木质素过氧化物酶

木质素过氧化物酶（精选五篇）

木质素过氧化物酶 篇1

关键词：白腐真菌,木质素酶,分子生物学,进展

存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解, 导致了秸秆的难降解性。要彻底降解纤维素, 必须首先解决木质素的降解问题。因此, 秸秆利用的研究从过去的降解纤维素的研究转向了木质素的降解研究。而且一些研究资料表明, 木质素含量和消化率成反比, 降解秸秆木质素和改造其结构, 可以大幅度的提高秸秆作为饲料的可利用性。

自然界中, 木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果, 其中真菌起着主导作用, 放线菌降解能力次之, 细菌降解能力最弱。降解木质素的真菌主要有3类:白腐菌、褐腐菌和软腐菌。其中, 白腐菌降解木质素的能力相对较强, 而且分泌胞外氧化酶降解木质素时不产生色素, 因此应用最广, 研究也最深入。

白腐真菌 (white rot fungi) 是一类丝状真菌, 分类学上属于真菌门, 绝大多数为担子菌纲, 少数为子囊菌纲。目前研究最多的有:黄孢原毛平革菌 (Phanerochete chrysosporium) 、彩绒草盖菌 (Coridusversicolor) 、变色栓菌 (Thametes versicolor) 、射脉菌 (Phlebia radiata) 、凤尾菇 (Pleurotus pulmononanus) 等。其中黄孢原毛平革菌是其典型种, 也是研究木质素降解的模式菌, 普遍分布于北美, 我国尚未发现[1]。

1 白腐真菌主要酶系及理化特性

2000年吕镇梅等研究了白腐菌对造纸黑液中木质素的降解及影响因素, 发现白腐菌的降解作用发生在次级代谢阶段, 与降解过程有关的酶只有当一些主要营养物质, 如氮、碳、硫限制时才形成, 能彻底降解木质素、纤维素和半纤维素为CO2和H2O。而其降解木质素主要是由于生长活动过程中分泌释放能降解木质素的酶系的缘故。

1.1 白腐真菌降解木质素的主要酶系

白腐真菌在对营养限制应答反应时形成一套酶系统, 包括以下几种[2]:①产生H2O2的氧化酶:一是细胞内的葡萄糖氧化酶, 二是细胞外的乙二醛氧化酶。它们在分子氧的参与下各自氧化相应底物——葡萄糖或乙二醛, 形成H2O2, 从而激活过氧化物酶, 启动酶的催化循环。②需要H2O2的过氧化物酶:白腐真菌主要合成两类过氧化物酶——木质素过氧化物酶 (LiP) 和锰过氧化物酶 (MnP) 。③漆酶、还原酶、甲基化酶、蛋白酶及其它酶。这些酶共同组成白腐真菌降解系统主体。

以上酶的全部或部分组成白腐真菌降解系统的主体, 也就是说并非所有的白腐真菌都能同时分泌LiP, MnP和漆酶, 有些只能分泌其中2种, 如Lentinula (L-entinus) edodes只产生MnP和漆酶, 黄孢原毛平革菌则分泌LiP和MnP[3]。有文献报道黄孢原毛平革菌也能产生漆酶, 但是在以葡萄糖为碳源生长时产生的量很少。因此说明这3种酶在分解木质素过程中并不都是必须的。

1.2 白腐真菌木质素降解酶的理化特性

1.2.1 木质素过氧化物酶 (Lip) 的理化性质

木质素过氧化物酶 (LiP, EC1.11.1.14) 是最早发现的木质素降解酶, 有研究者采用拉曼共振、核磁共振、X-衍射分析等技术对LiP酶的结构进行分析, 揭示了LiP酶的晶体结构是一个典型的含有血红素分子的血红蛋白[4]。目前已知只有几种白腐菌能够产生LiPs, 分子量大约40kDa, 是糖基化的, 有酸性等电点和偏酸性的最适pH值, 它们包含一个亚铁原卟啉IX血红素半体。它能通过单电子氧化并引起一系列自由基反应, 氧化富含电子的非酚类芳香化合物, 能使木质素大分子降解。LiPs氧化还原电位为1.5V, 是唯一能够直接降解非酚型木质素的白腐真菌关键酶[5]。这种酶易受H2O2的影响而失活, 并且木质纤维素基质的一些成分有抑制和覆盖LiPs活性的作用。

1.2.2 锰过氧化物酶 (Mnp) 的理化性质

在真菌分泌的降解木质素的非特异性细胞外氧化还原酶中, 锰过氧化物酶 (MnP;EC1.11.1.13) 起着至关重要的作用, 同时能够很容易在白腐真菌以木质纤维素基质作底物时检测到MnP的存在, 几乎所有能引起木材白色腐朽的担子菌和各种栖息土壤的枯落层降解担子菌都能产生这种酶。MnP分子与LiP相似, 也是一种糖蛋白, 由一个红血素基和一个Mn2+构成它的活性中心。这种糖基化的亚铁血红素蛋白质通常以多种复合的形式产生, 即有多种同工酶, 分子量 (MW) 一般在38kDa~62.5kDa之间, 稍大于LiPs, 大多数纯化后的MnP的分子量都在45kDa左右。这些同工酶主要是等电点不同, 通常具有偏酸性的最适pH值 (pH3~4) 。但在某些真菌中也发现有等电点为弱酸性和中性的MnP同工酶。它也是依赖H2O2的过氧化物酶, 酶促反应需要锰离子, 在离体条件下能分解芳香环多聚体。锰过氧化物酶的催化循环反应如下:

1.2.3 漆酶 (Lac)

漆酶 (EC1.10.3.2) 是一种多酚氧化酶, 属于蓝色氧化酶亚族。它广泛存在于真菌中的担子菌、半知菌和子囊菌中, 在一些昆虫、细菌和植物中也有漆酶的存在。漆酶也是一种典型含Cu2+的糖蛋白, 具有特征性吸收光谱。具有单体、双体和四聚体形式, 一般以单体形式存在。白腐真菌漆酶的分子量在60kDa~80kDa之间, 其中含有15%~20%的碳水化合物。有酸性等电点, 最适pH值在3.5~7.0之间。漆酶可以由大多数的白腐菌产生, 而P.chrysosporium是著名的缺乏漆酶的特例。Lac主要攻击木质素中的苯酚结构单元, 在反应中, 苯酚的核失去一个电子而被氧化, 产生含苯氧基的自由活性基团, 可导致C氧化、C-C裂解和烷基芳香基裂解。Lac同时具有催化解聚和聚合木质素的作用, 因此单独存在时不能降解木质素, 只有同时存在MnP等其他酶, 避免反应产物重新聚合时, 才有较高的木质素降解效率[6]。

