牛布鲁氏菌（精选六篇）
牛布鲁氏菌 篇1
1 病原
1985年WHO布鲁氏菌病专家委员会将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型, 即马耳他布鲁氏菌 (羊布鲁氏菌B.melitensis, 3个生物型) 、流产布鲁氏菌 (牛布鲁氏菌B.abortus, 8个生物型) 、猪布鲁氏菌 (B.suis, 5个生物型) 、绵羊附睾布鲁氏菌 (B.ovis, 1个生物型) 、沙林鼠布鲁氏菌 (B.neotomae, 1个生物型) 、犬布鲁氏菌 (B.canis, 1个生物型) 。我国已分离到15个生物型, 即羊布鲁氏菌3个型, 牛布鲁氏菌8个型, 猪布鲁氏菌的1型和3型, 绵羊附睾布鲁氏菌和犬布鲁氏菌1型[5]。20世纪末, 英国和美国陆续从海洋哺乳动物如海豹、鲸、海豚等中分离出布鲁氏菌, 暂时命名为海洋种布鲁氏菌 (Brucellamarls) 。
布鲁氏菌对对外界环境的抵抗力较强, 在水和土壤中存活72~112 d, 在粪尿中存活45 d, 在乳内存活60 d, 在冷暗的胎儿内存活6个月[6]。但对湿热较敏感, 60℃30 min或70℃5~10 min可以杀死该菌。一般消毒剂都可以杀死, 2%苛性钠、2%~3%煤酚皂溶液, 1 h可以杀死该菌。利福平、强力霉素等抗生素对布鲁氏菌有杀灭和抑制作用。
2 流行病学
2.1 易感动物
布鲁氏菌病的易感动物范围很广, 如羊、牛、猪、人、水牛、野牛、牦牛、羚羊、鹿、骆驼、野猪、马、犬、猫、狐、、狼、野兔、猴、鸡、鸭以及一些啮齿动物等, 但主要感染羊、牛、猪[6]。布鲁氏菌病往往先在家畜或野生动物中传播, 随后波及人类。流产布鲁氏菌的主要宿主是牛, 奶牛、黄牛、水牛和其他动物和人都易感。牛对布鲁氏菌均有不同程度的感受性, 但6个月龄以下的犊牛不易感。一般随着性成熟年龄接近而增高, 成年牛较幼年牛易感, 性成熟的牛和体弱牛较易感染该病。
2.2 传染源
传染源是患病牛和感染牛。危害最大的是感染的妊娠母牛, 它们在分娩或流产时将大量布鲁氏菌随着胎儿、胎衣和羊水排出, 流产后的阴道分泌物以及乳汁中都含有布鲁氏菌。
2.3 传播途径
布鲁氏菌病传播途径有消化道、呼吸道和皮肤黏膜。主要是消化道, 即通过污染的饲料与饮水而感染。皮肤感染也是主要途径, 试验证明, 通过无创伤皮肤, 使牛感染成功, 如果皮肤有创伤, 则该菌更易感染。其他如通过结膜、交配也可感染。吸血昆虫蜱可以传播该病。奶牛流产和分娩之际是感染机会最多的时期。
2.4 流行特点
该病一年四季均有发病, 冬、春2季和产仔季节更易发生。近年疫情季节逐渐弱化。母牛发病率高于公牛。在疫区大多数处女牛在第1胎流产后则多不再流产, 但也有几胎连续流产。牧区发病率高于半农区和农区, 最近几年农区发病率快速上升。
3 国外牛布鲁氏菌病防控措施
布鲁氏菌病是一种人兽共患病, 又是一种自然疫源性疾病。世界各国特别是发达国家对布鲁氏菌病的防控十分重视。但布鲁氏菌病流行范围广, 易感动物多, 传染源与人接触密切, 传播途径复杂, 所以布鲁氏菌病很难控制和消灭。FAO/WHO布鲁氏菌病专家委员会曾预言:“布鲁氏菌病是最难解决的问题之”。但是少数发达国家和地区如瑞典、丹麦、芬兰、加拿大、澳大利亚等, 经数年不懈的努力, 已净化或根除了布鲁氏菌病。国外牛布鲁氏菌病的防控措施主要有以下3种。
3.1 检疫隔离 (或淘汰)
3.1.1 丹麦、瑞典奶牛布鲁氏菌病的防控措施。
该地区对各个奶牛场的奶进行环状反应检查。一旦发现有阳性检测结果, 就将全场的所有奶牛进行血清凝集反应试验, 及时隔离或淘汰阳性奶牛。经检验确定为阳性奶的必须要经过消毒之后才能出售。国家对淘汰牛给予一定的补贴[7]。
3.1.2 希腊牛布鲁氏菌病的防控措施。
该地区对各个奶牛场的奶牛、肉牛都进行严格检查之后将确诊为牛布鲁氏菌病的牛进行屠杀。国家对其进行补偿, 一般有2种补偿方法, 一种是畜主将染病的牛出售, 然后由国家补贴其中的差额;另一种是国家将健康的牛与畜主染病的牛进行交换, 由价格委员会决定补偿金额。
3.1.3 英国消灭布鲁氏菌病采取的措施。
该地区对消灭布鲁氏菌病采取的措施主要有以下4种, 一是建立清净畜群。首先要对畜群进行3次血检, 每隔3个月检测1次, 必须保证所有被检测的畜群均为阴性。如果在3次检测中有1次为阳性, 则需强制进行屠宰, 然后再重新进行3次血检, 直到最后所有被检测的畜群均为阴性。二是对消灭布鲁氏菌病的畜主进行补偿。三是对进口动物进行严格检查。在进口动物入境前先在输出国的出口口岸进行全面检查, 在检测后确定所有牲畜均为阴性时方可入境。当进口动物运送到英国后, 要先在隔离区进行隔离28 d, 然后再全面血检1次, 如果检测结果为阴性, 则放在1个农场6个月, 在这6个月中再进行详细的检查。四是对病畜流动要经常进行监察和控制。
3.2 菌苗接种
