂质膜中, 进而改变脂质膜结构, 形成跨膜电位, 打破了细菌体内的酸碱平衡和渗透压平衡, 从而起到抑制细菌呼吸的作用[2]。也有学者提出, 阳离子抗菌肽是以物理的方式作用于细菌的细胞膜, 使细胞膜穿孔, 并破坏细胞的完整性, 导致细胞质外溢而达到杀菌的目的[3]。另有研究表明, 抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起, 从而在膜上形成离子通道, 使膜蛋白凝集, 使细菌因不能保持正常的渗透压而死亡[4,5]。抗菌肽与细菌胞膜的相互作用程度, 直接关系到抗菌肽的抗菌活性[1]。

抗菌肽一般只对原核生物细胞和真核生物病变细胞具有抗菌作用, 对正常的生物细胞不起作用。这是由于原核生物和正常真核生物的细胞膜结构不同, 正常真核细胞膜中含有大量的胆固醇, 而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定[4]。而哺乳动物细胞骨架系统比较发达, 能够抵抗抗菌肽的作用, 因此在动物饲料中添加抗菌肽, 避免了对动物本身的危害作用。

1.2 抗菌肽选择性作用细菌细胞内的靶标部位

尽管大部分抗菌肽通过破坏细胞膜的完整性而杀灭细菌, 但有些抗菌肽却可以在保持包膜结构完整的情况下, 引起细菌死亡。因此, 抗菌肽除了作用于细胞膜外, 还可以作用于细菌细胞内的其它靶标来消灭它。近年来, 越来越多的证据表明抗菌肽进入细菌细胞质, 通过与细胞内靶标的特异性结合干扰细胞代谢, 达到抑制和杀灭细菌的目的[1,4]。抗菌肽主要通过以下几个方面在细菌细胞内发挥作用: (1) 与细菌细胞内的酸性物质结合, 阻断DNA复制和RNA合成; (2) 抑制蛋白质的合成与折叠; (3) 抑制细菌细胞壁的合成, 阻断细胞分裂; (4) 抑制细菌细胞内酶活性等; (5) 抑制线粒体功能, 干扰其能量供给[5,6]。有的抗菌肽, 如死亡素通过抑制细菌的呼吸作用杀死细菌;有的抗菌肽通过干扰细菌基因的转录使细菌的生长受到抑制, 如攻击素能够干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白Omp C、Omp F、Omp A以及Lam B基因的转录, 使这些蛋白质含量减少, 细菌的生长受到抑制[7]。

抗菌肽独特的抗菌机理, 使其具有不易产生耐药的特性, 远远超越了抗生素的局限, 是新一代的高效抗菌剂。

2 抗菌肽在畜牧业中的应用

抗菌肽种类多, 具有抗菌活性强、可供选择范围广、作用于靶菌株不易产生抗性等多种生物功能。因此, 抗菌肽及其产品在医药业、天然食品防腐剂、畜牧养殖业和动植物抗病基因工程等方面具有广阔的应用前景。

2.1 抗菌肽在动物医药方面的应用

抗菌肽独特的抗菌机制, 在理论上可以成为部分抗生素替代物。目前, 研究者通过不同方法在临床上进行了大量研究, 取得丰硕的成果。如利用不同种类抗菌肽治疗肺炎、败血性休克和口腔黏膜炎症等疾病模型, 都取得了显著成效[8,9,10]。有研究表明, 抗菌肽对流感病毒、疱疹病毒等有抑制作用, 甚至还可抑制HIV-1的基因表达。抗菌肽特异性抑制肿瘤生长, 并对人正常细胞无害的特性, 极有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药[11]。抗菌肽作为新型抗菌药物, 其主要应用的发展方向是:首先可作为单一的抗感染药物使用;其次是与抗生素联合应用发挥协同作用;三是作为免疫刺激增强剂使用, 以提高机体免疫力;四是作为肉毒素中和物质, 减轻细菌毒素引起的败血症性休克[12]。

2.2 抗菌肽在畜禽养殖业中的应用

大量研究结果表明, 抗菌肽在畜牧业生产中具有广泛的应用前景[13]。在仔猪饲料中添加抗菌肽, 可以促进仔猪生长, 改善饲料利用率, 同时提高了仔猪的免疫功能, 有效预防和治疗仔猪疾病。对于母猪而言, 可以提高其繁殖性能, 并能通过母体间接对初生仔猪产生益处[14]。奶牛乳房炎是奶牛中常见的疾病, 对患有乳房炎的奶牛乳房乳灌注乳酸链球菌素, 其受损乳腺组织能够较快的修复, 乳腺上皮细胞合成乳成分的能力有所提高[15]。而在奶牛日粮中添加抗菌肽制剂, 其乳脂率明显提高, 牛乳体细胞数明显降低[16]。抗菌肽在养鸡生产上也有应用试验, 研究发现饲用抗菌肽能促进肉鸡生长, 提高免疫力, 但与中草药和抗生素相比, 在出栏率、平均体重、饲料效率等方面均无显着差异。在饲料中添加一定量的天蚕素抗菌肽能显著提高蛋用仔鸡生长性能、免疫器官指数, 降低IL-6、IFN-γ及TNF-αm RNA的相对表达水平, 从而有效减轻肠道炎症的发生, 其中以饲粮添加量为350mg/kg时效果较好[17]。随着养殖业对环境破坏的加剧, 水产养殖病害日益严重, 抗菌肽在水产养殖中具有潜在的应用前景。柴仙琦[18]通过试验研究发现, 在凡纳滨对虾饲料中添加150~200mg/kg的抗菌肽, 可以显著提高其生长速度、成活率、相对增重率和血清非特异性免疫指标, 降低饲料系数等。

2.3 抗菌肽在动物基因工程方面的应用

利用抗菌肽分子量小、抗菌谱广的特点, 人们借助基因工程技术, 将抗菌肽基因转入动物染色体基因中, 以获得抗菌新品种或高效表达产物, 再通过分离纯化而得到纯度较高的抗菌肽[19]。人们还将其基因导入植物体内进行品种改造, 从而获得抗病植株, 或者转入动物体内, 明显提高动物的抗病能力[20]。类似研究有将Shiva-1基因转入烟草和马铃薯, 使转基因烟草青枯病发病明显延迟, 病情指数下降, 植株死亡率下降[21]。同样的Yarus[22]等用显微注射法将牛TAP (tracheal antin icrobial peptide, TAP) 基因转入小鼠, 转基因小鼠成功表达了牛TAP, 鼠乳中的TAP对大肠杆菌具有抗菌活性。