1.3 白腐真菌产木质素酶的营养调控

在自然条件下, 大多数白腐真菌合成的酶量很低。国内外研究者曾利用多种不同的碳源、氮源、微量元素、培养条件等来研究他们对白腐菌产酶能力、关键酶系构成和酶活性的影响。结果表明, 碳源、氮源、微量元素以及通氧量均是微生物降解木质素和产酶的重要因素。

碳源:种类不同, 菌株产木质素降解酶所需的最适碳源也不同。Kirk[7]的实验证明, 用单一木质素做唯一碳源, 黄孢原毛平革菌不能生长, 往往要在培养基中加入如纤维素、葡萄糖等容易被利用的碳源才能生长。李翠珍等筛选出1株白腐真菌F2, 并对其产木质素降解酶特性进行了研究, 结果表明, 限碳有利于F2产LiP, 但对F2产Mn P的影响不是很明显。Pickard研究了几种稻谷麸皮原料, 包括麸皮、麦麸、燕麦麸等, 结果证明以麸皮为碳源产生的酶活最高, 此研究对于目前降解秸秆资源具有实际意义。

氮源:纯培养的研究表明, 氮源的耗尽与受限是启动次生代谢及其木质素降解系统形成的主要原因。但这个结论大多是以黄孢原毛平革菌为实验菌株, 并不能推广到其他的真菌。有研究表明, 复杂的有机氮源酵母浸汁和牛肉膏培养基中木质素过氧化物酶酶活最高。而菌丝体的产酶效率以酒石酸铵最好;硝酸铵、硫酸铵、丙烯酰铵和L-谷氨酸也有利于酶的合成。

氧:木质素降解是一个氧化过程, 只能在有氧条件下降解, 在厌氧条件下不能降解。大量研究表明纯培养中提高氧浓度水平可促进黄孢原毛平革菌对木质素的降解, 其它白腐菌中也发现了类似的现象。李华钟等 (2002) 实验发现通纯氧可使黄孢中LiP活力提高50%, 但对Mn P的影响不大。Dosoretz等人考察限氮浸没培养条件下通氧和通空气对两种过氧化物酶合成的影响, 发现通空气条件下菌丝不合成木质素过氧化物酶, 能合成锰过氧化物酶, 但酶活较通氧条件下的酶活低。Zadrazil F (1994) 研究了CO2浓度对Pleurotus sajor-caju降解木质素及消化稻草的影响。当空气中CO2在0-20%内升高时, Pleurotus sajor-caju对稻草木质素的降解率提高, 超出该值后降解率开始降低。

微量元素:对白腐真菌产木质素降解酶有重要影响的微量元素主要是Mn和Cu。Bonnarme等人研究了Mn2+对锰过氧化物酶合成的调节作用, 发现Mn P的合成是由Mn2+诱导的, 当培养基中缺乏Mn2+时就不能合成MnP。Mn2+的浓度在0~40 mg/L之间时, 浓度越高越有利于Mn P的合成, 当Mn2+浓度超过200mg/L时酶活性有所下降。而Cu2+对于漆酶的产生和酶活性也是相当重要的, 但是过多又会抑制漆酶的表达分泌。研究发现, 发酵培养基中不添加Cu2+时, 漆酶活性极低;添加量在0~5 mol/L范围内, 酶活水平随Cu2+浓度的增加迅速提高;当大于10mol/L以后, 漆酶酶活水平反而降低。

诱导物与表面活性剂:诱导物不仅能诱导木质素降解酶的产生, 还起到分散剂和保护剂的作用, 研究较多的是藜芦醇 (VA) 。表面活性剂主要是提高细胞膜的渗透性, 菌种不同, 最适的表面活性剂也不同, 研究最多的是吐温–80。Maria C.Terron (2004) 研究表明, -香豆酸和愈创木酚对Trametes sp I-62可明显提高漆酶的产量。在培养黄孢原毛平革菌的过程中, 添加HgCl2能提高过氧化物酶特别是Li P的稳定性和酶活。

2 白腐真菌的降解机理

细胞学定位表明, 白腐真菌对木质素的降解发生在细胞外, 这种细胞外降解系统为众多不可水解的、异质的、结构复杂的大分子有机物提供更易被处置的调节环境。利用抗血清及免疫标记技术, 在细胞壁降解阶段对LiP、MnP和Lac进行定位, 发现这些酶并不进入完好的、未被降解的木材内。而且在木腐的初期阶段, 细胞壁内也未发现降解木素的酶。研究证明:大分子的蛋白, 例如分子量大于40000Da的降解酶类, 明显地不能穿过完整木材中的微孔结构。只有当细胞壁发生了深度破坏, 才在次生壁胞间层中发现了酶[8]。说明在降解初期白腐真菌的降解发生在细胞外。

白腐真菌能以自由基为基础的链反应过程对木质素进行降解。先是木质素解聚, 形成许多有高度活性的自由基中间体, 继而以链式反应方式产生许多不同的自由基, 导致各种连接键断裂, 使木质素解聚成各种低分子量片段, 其中小于1kf的占多数, 再经完全彻底氧化直到降解为CO2。这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的, 正好对应于木质素结构的多变性, 方能完成这种异质大分子高聚物的瓦解。

木质素过氧化物酶 (LiP) 以低浓度H2O2为氧化剂, 经历一个双电子氧化步骤和两个单电子还原步骤, 使非酚型芳香族底物形成阳离子自由基, 后者再进行一系列非酶催化的反应从而导致芳香环裂解。当H2O2和二羧酸螯合剂 (如丙二酸盐和草酸盐) 存在时, 锰过氧化物酶 (MnP) 能氧化Mn2+成为Mn3+, 后者再进一步氧化各类酚型化合物, 如2, 6-二甲氧基酚、香草丙酮和苯酚等。在许多真菌中, MnP是木质素起始降解的关键酶, 因为MnP可产生强氧化态的Mn3+, Mn3+又可作为可扩散的氧化还原介质再进一步裂解木质素聚合物中的芳香环部分, 然后在其他酶的协同作用下, 最终导致大分子的断裂。而漆酶作用于多酚类及芳香胺类化合物的机理研究已较为深入。一般认为, 漆酶将单电子传递给分子氧, 使其还原成H2O, 同时从酚类底物分子中获取电子使之形成半醌自由基, 该自由基随后再发生非酶催化的反应。用白腐真菌处理秸秆时, 秸秆不需进行化学或物理的预处理, 即对底物没有选择性。