布氏菌苗对家畜保护力一般是70%~80%, 疫苗的应用严重干扰了检疫和诊断, 因此达不到根除此病的目的, 只能用来在暴发时减少经济损失。因此, 单纯依靠接种菌苗来消灭家畜布鲁氏菌病是不可能的, 并且是根除布鲁氏菌病的障碍。国外只有阿根延、印度等少数国家对牛采用菌苗接种办法。
3.3 检疫隔离和菌苗接种相结合的综合防治措施
以澳大利亚牛布鲁氏菌病的防控措施为例, 其防控措施如下:一是畜群疾病认证计划。在20世纪30年代, 澳大利亚许多地区制定了畜群疾病认证计划, 该计划的顺利实施, 其原因是被宰杀阳性动物的畜主能够得到政府的补贴。二是疫苗接种计划。主要采取皮下接种弱毒活疫苗S19, 在维多利亚230个农场进行的试验显示, 接种S19疫苗后母牛的流产率从37%降到5%。三是根除计划。开始于1970年, 此期间对所有的畜群进行严格的诊断检测, 阳性动物及时宰杀, 疑似阳性动物隔离3个月后再检, 若为仍未阳性宰杀。牛只处死后用密封的装置运输到指定地点, 根据当地的要求采取焚烧或深埋的方法进行处理。畜群场所、用具及运输工具必须进行严格的消毒。另外, 国家还制定了一些日常监督措施、提高公众的安全卫生意识, 督促畜主及时地上报流产、产死胎、弱胎的牛只, 以防疾病在畜群之间的蔓延及自身的感染等。在20世纪70年代中期, 为监测根除计划的进展, 还引进了尾标法, 通过该种方法可以及时地追踪屠宰场动物及动物尸体的来源。在根除计划执行的过程中由于贸易交易受阻、市场失范、畜产品的损失等所造成的经济损失80%由国家政府补贴, 20%由相应的产业机构提供。澳大利亚于1989年宣布消灭了牛布鲁氏菌病。
随后, 又采取了一种牛的终身身份标记系统, 以对根除计划的完成进行监督, 该系统通过一块微电子芯片以耳标或瘤胃处作标记的形式, 作为一头牛的身份证, 关于该牛的身份、迁移情况、疾病状况等均通过它记录在由澳大利亚牲畜协会管理的一个数据库内。如果发现传染病动物, 则根据数据库资料, 立即准确跟踪其他与其接触过的动物及患病动物的来源[8]。
4 目前国内牛布鲁氏菌病防控措施
我国牛布鲁氏菌病防控措施, 在不同的历史时期和不同的地区, 采取的防控措施和模式是不完全相同的。目前, 依据《布鲁氏菌病防治技术规范》的要求, 重度流行区以免疫和检疫为主, 轻度流行区以监测和扑杀为主, 日常管理以消毒和个人防护为主原则。
4.1 疫情监测
按照农业部要求开展布鲁氏菌病监测工作, 采用流行病学调查、血清学诊断方法, 结合病原学诊断对牛进行监测。血清学监测的范围是新生犊牛、未免疫、免疫18个月或口服免疫1年以后的牛进行监测。奶牛每年应进行2次血清学监测。
4.2 检疫
包括海关检疫、铁路检疫、公路检疫和动物交易市场检疫, 《传染病防治法》《动物防疫法》分别在有关章节做了详细规定, 这些法律的颁布实施给检疫工作提供了法律依据。2006修改的《布鲁氏菌病防治技术规范》对布鲁氏菌病检疫作了明确规定。异地调运的动物, 必须来自于非疫区、同等风险区域间的调运或低风险区域可向高风险区域调运, 凭当地动物防疫监督机构出具的检疫合格证明, 防止疫情跨区域传播。对调运的种用、乳用、役用动物进行实验室检测。检测合格后, 方可出具检疫合格证明。调入后应隔离饲养30 d, 经检疫合格后, 方可解除隔离。
4.3 免疫接种
在布鲁氏菌病呈地方流行的地区, 对牛进行接种。免疫期在1年以上, 所用的布鲁氏菌病疫苗是S2株、M5株、S19株以及经农业部批准生产的其他疫苗。种用、乳用牛的免疫按国家有关规定执行。
4.4 消毒
加强养殖场消毒、无害化处理等防控措施, 对养殖企业和养殖小区实行封闭饲养, 规范养殖行为, 不断提高生物安全水平。饲养场及牛舍出入口处, 应设置消毒池, 内置有效消毒剂, 如3%~5%来苏尔溶液或20%石灰乳等。牛舍内的一切用具应定期消毒;产房每周进行1次大消毒, 分娩室在临产牛生产前后各进行1次消毒。养牛场每年应进行2~4次大消毒。染病的牲畜居住的场所、用具等需要进行严格消毒才能再继续使用。可以采用火焰消毒、熏蒸消毒等方法对饲养场的金属设施、设备消毒;可用2%烧碱等消毒养畜场的圈舍、场地、车辆等;对于饲养场的饲料、垫料等, 可以进行深埋或是焚烧处理;病畜的粪便需要进行密封发酵处理。
4.5 人员防护
密切接触牲畜及其产品的人员, 应做好个人防护。助产和诊疗时, 戴口罩、眼镜和手套, 穿防护衣, 皮肤有伤口者应暂时避免接触家畜。防护设备应常消毒。饲养人员每年要定期进行健康检查。发现患有布鲁氏菌病的应调离岗位, 及时治疗。
4.6 宣传培训
通过电视、广播、宣传册等手段广泛地宣传布鲁氏菌病防控知识, 特别是在牛产犊的季节, 要有针对性地加大宣传力度, 让广大人民群众了解布鲁氏菌病的危害性, 提高群众自我保护的意识和能力。各级业务部门加强对技术人员开展业务技术培训, 加强专业队伍建设, 提高防控能力和业务水平[9,10,11]。
参考文献
[1]吴清民.动物布鲁氏菌病防控技术研究对策[J].兽医导刊, 2010, 151 (3) :21-23.