3 白腐真菌木质素降解酶的分子生物学研究进展

白腐真菌在分子生物学方面的研究主要为基因的发现、测序以及外源表达3个方面。

3.1 木质素过氧化物酶基因

黄孢原毛平革菌编码liP的基因组成已基本明确, 其li P家族由至少10个结构上紧密关联的基因编码, 它们分别被命名为liPA~liPJ, 同源性很高。核型分析表明, 异源真核菌株含有10个染色体, 而liP基因至少被分布在两个染色体上[9]。Stewart等建立了liP基因的物理图谱, 4个基因liPA、liPB、liPC、liPE定位于一个35kb的区域, liPG、liPH、liPI、liPJ定位于一个15kb的区域, liPD和liPF不与其他的基因相连。

LiP基因编码的成熟蛋白包括343~345aa, N-端约有1个27~28aa的分泌信号肽。LiP基因均含有8或9个内含子, 大小49~79pb, 5'端非编码区核苷酸序列包括典型的启动子保守盒, TATA盒位于翻译起始点上有66~81bp, CAAT盒位于107~228bp范围。从P.chrysosporium培养液中分离出来的Li P同功酶种类有2~15种不等, 依赖于所采用的菌株, 培养环境以及纯化流程。LiP同功酶分子量为38~43kD, 等电点为313~417。从以二甲基琥珀酸 (DMS) 为缓冲液, 低氮培养的P.chrysosporium BKMF-1767培养液中, 分离得到10种胞外过氧化物酶同功酶, 按照从阳离子交换柱洗脱下来的顺序分别被命名为H1~H10, 其中H1, H2, H6, H7, H8和H10是木质素过氧化物同功酶, 以H2为主, H3, H4, H5和H9是锰过氧化物同功酶[10]。

3.2 锰过氧化物酶基因

从P.chrysosporium的胞外液中分离出至少6种MnP的同工酶, 均由多基因编码。在MnP基因中, 编码区核苷酸序列的同源性约为50%~65%, 氨基酸序列的同源性在50%以上, 编码375aa组成的成熟蛋白, 同样有分泌信号肽。MnP基因含有6或7个内含子, 50~72bp, 6个内含子的位置是保守的, mRNA位点也同样是保守的, 遵循GA-TG法则。MnP基因5'端上游序列在启动子保守盒 (TATA和CAAT盒) , 翻译位点高度保守 (GCAATGG) , 具有一些保守顺式调控元件, 如AP2、热激应答元件 (HRH) 、金属离子应答元件 (MRE) 。在基因表达方面, MnP的产生明显依赖Mn2+浓度、培养基、热休克、C和N源变化, 且调节是在转录水平上[11]。

3.3 漆酶基因

漆酶是由一个结构相近的基因家族编码, 许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序。Eduardo karahanian等 (1998) 从Coprinus cinerens中克隆出3个漆酶基因Lac1、Lac2和Lac3。其中Lac1含7个内含子, 大小为54~70bp, 成熟蛋白约521个氨基酸, 有3个潜在的N-连接糖基化位点, C端有23个氨基酸的延伸序列, 富含Arg和Lys, 其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C端延伸区。Lac2和Lac3均有13个内含子, 表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80%。Lac3和Lac1的氨基酸同源性58%, Lac2和Lac1的氨基酸同源性59%, 而Lac3与Aspergillus nidulan漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此, 真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低, 但在铜结合区具有较高保守性[12]。

4 小结

白腐真菌木质素降解酶系是一个庞大又极其复杂的系统, 其内涵随着研究的深入而不断扩大, 但确定单一酶在木质素降解中的功能非常困难, 从各种酶单独和复合降解木质素的效果来看, 这些酶具有协同作用。但当体系中的一些条件发生变化时, 这几种木质素降解酶又会相互抑制, 所以各种酶具体如何分工协作降解木质素仍然需要探讨。对白腐真菌的研究早已从酶学向分子生物学深入, 在确定酶系的同时, 更加关注酶的表达调控和编码基因的结构。但是实际利用白腐真菌降解木质素受到了菌种以及培养条件的制约, 因此, 进一步筛选在较宽泛的环境条件下降解木质素及类似结构的异生物质的白腐真菌菌种具有非常重要的理论意义和应用价值。

参考文献

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枇杷果实过氧化物酶活性的抑制 篇2

关键词：枇杷；过氧化物酶；酶促褐变；抑制剂

中图分类号：TS255.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0316-02

果蔬的加工和贮藏常与果蔬本身存在的酶类有密切关系，其中过氧化物酶（POD）是引起果蔬加工过程及贮藏期间变色、变味的重要因素之一[1-2]。枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.），别称卢橘，是中国南方特有的珍稀水果，其果肉柔软多汁，酸甜适度，味道鲜美，被誉为“果中之皇”[3]。枇杷果实有止咳、化痰、理气的药用功效[4]。作为药食两用的枇杷水果，自古以来就倍受人们青睐。市面上以枇杷果肉为原料加工的产品种类繁多，如枇杷饮料、枇杷果酒、枇杷果酱、枇杷果脯等[5]。但枇杷鲜果不耐贮运及加工，极易产生褐变而变质。目前，针对枇杷POD活性及其对褐变影响研究报道甚少。为提高枇杷贮藏保鲜和加工品质量，本试验以新鲜枇杷果实为材料，研究了pH值、温度、3种抑制剂对枇杷果实过氧化物酶活性的影响，为枇杷加工和贮藏防褐技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

枇杷品种为解放钟，选择成熟、新鲜无损伤的枇杷果实为供试材料。

1.2 试剂与仪器

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、愈创木酚、30% 过氧化氢、亚硫酸钠、硫脲为分析纯。维生素C为生化试剂。