[2]孙承恩, 马恒之.布鲁氏菌病[M].银川:宁夏人民出版社, 1985.
[3]KLANS NIELSEN, J ROBERT DUNCAN.Animal Brucellosis[M].USA:CRCPress, 1990.
[4]还锡萍.布鲁氏菌病的流行病学研究进展[J].江苏卫生保健, 2002 (4) :176-178.
[5]吴清民.兽医传染病学[M].北京:中国农业大学出版社, 2002:187-193.
[6]陈溥言.家畜传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社, 2006:135-141.
[7]张士义, 工森林, 聂志文, 等.国内外防治布鲁氏菌病主要技术措施的实施及评价[J].中国地方病防治杂志, 1999, 14 (6) :347-350.
[8]严玉宝, 胡娟, 周岷江.澳大利亚动物疾病现状及防制措施[J].中国动物检疫, 2010, 21 (7) :41-43.
[9]傅义娟.青海省海东地区牛羊布鲁氏菌病流行病学调查及防制效果分析[D].兰州:甘肃农业大学, 2005.
[10]李娜.布鲁氏菌外膜蛋白Omp 39和Omp 14的原核表达及其免疫原性鉴定[D].保定:河北农业大学, 2008.
牛布鲁氏菌病血清学检测报告 篇2
布氏杆菌病 (Bruellosis简称布病) 是由布氏杆菌引起的人畜共患的一种急性或慢行传染病，本病一年四季均可发病，临床上以母畜流产、公畜睾丸炎、暂时或永久性不育及产奶量下降为主要特征。本病在各地均有不同程度的流行，给畜牧业生产和人类健康造成了严重危害。像澳大利亚已根除了奶牛布病，其成功经验是，定期检测，淘汰阳性畜，此外还对畜群的流动实行了严格的限制措施以确保健康牛群远离布病⑷。因此，为了全面掌握本县布病的感染和发病情况，分析发病特点和传播风险因素，笔者于2010年3月至2012年10月进行了牛布病感染抗体的检测，现就其结果报告如下：
1 材料
1.1 被检血清
采自农户、规模场 (户) 、贩运户的牛血清18415头份，分离血清，-20℃保存备用。
1.2 检测试剂
虎红平板诊断抗原、试管凝集抗原、阴、阳性血清，虎红平板凝集试验 (RBPT) 抗原购自青岛易邦生物工程有限公司，批号20110426;试管凝集试验 (SAT) 抗原购自青岛易邦生物工程有限公司，批号20110403。
2 检测方法
2.1 虎红平板试验方法
参照国标 (GB/T 18646-2002) 执行[1]。将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03ml.在受检血清旁滴加抗原0.03ml，用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合，每次试验应设阴阳性血清对照。
2.2 试管凝集试验方法
按照操作规程进[1,2]。
2.3 检测程序
奶牛血清用虎红平板凝集试验进行初筛，阳性者用试管凝集试验复检、确诊。
3 结果判定标准
3.1 虎红平板试验
等量的被检血清和虎红平板抗原混匀后2～3min出现肉眼可见的凝集颗粒，判为阳性，无凝集现象判为阴性。
3.2 试管凝集试验
被检血清1:100稀释，通过与比浊管对比，标记出现“++”以上的凝集现象时判为阳性血清，1:50稀释，标记出现“++”以上的凝集现象时判为可疑，可疑反应的奶牛经3～4周后，重新采血检验，如仍为可疑，在判为阳性。
4 结果
(详见表1、表2、表3)。
(头、%)
(头、%)
5 结果分析