UV2100型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司生产；FA2004电子天平：上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂生产；JJ-2组织捣碎匀浆机：富华仪器有限公司生产；HH-2数显恒温水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所生产；GL-20G-Ⅱ型飞鸽牌低温冷冻离心机；PHS-2C型精密酸度计：上海雷磁仪器厂生产。

1.3 方法

1.3.1 枇杷POD粗酶液的制备 参照王学奎的方法[6]，略有修改。将枇杷果实去皮、去核，称取果肉10 g，加入适量 4 ℃ 预冷的磷酸盐缓冲溶液（0.05 mol/L，pH值6.0），冰浴研磨成匀浆，定容到25 mL容量瓶中，放于4 ℃冰箱里浸提30 min，10 000 r/min离心20 min，上清液即为酶的粗提液，低温保存备用。

1.3.2 枇杷POD活性的测定 参照李合生的方法[7]，略有改进。反应体系为0.05 mol/L pH值5.8磷酸缓冲液 2.5 mL、0.05 mol/L愈创木酚1.5 mL、2% H2O2 0.5 mL、0.5 mL 酶液。在室温下，于D470 nm处比色。酶液加入后开始计时，1 min后第1次读数，然后每30 s 记录1次吸光度D随时间的变化值，对照以缓冲液代替酶液，重复测3次。本试验以D470 nm的变化值表示POD活性的变化。

1.3.3 pH值对枇杷POD活性的影响 取pH值分别为20、3.0、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2.5 mL，按“1.3.2”节方法，测定不同pH值下POD 活性的变化。以最高酶活力为 100%，计算POD相对酶活性。

1.3.4 温度对枇杷POD活性的影响 将未加入酶液的反应体系先分别在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃条件下保温10 min，加入0.5 mL酶液后继续在原来的温度条件下保温3 min，按“1.3.2”节方法测定不同温度条件下POD活性的变化。以最高酶活力为 100%，计算 POD 相对酶活性。

1.3.5 抑制剂对枇杷POD活性的影响 向反应体系分别加入各种浓度的抑制剂0.5 mL，缓冲液的量相应减少0.5 mL，按“1.3.2”节方法测定PPO活性。酶活性大小按无抑制剂时的酶活性百分比表示。各种抑制剂在反应体系中的浓度，维生素C：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L；亚硫酸钠：20、40、60、80、100 mmol/L；硫脲：0.01、0.05、0.10、0.15、020 mmol/L。

2 结果与分析

2.1 pH值对枇杷POD活性的影响

从图1可见，POD 活性受环境pH值影响不大。pH值在较大范围3.0～7.0之间，POD 的相对酶活都能保持在63%以上，当pH值为 2.0、8.0 时，POD相对酶活仍有45.0%、446%。枇杷果实的最适pH值为5.4，本结果与林建城等报道的枇杷最适pH值为5.0[8]有所不同。可能与枇杷品种、酶液纯度不同等因素有关。

2.2 温度对枇杷POD活性的影响

温度对枇杷POD活性影响明显。在35 ℃以下，酶活性随着温度的上升而升高，当温度达到35 ℃时，酶活性最大，此温度为酶的最适温度，温度大于 35 ℃时，酶活性迅速下降。枇杷POD活性呈现出的这种变化与温度对其他酶活性的影响规律相符合。当反应体系温度为5、65 ℃时，POD相对活性分别为33.5%、19.3%（图2）。表明調节温度能有效抑制POD的活性，特别是在较高温度条件下这种影响更为显著。

2.3 不同抑制剂对枇杷POD活性的影响

2.3.1 维生素C对枇杷POD活性的影响 维生素C对POD活性有很好的抑制作用。随着维生素C浓度的增加，枇杷POD 活性逐渐降低，当维生素C浓度为 0.02 mmol/L 时，POD相对活性降低到57.8%，当维生素C浓度达到 0.05 mmol/L 时，POD活性基本被完全抑制（图3）。

2.3.2 硫脲对枇杷POD活性的影响 随着硫脲浓度的增加，总体抑制POD效果越来越明显。在浓度为0.01～0.10 mmol/L 范围内，硫脲对POD活性的抑制作用程度变化不大，POD相对活性仅从79.7%降低至72.9%，当硫脲浓度大于0.10 mmol/L时，随着硫脲浓度的增加，POD相对活性迅速降低，当硫脲浓度达到0.20 mmol/L时，POD 相对活性降低到 28.1%（图4）。

2.3.3 亚硫酸钠对POD活性的影响 亚硫酸钠对POD活性的抑制效果与维生素C相似。随着亚硫酸钠浓度的增加，POD活性逐渐降低，当亚硫酸钠浓度达到80 mmol/L 时，POD相对活性降低到16.8%，当浓度为100 mmol/L 时，POD相对活性降低到12.1%，酶促褐变基本得到抑制（图5）。

从3种抑制剂对POD活性影响程度可以看出，3种抑制剂的抑制效果为：维生素C> 硫脲>亚硫酸钠。目前认为，维生素C对褐变的抑制并非是直接抑制POD活性达到的，而是将POD氧化生成的有色醌类物质迅速还原成酚类物质，从而抑制初产物的生成量，最终抑制黑色素的生成[8]；硫脲抑制可能是通过对酶中二硫键的还原，使酶变性，也可能是与铁辅基络合使酶失活[9]；而亚硫酸钠抑制褐变主要是通过不可逆地与醌生成无色的加成物，与此同时降低了酶与一元酚和二元酚作用的活力[10]。

3 结论与讨论

枇杷果实POD的最适温度为35 ℃，低温5 ℃、高温 65 ℃ 均可大大降低POD活性，尤其是高温条件下影响更为显著。因此，通过高温处理可以有效控制其加工产品的酶促褐变。

枇杷果实POD的最适pH值为5.4，当 pH值为2.0、8.0时，POD的相对酶活仍有45.0%、44.6%。，因此，通过控制 pH值较难起到抑制酶活性的作用。

3种抑制剂对枇杷POD活性均有不同程度的抑制作用，且抑制作用随着处理浓度的增加而增强。3种抑制剂的抑制效果为：维生素C> 硫脲>亚硫酸钠。由于亚硫酸钠、硫脲存在一定安全隐患，生产上可选用可食性维生素C抑制剂来控制枇杷制品的酶促褐变。

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木质素过氧化物酶 篇3

关键词：白腐真菌,木质素,解酶,应用

木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳-碳键连接而成的具有三维空间结构的高分子芳香族类聚合物,组成单元的结构及其连接键复杂而稳定,使得木质素很难降解[1]。在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合,并将纤维素分子包埋其中,形成一种坚固的天然屏障,使一般微生物很难进入其中分解纤维素。因此,纤维素的分解关键在于木质素的降解。在自然界中,木质素的完全降解是真菌、细菌和相关微生物群落共同作用的结果,其中真菌起重要的作用,典型的木质素分解真菌是白腐真菌[2]。

1 白腐真菌

白腐真菌是一类能使木材呈白色腐朽的丝状真菌。分类学上白腐真菌属于真菌门,主要为担子菌纲,少数为子囊菌。它相对于纤维素类成分更易降解木质素,在腐朽木质素过程中几乎是同时破坏多糖和木质素,能在一定条件下将木质的主要成分(木质素、纤维素、半纤维素)全部降解为CO2和H2O。由于白腐真菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素,所以白腐菌被认为是目前最为理想的的一类降解木素的真菌[3]。

目前研究较多的白腐真菌种类有黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、彩绒革盖菌(Coridus versicolor)、变色栓菌(Thametes versicolor)、射脉菌(Phlebia ra-diata)、凤尾菇(Pleurotus pulmononanus)、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)等[4]。

2 白腐真菌木质素降解酶

在20世纪80年代,木质素降解酶有了突破性研究。1983年美国的Tien和Kirk带领2个研究小组[5],分别从黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)发现了木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,简称Lip)。翌年,Cold小组[5]又从黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Bued)发现了锰过氧化物酶(mangnase peroxidase,简称MnP)以及由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶(Laccase,简称Lac),共同构成了白腐真菌的木质素降解酶系[3]。

LiP和MnP都是含正铁的血红素糖蛋白,需要在过氧化氢存在下降解木质素。它们的不同在于催化机制———从芳香族底物(苯酚或非酚类)的芳环中夺取单个电子的方式。LiP直接可以与芳香族底物反应,形成阳离子自由基,引起芳环结构的开裂、木素单体烷基侧链的氧化;MnP用木质组织中广泛存在的Mn2+作为反应底物,将Mn2+氧化成Mn3+,Mn3+从酶的表面扩散离开,再去氧化酶类化合物、不溶性的终底物及木质素[3,4,6]。

Lac是一种含铜的酚氧化酶,最早从漆树的分泌物中发现[7],现在研究发现这种酶存在于很多种真菌中。漆酶在氧的参与下,将单电子传递给分子氧,使其还原成水;同时,从酚类底物分子中获取电子形成半醌自由基,该自由基再发生非酶催化反应。在这一过程中,漆酶从底物分子中提取1个电子,使之形成自由基,该自由基不稳定,可进一步发生聚合或解聚反应,导致键的不稳定,从而打断木质素分子[6,8,9]。

3 白腐真菌降解木质素的机理

白腐菌对木质素的降解是一个以过氧化物酶(LiP和MnP)为启动者的自由基链反应。首先,木质素在木质素降解酶的作用下发生解聚,生成许多高度反应性的自由基中间体;然后以链反应的方式产生许多不同的自由基,导致种种连接键的断裂,使木质素解聚成各种低分子量片段,其中小于1ku的占多数,再经过完全彻底的氧化直至降解为CO2[10]。

白腐真菌对木质素的降解主要是细胞外的氧化过程。在适宜的条件下,白腐真菌的菌丝首先用其分泌的超纤维氧化酶溶解植物表面的蜡质;然后菌丝进入植物内部并分泌释放降解木质素的酶系。在过氧化物氢存在的情况下,LiP、MnP以及Lac协同作用于连接木质素结构单元之间的酯键或醚键,首先使木质素分解成单个的结构单元,然后再进一步催化苯丙烯醇之间的Cα-Cβ键断成两分子的苯丙烯醇,最后苯丙烯醇断链降解为小分子的化合物完成木质素的降解[11]。

4 白腐真菌降解木质素的应用

(1)农作物秸秆的饲料化。白腐真菌不仅可以将秸秆等农副产品中动物难以利用的木质素进行降解,还可以把秸秆中的低质非蛋白氮(NPN)转化为较高质量的菌体蛋白[12]。宋瑞清等[13]选用稻草作为原料培养基,接种平菇30d后,木质素降解率为23.36%,蛋白质含量增加了45.85%。杭怡琼等[14]研究表明,白腐真菌对稻草秸秆中木质素的降解率平均可达37.76%,其中14d时的木质素降解率最高达到21.98%。更让研究人员感兴趣的是,经白腐真菌处理后的秸秆不仅营养成分有了极大提高,而且其酸度由未处理前pH值6.5~7.0降到了pH值4.0左右,有水果香味,并且秸秆质地柔软,适口性明显改善[15]。用白腐真菌处理秸秆饲料时,秸秆饲料不需要进行化学或物理预处理,即对底物没有选择性[16]。

(2)造纸工业。白腐真菌降解木质素广泛应用于造纸工业中的生物机械制浆、生物漂白及废水处理等过程[3]。生物机械制浆是指在机械制浆之前,利用白腐真菌对木片进行预处理,降低磨浆能耗及提高产品质量[17]。例如:Settliff[18]利用Ceriporiopsis subvermispora和P.chrysosprium对杨木和挪威云杉进行预处理,与未用菌处理相比,杨木可降低20%的能耗、云杉降低13%的能耗;用Phlebia brevispora进行生物制浆预处理降低47%的能耗,并增加了纸浆的张力[19];邓耀杰[20]研究表明:白腐真菌能较好地降解制浆等工业废水中的难降解的芳香族化合物;邹世春等[21]利用改进的PVA-H3BO3包埋白腐真菌P.chrysosporium处理有机废水,其中的烃类物质降解率在80%以上,而且随着微生物固定化技术的进一步成熟,微生物对工业废水的处理能力将会进一步增强。