(1)三年牛布病共监测牛18415头，阳性34头，年度间平均阳性率0.18%，2010年监测牛4726头，阳性12头，阳性率0.25%。2011年监测牛6538头，阳性12头，阳性率0.18%，2012年监测牛7151头，阳性10头，阳性率0.14%;牛布病阳性率逐年有所下降，说明大通县在牛布病防控上，通过采取监测、及时淘汰阳性牛等综合性防治措施后，已取得了一些成效。(2)不同养殖户中，牛布病感染情况各不相同，其阳性率以规模场最高，散养户次之，贩运户最低。究其原因是多方面的，但主要与以下因素有关： (1) 规模场饲养密度过大，消毒不太严格，造成疾病多发和传播便捷。多数中小养殖场在场址选择，房舍布局，舍内设计等都不太科学，饲养密度过大，单位面积上承载量增加，舍内卫生状况不良，再加上没有严格执行消毒程序，消毒药物选择不当，消毒剂量不足，消毒面积不彻底等遗留死角，对病畜的排泄物清除不够彻底，造成环境污染，病源微生物滋生，加快了布病的传播。 (2) 散养户养殖分散、数量少，饲养时间长，主要以家庭为单位，养殖观念落后，其养殖目的不是为了获得经济效益，因此对布病的危害认识不足，对布病的防治知识了解甚少，一旦感染布病，造成长时间的传播，最后为了挽回经济损失，将病牛低价出售給贩运户，成为新的传染源。 (3) 对贩运户而言，虽着个体养殖户不断增多，集市交易开放，牲畜流通加快，但贩运户收购数量少，来源分散，饲养时间短，布病传播有限。但这些牛大多来自养殖户的病牛，这种方式也成为了布病的传染源。(3)年度检出的阳性畜没有得到及时淘汰，以往检测以母畜及幼龄畜为主，且检测面有限，忽视对成年公畜的检测，缺乏阳性畜无害化处理措施和经济补偿机制。(4)试管凝集试验 (SAT) 是我国布病诊断的法定方法，是一种比较经典的布病检测方法。特异性和敏感性高，检测较准确，判定上更精确，具有较高的诊断价值;但操作繁琐，费时费力，不适用于现场采用和大规模的筛选检测。而虎红平板凝集试验 (RBPT) 操作方便，快捷，适于大规模的筛选检疫;而特异性不高，结果判定受反应时间长短影响大，判定结果不够精确。但两种试验的符合率较高，所以在实际检测过程中应把两种方法结合起来运用，互补优劣。先用RBPT筛选，阳性样品再用SPT复核以作出比较准确的判断。
6 对策
(1)加大规模养殖场的监管力度，加强养殖场的环境卫生，制定严格的消毒程序，引导养殖场沿着正规化、合理化、科学化的轨道发展;加大科普宣传力度，加强领导、提高认识，奶牛调运严格按照《中华人民共和国动物防疫法》和国家有关规定，严格实行奶牛调运检疫审批和“准调”制度。(2)对重点发病地区母牛实施计划免疫，对阳性牲畜实施扑杀无害化处理，对一般发病地区采取以检测处理阳性畜为主的净化措施，对可疑牛和检测阳性牛扑杀前的牛奶，均需高温等无害化处理。可疑牛及检测阳性牛的胎儿、胎衣、排泄物均需深埋等无害化处理。为了巩固布病防治效果，防止疫情回升，还要做好布病疫情的监测工作，加大检疫次数和力度，及时检测布病抗体，随时掌握疫情动态，采取相应措施，对种畜实行检疫淘汰制度，减少传染源，稳定控制疫情。(3)县级动物防疫监督机构应加强对奶牛的检疫，发放健康证，养牛户凭健康证出售牛奶，乳品加工场凭健康证收购牛奶，起到追溯调查和“净化”奶源的作用。(4)加大赔偿力度，经费落实到位，及时扑杀。由于奶牛价格高、流动性大，如不及时处理，易造成疫源的扩散。如果畜群中传染源不彻底清除，病畜长期保菌、排毒，将会严重威胁健康畜群和人，感染的布病牛和羊仍是人间布病的主要传染源[3]。(5)布病防制是一项长期而艰巨的工作，在工作中要坚持采取，以监测、检测、检疫、隔离、封锁、消毒、阳性畜扑杀综合防治措施，控制传染源，切断传播途径。只要每年严格检疫，按省级下达的布病监测任务，合理采样、规范监测，阳性畜严格扑杀深埋，做到加强联防、畜间检疫，注意疫情动态，及时发现并扑杀病畜，将疫情消灭在萌芽中，达到预警预报、净化畜群的目的，直至成为无病畜群。
参考文献
[1]动物布鲁氏菌病诊断技术 (Diagnostic techniques for animal brucellosis) 》GB/T18646-2002, 北京:2009 (11) .
[2]中国农业标准汇编《动物布鲁氏菌病诊断技国家质量监督检验检疫局, 《SN/T1090-2002布氏杆菌病试管凝集试验操作规程》[M].北京:2003.
[3]张士义, 马汉维, 江森林.我国近年来布鲁氏菌病监测资料分析[J].中国人畜共患病杂志, 1999, 15 (1) :59-60.