(3)食品工业。在食品工业中,由于啤酒、果汁等饮料中含有酚或芳胺类物质,因而在生产以及储存期间常常出现浑浊或沉淀。可以利用白腐真菌木质素降解酶中的漆酶氧化饮料中的多酚物质,达到净化饮料的目的[22]。例如:苹果汁用固定化漆酶处理后,可除去其中的儿茶素、绿原酸等酚类物质,从而可以在长期储存中保持澄清;漆酶可氧化红葡萄酒中的色素,使红葡萄酒呈色或改变葡萄酒的颜色[23]。漆酶还可以改善面团的品质。由于面筋蛋白中的半胱氨酸(主要二硫键的数目和大小)是面筋的空间结构和面团形成的关键,漆酶可以将面筋蛋白中的巯基氧化为二硫键,使面筋蛋白发生交联,从而改善面团的功能性质,使面团更耐搅拌并且干而不粘[24]。

(4)生物堆肥。生物堆肥是指利用微生物的降解作用将秸秆等有机物转化为有机肥料的1种资源化方法。由于白腐真菌在生长活动中分泌木素降解酶、纤维素降解酶以及半纤维素降解酶,将白腐真菌应用到堆肥中,可以有效地降解秸秆中的木质纤维素,再将木质纤维素转化为腐殖质[25]。黄丹莲等[26]在农作物秸秆堆肥中加入白腐真菌后,木质素的降解率达到43.86%,远高于未接种菌剂的堆肥中木质素的降解率,表明在堆肥中接种白腐真菌菌剂,可加速堆肥过程,使堆肥中木质素降解更为彻底。

5 结语

两种早熟禾过氧化物酶同工酶分析 篇4

草地早熟禾 (Poa Pratensis L.) 属于早熟禾属多年生草本植物, 具直伸或匍匐根茎, 根茎繁力强, 耐牲畜践踏, 营养丰富, 是各种牲畜喜食的优质牧草[2]。由于其既能进行种子繁殖也能进行根茎型无性繁殖, 抗寒耐旱, 是适合三江源区“黑土型”退化草地植被恢复与重建的优良草种, 也是在高寒草甸地区建植高质量的打草或放牧人工草地的优良草种。

青海扁茎早熟禾 (Poa Pratensis L. var. Ance) 为草地早熟禾变种, 是青海畜牧兽医学院草原所于2004年申报的青藏高原地区驯化选育的第一根茎型野生栽培新品种, 具有根茎发达、分蘖强的特性, 固土保水能力强, 具有极强的抗寒性和耐寒性。在-35 ℃低温下能安全越冬, 可以适应高寒牧区旱作种植, 是适合三江源地区“黑土型”退化草地植被恢复与重建的优良草种。

由于青海扁茎早熟禾为草地早熟禾的变种, 二者的形态特征较为相似, 但作为分类依据的器官结构较细微, 而且受环境影响变异性较大, 形态学变异很难反映其遗传差异。植物体内的同工酶在一定部位、一定发育时期的酶谱存在着相对稳定性, 在一定程度上能够反映植物个体间的遗传差异。故同工酶作为品种遗传性的指标之一, 已广泛应用于研究品种的起源演化及分类等方面[3,4], 为育种工作者提供重要的遗传信息。过氧化物酶是广泛存在于植物体内的重要酶类, 能反映植物生长发育的特点、体内代谢状况以及对外界环境的适应性, 也能在一定程度上反映供试材料间的遗传差异。试验通过对不同生育期的草地早熟禾与其变种青海扁茎早熟禾进行过氧化物酶同工酶分析, 探讨该种内品种间的亲缘关系[5], 从生化水平上为研究品种分类提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

草地早熟禾和青海扁茎早熟禾种子, 青海省畜牧兽医科学院草原所提供。2010年10月份将种子播种于花盆, 在室内培养。于2010年11, 12月份分别采其健康幼叶和旗叶作为供试材料[6]。

1.2 测定项目

在青海省农林科学院作物所实验室, 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳方法[7]对草地早熟禾和青海扁茎早熟禾幼叶和旗叶中的过氧化物酶进行测定、分析。

1.3 主要仪器和用品

JY系列电泳仪、垂直板型电泳槽、凝胶成像系统、离心机、冰箱、冰桶、1/10 000分析天平、微量移液器、酸度计、烧杯、白磁盘、搅拌器、研钵等, 由青海大学畜牧兽医科学院提供。

1.4 药品及试剂

丙烯酰胺 (Acr) 、甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 、三羟基氨基甲烷 (Tris) 、四甲基乙二胺 (TEMED) 、过硫酸铵 (Ap) 、甘氨酸、联苯胺、过氧化氢、溴酚蓝 、醋酸钠、乙醇浓盐酸、冰醋酸、醋酸-α-萘酯、醋酸-β-萘酯、丙酮、溴酚蓝等, 均购自西宁市。

1.5 聚丙烯酰胺凝胶系统和相关溶液的配制

电极缓冲液的配制 (pH值为8.3) :称取0.25 mol/L三羟基氨基甲烷3 g、1.92 mol/L甘氨酸14.4 g, 用超纯水定容至100 mL, 用时稀释10倍。

样品处理液:5 mL甘油、0.5 mL 0.1%溴酚蓝、5 mL浓缩胶缓冲液, 加水14.5 mL。

提样缓冲液:稀释4倍的浓缩胶缓冲液。

染色液的配制:称取醋酸联苯胺0.5 g, 加入少量无水乙醇溶解, 依次加入5 moL/L冰醋酸、1.5 moL/L醋酸钠 50 mL、纯化水 350 mL及几滴双氧水。

分离胶缓冲液:称取3 mol/L Tris-HCl加纯化水36.6 g, 再用酸度计调pH值至6.8, 定容至100 mL。

浓缩胶缓冲液 (pH值为6.8) :称取0.5 mol/L Tris-HCl 6.0 g溶于40 mL纯化水中, 用 1 mol/L HCl 4 mL左右, 调pH值至6.8, 定容至100 mL。

分离胶与浓缩胶的配方见表1。

1.6 样品的制备

分别称取草地早熟禾和青海扁茎早熟禾叶片 (幼叶和旗叶) 各0.4 g, 洗净, 用滤纸吸干水分, 剪碎, 置于预冷的小研钵中, 滴入1.8 mL提样缓冲液, 在冰浴中研磨匀浆, 移入离心管中4 ℃、10 000 r/min离心15 min, 取上清液0.5 mL加入等量的样品处理液, 备用。

1.7 加样和电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统, 分离胶浓度为7.5%, 浓缩胶浓度为3%, 电极缓冲液为Tris-Gly缓冲液 (pH值为8.3) , 上样量每槽为20 mL。双垂直板电泳仪电泳时采取稳流电泳, 浓缩胶电压为200 V, 分离胶电压为220 V, 电泳时间约为4 h, 温度控制在4 ℃左右。