牛布鲁氏菌 篇3
海南州牛羊布鲁氏菌病 (简称布病) 防治工作, 认真贯彻执行“预防为主”的方针, 开展群防群治, 广泛开展病原学和流行病学调查, 组织实施监测、免疫、检疫、防制效果考核等综合措施, 取得了显著成绩。截至2005年全州5个县全部达到了国家规定的“稳定控制区”标准。
1 流行概况
畜间布病流行情况:布病在海南州历史上早有流行。据建国后普查资料显示, 全州羊布鲁氏菌病平均感染率达13.87%~25.75%, 牛平均感染率为23.26%。属高发区, 尤以牧业区为严重, 个别地区感染率高达56.8%以上。
到1994年海南州5个县牛、羊布鲁氏菌病平均阳性率为0.45%和0.43%, 比防治前的22.26%和18.88%分别下降了21.8和18.45个百分点。收集流产病料1813例, 病料染色镜检、人工培养和动物接种试验, 均未分离出布鲁氏菌, 以上两项防治效果均达到了卫生部、农业部规定的防治“控制区”标准, 并先后通过了省防治布鲁氏菌病考核委员会的验收。
2 防控策略及成效
2.1“免疫、检疫、考核、扑杀”相结合的防控措施
布病的防疫从上世纪50年代开始, 采取了“免疫、检疫、考核、扑杀”等综合性防治措施, 布病防治效果不断得以巩固, 全省无大的疫情暴发。从1984年开始, 海南州动物疫病预防控制中心 (原海南州畜牧兽医站) 组织专业人员对布病考核工作实行分片包干、责任到人, 有计划、有步骤地进行了全面考核。为统一考核程序和操作方法, 先后培训班县 (乡) 专业人员74人 (次) , 推动了防控工作。
2.2“检疫、考核、扑杀”相结合的防控措施
根据农业部要求, 从2002年以后, 停止疫苗免疫接种工作, 防治家畜布病策略改为“检疫、考核、扑杀”相结合的防治措施。至此, 将家畜布病防治工作提高到了一个新的基准。1994~2005年在全州5个县共检测牛、羊48 663头 (只) , 其中检测牛16 909头, 阳性率0.065%, 检测羊31754只, 阳性率0.038%。至2006年底, 全州5个县全部达到了农业部、卫生部颁布的布病防治效果“稳定控制区”标准。
3 存在问题和原因分析
3.1 引进病原的风险依然存在
种畜交换现象十分频繁, 直接构成对我州的威胁。牛、羊布鲁氏菌病仍在我州牛、羊群中存在带菌畜, 个别地区有所回升。
3.2 带菌野生动物可能成为传染源
海南藏族自治州是青海省主要牧业区之一, 境内野生动物种类繁多。藏原羚、岩羊、盘羊、藏羚羊、鹿、野牦牛、野驴都是布病的易感动物。青海省曾在上世纪未对多种野生动物进行过布病检测, 在驯鹿、原羚、岩羊均检出布病血清抗体阳性。在拥有众多数量的野生动物的情况下, 人类、家畜与之在同一环境生存, 布病对家畜和人类的健康构成了很大的威胁。
3.3 布病阳性家畜仍然零星分布
2008年, 海南州对牛进行检测, 牛阳性率为2.95%, 其中奶牛阳性率为3.0%, 说明海南州牛羊布病阳性畜仍然存在, 尤其阳性奶牛对人民身体健康影响更大。
3.4 畜间布病防控存在漏洞
有些地方检疫工作把关不严, 将患病种公羊引进。致使母羊感染, 造成流产。
4 今后布病防控工作建议
(1) 凡是引进种畜及其它家畜一律进行检疫, 各县动物防疫部门强化种畜及其它家畜串换时的检疫工作, 并使检疫工作形成制度化。
(2) 地区间进行大宗牲畜调运, 如“整村推进”等项目引进的种畜进行全面检疫。
(3) 做奶牛布病防控工作, 对阳性牛的淘汰制定相应补偿政策, 从根本上消灭传染源。
牛布鲁氏菌 篇4
本研究对保存的牛血清样品同时使用RBPT、SAT、CFT、间接ELISA(i-ELISA)和竞争ELISA(c-ELISA)5种血清学检验法进行检测,通过试验比较不同检测方法的差异,探讨不同检测方法在牛布病诊断中的意义。
1 材料与方法
1.1主要试剂及试剂盒布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、布鲁氏菌试管凝集抗原、布鲁氏菌补体结合试验抗原、溶血素、补体、标准阴性血清及标准阳性血清,均购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。i-ELISA和c-ELISA试剂盒购自瑞典SVANOVA公司,批号分别为:P01448、P01418。0.5%石炭酸生理盐水、绵羊红细胞等其他试剂均由辽宁省动物疫病预防控制中心配制。
1.2血清样本临床样品为未经免疫的牛血清样品,共270份,其中RBPT阳性样品205份,RBPT阴性样品65份。
1.3试验器材微量移液器、三分玻璃试管、酶标仪(TECAN)、酶标板自动清洗剂(DEM-Ⅲ)、试管架、振荡器、37℃恒温培养箱等。
1.4试验方法及判定标准
1.4.1 RBPT、SAT、CFT RBPT、SAT、CFT试验方法及判定标准参照我国《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2002)。
1.4.2 i-ELISA和c-ELISA试验步骤严格按照试剂盒说明书操作。
1.5统计分析方法试验结果使用Excel进行录入,对RBPT、SAT、CFT、i-ELISA和c-ELISA试验结果应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 SAATT与CFT的比较用SAT与CFT方法对RBPT筛选出的205份阳性血清样本和65份阴性血清样本进行检测,检测结果见表1。结果表明:205份RBPT阳性血清样本SAT检测出108份阳性样本、42份可疑和55份阴性样本,65份RBPT阴性血清样本用SAT检测均为阴性,与RBPT的符合率为63.70%;205份RBPT阳性血清样本CFT检测出121份阳性样本、3份可疑和81份阴性样本,65份RBPT阴性血清样本用CFT检测均为阴性,与RBPT的符合率为68.89%,SAT与CFT的符合率为60.98%;205份RBPT阳性血清样本采用SAT与CFT相结合的方法,最终判定为146份阳性、18份可疑和41份阴性 , SAT的阳性符 合率为73.97%,CFT的阳性符合率为82.88%,Kappa值为0.663。利用SPSS 17.0软件对SAT与CFT两种试验方法试验 结果进行 统计学分 析 , χ2(1,0.95)值为11.57,Kappa值为0.327,SAT与CFT检测结果统计学差异极其显著(P<0.01)。