1.8 染色、固定及照相

从玻璃板上取下凝胶, 将其置于白瓷盘中, 加入染色液, 轻轻摇动至不再呈现酶带为止, 之后倒去染液, 用水漂洗, 用生物凝胶成像系统照相。根据同工酶迁移率 (Rf) (Rf=酶带的迁移距离/前沿指示剂的迁移距离) 绘制模式图。

2 结果与分析

2.1 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾幼叶期过氧化物酶同工酶酶谱特征 (见图1)

注:A1、B1、B2、C1、C2、C3、D1、D2、D3表示相应区中的波谱带。1～3.草地早熟禾;4～6.青海扁茎早熟禾。

2.1.1 酶带及酶谱分布特征

2种早熟禾过氧化物同工酶经电泳后, 显示的酶谱带8～9条不等。从酶谱表征可以看出, 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾的酶谱上有8条共同的谱带, 同类品种的酶谱具有较稳定的相似性。把它们分成A、B、C、D 4个区, 其中A区有1条酶带, 染色较深, 2种植物均有表现;B区有2条酶带;C区酶带数2～3条不等, 该区染色最深, 活性最高;D区有3条酶带, 染色较浅。C1是青海扁茎早熟禾幼叶期的特征谱带 (Rf=0.23) , 而草地早熟禾却没有这条谱带。

2.1.2 酶活性

在试验中发现, 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾同工酶染色时间不同, 前者较后者染色时间短, 说明草地早熟禾的活性较强, 而扁茎早熟禾的活性较弱。酶带的染色深浅在一定程度上也反映酶活性的强弱不同。2种早熟禾在B区的2条酶带中, B2在前者为强带, 在后者为弱带。

2.1.3 过氧化物酶同工酶酶谱的迁移率

见表2。

草地早熟禾与青海扁茎早熟禾溴酚蓝 (即前沿指示剂) 在幼叶期迁移率的差异不大。溴酚蓝 (即前沿指示剂) 的迁移距离为13.96 cm。2种早熟禾幼叶期同工酶共显现出17条酶带 (草地早熟禾8条、青海扁茎早熟禾9条) , Rf值变动在0.02～0.49之间, 酶带出现的频率差异不是很大, 说明2种早熟禾遗传相似程度较高。

2.2 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾旗叶期过氧化物酶同工酶酶谱特征 (见图2)

注:A1、B1、B2、C1、C2、C3、D1、D2、D3表示相应区中的波谱带。1～3.草地早熟禾;4～6.青海扁茎早熟禾。

2.2.1 酶带及酶谱分布特征

2种早熟禾过氧化物酶同工酶经电泳后, 显示的酶谱带6～9条不等, 从酶谱表征可以看出, 同类品种的酶谱具有较稳定的相似性。把它们分成A、B、C、D 4个区, 其中A区有1条酶带, 染色较深, 2种早熟禾均有表现;B区有2条酶带, 分为染色较深的条带和染色较浅的条带, 2条带因品种的不同, 其分布有差异;C区染色浅, 酶带有3条, 过氧化物酶同工酶在该区表现出比较大的差异;D区有3条酶带, 染色较浅。D区是草地早熟禾的特征带 (Rf=0.51～0.60) , 为草地早熟禾旗叶期所独有的谱带。

2.2.2 酶活性

在试验中发现, 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾过氧化物酶同工酶旗叶期染色时间不同, 前者比后者染色时间短, 说明草地早熟禾旗叶期过氧化物酶同工酶活性较强, 而扁茎早熟禾过氧化物酶同工酶活性较弱。同一带级酶活性的强弱也不同, 2种牧草在B区的过氧化物酶同工酶酶带中, B1在前者为弱带, 后者为强带。在C区的2条酶带中, C1、C3在前者为强带, 后者为弱带。

2.2.3 过氧化物酶同工酶酶谱的迁移率

见表3。

由表3可见:草地早熟禾与青海扁茎早熟禾溴酚蓝 (即前沿指示剂) 在旗叶期迁移距离的差异不大。溴酚蓝的迁移距离为14.66 cm。草地早熟禾与青海扁茎早熟禾旗叶期同工酶共显现出15条酶带 (草地早熟禾9条, 青海扁茎早熟禾6条) , 迁移率在 0.01～0.60之间变动, 酶带出现的频率差异不是很大, 说明2种早熟禾遗传相似程度较高。

3 讨论

从酶谱表征可以看出, 草地早熟禾与青海扁茎早熟禾在幼叶期的酶谱上谱带数分别为8条、9条, 其中8条为共同的谱带;在旗叶期的谱带数分别为9条、6条, 其中6条为共有带, 故认为草地早熟禾与青海扁茎早熟禾的亲缘关系较近。

草地早熟禾与青海扁茎早熟禾在幼叶期及旗叶期过氧化物酶同工酶酶谱的谱带数、迁移率和表达量都存在不同程度的差异。最明显的是, 扁茎早熟禾在幼叶期比草地早熟禾多了1条谱带C1, C1是青海扁茎早熟禾幼叶的特征谱带 (Rf=0.23) , 而草地早熟禾却没有这条谱带;且其在D2区酶的表现量也明显高于草地早熟禾。另外, 草地早熟禾在B区的表现量高于青海扁茎早熟禾。

在旗叶期, 最明显的是草地早熟禾在D区有3条染色较浅的酶带, 这是草地早熟禾旗叶期独有的谱带, 青海扁茎早熟禾没有这条谱带。其次在B区和C区酶的表达量都有明显差异。其中C区草地早熟禾酶的表达量明显高于青海扁茎早熟禾。

草地早熟禾与青海扁茎早熟禾所特有的酶谱表征可以证明, 这2个早熟禾属植物具有独立的遗传关系, 二者之间有一定的遗传分化。

草地早熟禾与青海扁茎早熟禾的过氧化物酶同工酶酶谱类型十分丰富, 而且在植株发育的不同时期过氧化物酶同工酶酶谱的分布、活性及表达量均有所不同。2种早熟禾在不同时期各自都有共同带和特异带。