2.2RBPT与ELISA方法的比较用ELISA方法对RBPT筛选出的205份阳性血清样本和65份阴性血清样本进行检测,检测结果见表2。利用SPSS 17.0软件对不同试验方法的试验结果进行统计学分析,结果表明:205份RBPT阳性血清样本i-ELISA检测出157份阳性、48份阴性,65份RBPT阴性血清样本均为阴性,与RBPT的符合率为82.22%,χ2(1,0.95)值为46.02,Kappa值为0.617,RBPT与i-ELISA检测结果统计学差异极其显著(P<0.01);205份RBPT阳性血清样本c-ELISA检测出156份阳性、49份阴性,65份RBPT阴性血清样本均为阴性,与RBPT的符合率为81.85%,χ2(1,0.95)值为47.02,Kappa值为0.611,RBPT与c-ELISA检测结果统计学差异极其显著(P<0.01);i-ELISA与c-ELISA两种试验方法的符合率为93.33%,χ2(1,0.95)值为0.056,Kappa值为0.865,i-ELISA与c-ELISA检测结果无统计学差异。
2.3 EELLIISSAA方法与SAT和CFT方法综合判断结果的比较对RBPT筛选出的205份阳性血清样本,通过SAT检测为阳性的样本判为阳性。对SAT检测为阴性的样本再通过CFT进行检测,CFT检测为阳性的判为阳性,检测为阴性的最终判为阴性。通过对ELISA方法检测结果与SAT和CFT方法综合判断结果进行比较,i-ELISA、c-ELISA方法与SAT和CFT综合判定结果的符合 率分别为80.37% 、83.33% 。利用SPSS17.0软件对SAT与CFT综合判定结果和i-ELISA、c-ELISA的检测结果进行分析,结果表明:SAT和CFT综合判定结果与i-ELISA、c-ELISA的χ2(1,0.95)值分别为1.53、0.97, Kappa值分别为0.589、0.476,约登指数分别为0.728和0.846,均无统计学差异。
3 讨论与小结
目前,血清学方法仍为动物布病检测的主要方法,在我国动物布病的诊断中主要使用RBPT进行初筛,SAT、CFT相结合的方法进行确诊的诊断程序。通过本试验发现,应用RBPT对布病牛的检出率明显高于SAT、CFT与ELISA方法,同时因RBPT具有特异、敏感、廉价、操作简便的特点被广泛应用于本病的初筛诊断。但因严重溶血、试验温度、交叉反应或抗原抗体反应超过4 min后出现纤维素的凝集块,有时会产生假阳性结果[6]。因此,还需要通过已建立的确证体系进行最终的判定。
SAT、CFT为我国布病诊断的法定试验,其中CFT还是世界动物卫生组织(OIE)规定的国际贸易指定的布病的确诊试验之一。SAT检测Ig M敏感性较高,不仅可以用于布病的早期诊断,也可以用于人畜布鲁氏菌菌苗免疫后机体出现最早血清抗体的检测[7],但不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁氏菌感染动物的检测,且操作繁杂、费时、结果判定受主观因素影响大,单独使用时特异性较差,不能区分人工免疫和自然感染[8]。CFT主要适用于动物机体感染中、后期的实验室诊断,但CFT不适合作为猪的布病检测,同时由于CFT条件要求较高,操作复杂,参与的成份多,对操作者要求也比较高,且不能鉴别人工免疫和自然感染,也难以在基层应用以及进行现场检测。于桂芳等[9]通过对奶牛布鲁氏菌病试管凝集试验与补体结合试验结果的差异分析发现,如果只把补体结合试验作为奶牛布病监测的最终判定结果,将有35.9%试管凝集阳性奶牛被漏判为阴性。通过本试验也发现SAT与CFT这两种试验方法统计学差异极其显著,一致性较低,如果只用其中一种方法进行诊断会出现误诊、漏诊现象,漏检率可达到23.17%~24.39%。因此,对于布病的确诊不能单纯依靠SAT或CFT一种方法,还需要采用SAT和CFT相结合的方法进行综合判定。
ELISA方法在布病诊断方面作为一种相对较新的血清学诊断技术,在诊断操作特性上与CFT效果相当,甚至敏感性和特异性更好,操作简单且比较稳定,判定时用酶标仪,避免了人为因素的干扰[10],适于畜群筛选和动物个体检查。通过本试验发现,i-ELISA、c-ELISA方法与RBPT的符合率、检测为阳性的样品数量均高于SAT和CFT;i-ELISA、c-ELISA方法与SAT和CFT两种方法综合判定结果无显著差异,且具有较好的一致性。i-ELISA与c-ELISA两种方法的一致性也相当好,两种检测方法的检测结果无统计学差异。虽然i-ELISA高度敏感,但不能鉴别牛种布鲁氏菌19号苗免疫接种产生的抗体或其它假阳性问题和自然病原菌株诱导产生的抗体。因此,在检测时i-ELISA可以作为一种筛选方法而不是确诊方法。c-ELISA较i-ELISA特异性更高,可以消除部分由细菌交叉反应引起的非特异性反应,并可以排除绝大多数牛种布鲁氏菌19号苗免疫接种产生的残留抗体的反应。因此,c-ELISA可以作为本病的确诊方法之一。
牛布鲁氏菌 篇5
美国农业部下属的农业研究中心日前发表了一篇新的研究报告, 指出在牛饲料中添加橘子皮有可能减少奶牛胃肠道中的流行性病原菌, 例如大肠杆菌和沙门氏菌。
研究人员发现, 羊在饲喂了混有橘皮的饲料之后, 其肠道内沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的数量减少到了原来的十分之一。
研究中心的研究项目还开启了其他两项独立的研究:其中一项聚焦于柑橘油的抗菌性能, 另一项则研究将柑橘残渣用于动物饲料生产的可能性。研究指出, 橘皮中含有一种化学物质, 对猪和家禽有毒害作用, 然而对于牛而言, 由于牛都有四个胃, 因此完全有能力消化橘皮。研究中心接下来将在全美范围内实际测试混有橘皮的饲料对牛只的影响。
牛布鲁氏菌 篇6
研究表明,Rp1L基因表达的核蛋白L7/L12是布鲁菌中比较重要的疫苗靶蛋白,具有高度的氨基酸序列保守性,可以促进INF-γ基因的转录和表达,从而提高机体的免疫能力[3]。本试验应用流式细胞仪筛选出分泌核蛋白L7/L12抗体的杂交瘤细胞株,与传统方法比较可提高单克隆抗体的表达量及活性,还可以减少单克隆抗体的筛选步骤,同时为后续基因工程疫苗机理和布鲁菌检测方法的研究奠定基础。
1 材料
1.1 试验动物
Balb/c雌性小鼠,6~8周龄,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。
1.2 菌体及细胞
含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)、SP2/0骨髓瘤细胞,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。
1.3 主要试剂
聚乙二醇(PEG)、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂,Sigma公司生产;羊抗鼠Ig G-HRP,购自Thermo公司;HAT培养基、HT培养基、RPMI 1640培养基,购自Invitrogen公司;藻红蛋白标记试剂盒,购自Innova Biosciences公司;TMB显色液及其他试剂,Amresco公司生产;NC膜和3 mm滤纸,购自Whatman公司。
1.4 主要仪器
流式细胞仪,购自ABI公司;Ni-NTA纯化预装柱,购自GE公司。
2 方法
2.1 重组布鲁菌核蛋白L7/L12的表达及纯化
将含重组表达载体p ET28a-L7/L12的Rosetta(DE3)菌株活化,并接种至LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养过夜;次日取1%培养液转接于LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养至OD600值为0.4~0.6时,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达[4]。收集菌体进行超声波破碎,离心后分别收集菌体上清液和沉淀,SDS-PAGE电泳分析重组核蛋白L7/L12-组氨酸(His)的表达情况。在目的蛋白可溶性表达时,可以直接应用Ni-NTA纯化预装柱对菌体上清液进行纯化,再用紫外分光光度仪测定蛋白浓度[4,5]。
2.2 免疫小鼠
用无菌PBS缓冲液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至200μg/m L,加入等体积的弗氏完全佐剂进行混匀乳化,取6~8周龄雌性健康Balb/c小鼠,首次免疫剂量为100μg,分别在小鼠背部皮下、腹腔及腿肌进行多点注射;首次免疫15 d后进行第2次免疫,取等量蛋白加入弗氏不完全佐剂,免疫方法同首次免疫;首次免疫30 d后进行第3次免疫,方法同第2次免疫;于细胞融合前3天腹腔注射等剂量蛋白(不加佐剂)进行末次加强免疫。
2.3 血清效价的检测
采用间接ELISA方法测定小鼠血清效价,并分别设置阴性对照和空白对照,用包被液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至2μg/m L,加到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃包被过夜。次日,用PBST洗涤3次,每次5 min;吸干液体后每孔加入200μL含5%脱脂奶粉的PBST,37℃封闭1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干待用。试验组每孔加入100μL适当稀释的免疫小鼠血清,阴性对照为稀释的未免疫小鼠血清,空白对照加入PBST,37℃孵育1 h;然后用PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后每孔加入100μL羊抗鼠Ig G-HRP(按照1∶5 000比例稀释)温育1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后加入TMB溶液显色10 min左右,加入终止液终止反应,用酶标仪测定OD450值[6]。
2.4 应用流式细胞仪筛选单克隆抗体
末次免疫3 d后,按照1∶10比例将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,1 000×g离心3 min;弃上清液,将管底细胞敲击松散后置37℃水浴箱中,并沿管壁加入1 m L预热的PEG,45 s内滴加完毕;静置45 s后缓慢加入RPMI 1640培养基10 m L终止反应,1 000×g离心3 min;弃上清液,将细胞重悬于HAT培养基(含20%胎牛血清)中,再与制备好的饲养层细胞混匀,加到T-75培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱中培养5 d;加入10 m L HAT培养基,之后换成含20%胎牛血清的HT培养基继续培养。
按照藻红蛋白标记试剂盒说明书标记重组核蛋白L7/L12-His,制备标记好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,用流式细胞仪筛选单克隆抗体。待细胞密度生长至培养瓶1/4时,将筛选后的融合细胞吹打至悬浮,收集细胞悬液,1 000×g离心3 min;弃上清液,用无菌PBS洗涤细胞后离心;弃上清液,加入PBS稀释好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,结合40 min;用无菌PBS洗涤细胞3次,将其置于流式细胞仪中筛选,并将筛选出的阳性细胞株分至96孔细胞培养板中,每孔为单细胞,将培养基血清浓度调整至30%,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
2.5 杂交瘤细胞株的体外培养及检测
当96孔细胞培养板中细胞生长至单孔的60%时,取细胞培养上清液,采用间接ELISA法检测抗体,筛选出表达量较高的单克隆细胞株。
2.6 免疫杂交鉴定杂交瘤细胞株
对纯化后的重组核蛋白L7/L12-His进行SDS-PAGE电泳,同时点样Marker进行对照;电泳结束后,采用半干法进行转膜,200 m A转膜40 min;将重组核蛋白L7/L12-His转移至硝酸纤维素膜上,用丽春红染色拍照后洗掉,将膜封闭;1 h后弃掉封闭液,以杂交瘤细胞株分泌的细胞上清液作为一抗孵育2 h;洗膜后加入羊抗鼠-HRP二抗孵育,将硝酸纤维素膜放入超敏发光液A和B中,混合均匀,待荧光显色后进行曝光。经显影定影后,将胶片清洗干净,风干,拍照。
2.7 单克隆抗体特异性的检测
对牛型布鲁菌菌体蛋白、重组核蛋白L7/L12-His、含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)(阴性对照)、布鲁菌外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳和转膜,然后分别用筛选出的细胞株上清液进行Western-blot检测。
3 结果与分析