采用过氧化物酶同工酶对同属不同物种及种内不同品种进行分析, 不仅能客观地反映物种及品种间的遗传差异和它们的亲缘关系, 而且可以利用其进行物种的辅助鉴定, 是一种较为方便、有效的手段。过氧化物酶同工酶在早熟禾中广泛而大量地存在, 具相对稳定性。同一发育时期, 过氧化物酶同工酶酶谱和活性强弱是稳定的, 能反映草地早熟禾与青海扁茎早熟禾的遗传特性。

草地早熟禾与青海扁茎早熟禾在酶带数量、位点及分布格局上有一定的相似性, 共有带数量较多, 说明2种早熟禾间存在着亲缘关系。同时, 2种早熟禾的酶带数量、带级、位点及活性强度等表现出一定差异, 各自具有特征谱带, 且所具有的共有带的带级各不相同, 酶的活性也不尽相同, 以此证明这2个早熟禾属植物为2个独立的物种。另外, 二者在不同生育阶段的同工酶酶谱表征也不相同, 说明同工酶具有阶段特异性、组织特异性和生理特异性。利用同工酶分析可区分种间、品种间的细微差异, 是对形态学分类的重要补充和延伸, 可为正确选择杂交亲本和杂种后代的鉴定提供依据。

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木质素过氧化物酶 篇5

荞麦 (Buckwheat) 属于蓼科荞麦属[7,8,9,10,11]。有15个自然物种和1个人工合成种。分为大粒组和小粒组, 2个组间遗传差异很大[12,13,14]。荞麦种质资源中蕴藏着丰富的遗传变异, 是实现荞麦遗传改良的物质基础[15]。该研究比较和分析了荞麦属28个种质资源的过氧化物酶同工酶, 以期为荞麦属种间系统关系、荞麦遗传育种、荞麦开发利用等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料共有28份 (见表1) , 27份来自内蒙古各盟、市的地方品种。其中乌兰察布市5份、鄂尔多斯市3份、包头市3份、赤峰市4份、通辽市3份、呼和浩特市9份, 及黑龙江地区材料1份。

1.1.1 仪器

恒温培养箱、瓷质研钵、高速台式冷冻离心机、冰箱、DYY-Ⅲ-6B型稳流稳压电泳仪、DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽、电子天平、制冰机、50 μL微量进样器。

1.1.2 药品

三羧甲基氨基甲烷 (Tris) 、四甲基乙二胺 (TEMED) 、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘草酸、过硫酸胺、蔗糖、溴粉蓝、联苯胺、过氧化氢。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

将28份供试材料于2007年5月20日晒种, 5月23日播种于内蒙古农业大学职业技术学院科技园区。田间试验采用随机区组排列, 每个材料1行, 行长6 m, 行距30 cm, 3次重复。播种深度3 cm, 播量为30 kg·hm-2。管理同一般生产田。室内各项指标的测定在内蒙古农业大学职业技术学院园艺园林系实用植物生物学基础实验室及内蒙古农业大学农牧渔业生物实验研究中心进行。

1.2.2 同工酶的测定

同工酶测定采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法。样品制备方法:取新鲜植株花蕾下第一片叶, 用蒸馏水清洗干净并用滤纸吸干水分。称取叶片1 g加入5 mL 0.1 mol·L-1 pH 8.9的电极缓冲溶液中, 将其置于冰域中研磨成匀浆, 再置于4℃冰箱中提取10 min, 于3 500 r·min-1离心10 min, 取上清液即为酶谱提取液。

聚丙烯酰胺凝胶液的配制:聚丙烯酰胺凝胶液由A液、B液和C液组成。A液:取1 mol·L-1盐酸48 mL, 三羟甲基氨基甲烷36 g, 四甲基乙二胺0.24 mL, 定容至100 mL;B液:聚丙稀酰胺30 g, 甲叉双丙稀酰胺0.8 g, 定容至100 mL, C液:过硫酸胺0.56 g, 定容100 mL;将其按A液∶B液∶水∶C液=1∶2∶1∶4配成胶液。

电极缓冲液的配制:三羟甲基氨基甲烷6 g, 甘氨酸28.8 g溶于1 000 mL蒸馏水中, 使用时稀释10倍。

染液的配制:取醋酸联苯胺溶液按0.5 g联苯胺+4.5 mL冰醋酸溶解后置于18 mL蒸馏水中即可。

各凝胶管加入0.05 mL样品酶粗提取液, 加一小滴0.005%溴酚蓝, 上下电泳槽加电极缓冲液, 每管电流2 mA进行电泳, 当溴酚蓝迁至凝胶下端1 cm左右时停止电泳, 电泳完毕后, 取下凝胶用蒸馏水漂洗3次, 再放入染液中浸泡5～10 min, 待条带清晰后, 倒掉染液并用蒸馏水洗净、测量并照相[16]。

2 结果与分析

植物的过氧化物酶同工酶是由单基因决定的, 所以同工酶的差异来自基因的差异。28种荞麦品种的同工酶迁移率见表2。

从28种荞麦种质的过氧化物酶的酶谱带来看, 都具有不同数量的共同的酶谱带, 而8714和88021只有一条共同的酶带, 所以88021、8714与其它26种荞麦相比地理起源较远, 即亲缘关系较远, 而另外26种荞麦虽具有共同的谱带, 但谱带的数量、宽窄、深浅以及相对迁移率等又不相同, 说明它们之间既有亲缘关系又有遗传差异, 属于不同的属、种、品种类型。

有研究结果表明, 荞麦抗病性与过氧化物酶同工酶的活性关系密切, 感病品种比抗病品种过氧化物酶的活性强, 相对迁移率大, 因此可以根据氧化同工酶的活性和酶带位置衡量品种抗病性的强弱[17]。由表2可知, 同工酶谱带迁移率的均值:赤0004>呼0002>赤0002>通0001>88027>8714>平荞2号>呼0003>六荞1号>乌0003>呼0001>昭苦1号>乌0002>通0002>88021>乌0001>通0003>赤0001>乌0005>乌0004>赤0003>伊0002>固引1号>伊0001>伊0003>固0001>103>固0002, 由此可以推断, 固0002的抗病性最强, 赤0004的抗性最差。另外, 过氧化物酶同工酶谱带亦可以反映植物的抗寒性, 过氧化物酶同工酶的种类多者抗寒性强[17], 所以乌0005的抗寒性最强, 伊0003微强, 88021和8714最差。

3 讨论