3.1 布鲁菌重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化
重组核蛋白L7/L12-His为可溶性表达,在菌体上清液中,分子质量约为14.0 ku,与预期结果相符。菌体破碎后其上清液经Ni-NTA纯化预装柱纯化,并用紫外分光光度计测定,结果蛋白浓度为1.5 mg/m L。重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化结果见图1。
3.2 免疫小鼠血清效价的检测
通过间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价,分别对阴性血清和免疫小鼠血清进行稀释,稀释度为1∶200~1∶12 800,根据(阳性血清-空白对照)/(阴性血清-空白对照),即P/N>2.1为阳性的原则选取血清最佳稀释倍数,根据表1数值计算,血清稀释度为1∶800时P/N呈阴性,其最大值为2.081,以其为血清最佳稀释倍数,测定血清效价为1∶6 400。
3.3 流式细胞仪筛选结果(见图2)
由图2可知,该样品有2个明显的峰值,第2个信号峰即为高效表达L7/L12抗体的细胞。
3.4 单克隆抗体效价的检测结果
通过ELISA检测,对比OD450值选出其中3株表达量较高的杂交瘤细胞株D6、E7、G9,对细胞株上清液进行1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800梯度稀释,ELISA检测发现,细胞培养上清液效价均可达到1∶1 600~1∶3 200,将其继续传代3个月以上,并用液氮冻存,复苏后进行ELISA检测,结果这3株杂交瘤细胞均可以高效、稳定分泌L7/L12蛋白抗体。
3.5 杂交瘤细胞株培养上清液的免疫杂交鉴定(结果见图3)
由图3可知,细胞株分泌的单克隆抗体均可以与重组蛋白发生特异性免疫反应,分子质量约为14.0 ku。
3.6 单克隆抗体特异性检测结果
3株单克隆抗体均可以与布鲁菌全蛋白和原核表达的核蛋白L7/L12特异性结合,而不与另外2个样品反应,说明其特异性较好,不存在交叉反应,以D6杂交瘤细胞株Western-blot分析为例,结果见图4。
4 讨论
布鲁菌病主要由布鲁菌引起,可以导致人畜共患病[1]。近年来,全球人与牲畜的发病率呈攀升趋势。目前,主要应用疫苗预防布鲁菌病,广泛使用的疫苗是弱毒疫苗,对机体的保护效果比较好。但此类疫苗也存在两方面缺陷,一方面是不能辨别人畜的抗体产生来源;另一方面是具有返祖现象、毒性较大,会对机体造成伤害。因此,针对布鲁菌病防治的进一步研究极为重要[7,8]。
齐齐哈尔大学动物学实验室应用p ET28a成功地表达了具有免疫原性的核蛋白L7/L12,创新性地应用流式细胞仪筛选出高效表达单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Western-blot检测结果表明,该抗体效价高,免疫特异性较强。与传统方法比较,该方法缩短了筛选时间,节约了人力、物力,而且可以避免传统筛选方法造成的抗体交叉反应现象。
制备单克隆抗体的重要因素之一是制备纯度较高、具有免疫原活性的重组蛋白,本试验优化了菌体培养条件,使其可溶性表达,避免了包涵体的变性及复性等操作,极大地保留了蛋白的天然结构和活性。本试验应用重组核蛋白L7/L12制备单克隆抗体,便于纯化,且分子质量较小,不影响免疫小鼠。
可以确定,经流式细胞仪筛选的杂交瘤细胞株是单克隆细胞株,细胞培养上清液的效价达1∶3 200,Western-blot检测结果表明,分泌的单克隆抗体能与牛型布鲁菌全菌体蛋白和重组核蛋白L7/L12发生特异性免疫反应,因此可应用此单克隆抗体检测布鲁菌,同时也为后续研究基因工程疫苗的机制奠定了基础。
摘要：为了制备牛型布鲁菌核蛋白L7/L12的单克隆抗体,试验采用流式细胞仪与间接ELISA相结合的方法进行单克隆筛选,以及Western-blot分析。结果表明:最终筛选出3株表达量较高的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液的抗体效价可达1∶3 200,3株单克隆抗体均能与核蛋白L7/L12发生特异性结合,无其他交叉反应。
关键词：布鲁菌,核蛋白L7/L12,单克隆抗体,效价,流式细胞仪,杂交瘤
参考文献
[1]白文彬,于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002.
[2]BIKAS C,JELASTOSTOPULU E,LEOTSINIDIS M,et al.Epidemiology of human brucellosis in arural area of north-western Peloponnese in Greece[J].Eur J Epidemiol,2003,18(3):267-274.
[3]梅建军,任林柱,王兴龙.布鲁氏菌检测技术的研究进展[J].动物保健,2006,9:13-15.
[4]CLOECKAERT A,JACQUES L I,GRILLM J,MARN C M,et al.Development and evaluation as vaccines in mice of Brucella melitensis Rev.l single and double deletion mutants of the bp26 and omp31 genes coding for antigens of diagnostic significance in ovine brucellosis[J].Vaccine,2004,22(21/22):2827-2835.
[5]胡森,郑孝辉,王加兰,等.马耳他布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定[J].中国预防兽医学报,2009,31(8):583-586.
[6]MINAS A,STOURNARA A,CHRISTODOULOPOULOS G,et al.Validation of a competitive ELISA for diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep and goats[J].Vet J,2008,177(3):411-417.
[7]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001.