微型月季组织培养（精选三篇）
微型月季组织培养 篇1
关键词：月季,愈伤组织,组织培养,诱导培养基
1 实验步骤
1.1 培养基母液的配制和保存
用电子天枰逐个称取, 依次倒入盛有一定蒸馏水的烧杯中, 搅拌混匀溶解, 定容至1L, 保存在棕色试剂瓶中, 贴好标签, 注明名称和日期。
1.1.1 MS大量元素母液
1.7g KH2 PO4+3.7g Mg SO4·7H2O+16.5g NH4·NO3+19g KNO3+4.4g Ca Cl2·2H2O。
1.1.2 MS微量元素母液
4.46g Mn SO4·4H2O+1.72g Zn SO4·7H2O+1.24g H3BO3+0.166g KI+0.05g Na2Mo O4·2H2O+0.005g Cu SO4·5H2O+0.005g Co Cl2·6H2O。
1.1.3 MS铁盐母液
7.46g Na2·EDTA+5.56g Fe SO4·7H2O。
1.1.4 MS有机母液
0.1g甘氨酸+0.02g盐酸硫胺素+0.025g盐酸吡哆素+0.025g烟酸+5g肌醇。
1.2 MS培养基的配制
1.2.1 配制培养液
用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量于1L烧杯中, 制备培养液:100ml MS大量元素母液+5ml MS微量元素母液+5ml MSMS铁盐母液+20ml MS有机母液。
1.2.2 溶化琼脂与调p H
用天平分别称取琼脂7g、蔗糖30g, 放入烧杯中, 再加入蒸馏水750 m L, 用微波炉加热直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中, 再加入生长调节物质:0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA, 最后加蒸馏水定容至1L, 搅拌均匀。用1 mol/L的Na OH溶液调节p H到6.2为止。
1.2.3 培养基的分装
溶化的培养基趁热分装, 瓶中培养基的量约为瓶容量的1/5~1/4, 每瓶大约40~50ml, 分装23~30瓶即可, 及时封盖瓶口, 贴上标签。培养基配制完毕后, 应立即灭菌。
1.3 实验器皿等的清洗、包扎、灭菌
在组培瓶中加入100ml蒸馏水, 准备5瓶, 封口包扎;取枪状镊子、普通镊子各1把、2把剪刀, 用报纸和橡皮圈包扎好, 作为诱导月季不定芽和愈伤组织的接种工具;培养基;2个500ml烧杯、3个培养皿 (内有滤纸) 用报纸包扎。将以上材料一齐放入高压灭菌锅进行高压灭菌。
1.4 外植体的灭菌消毒及接种
外植体先用肥皂水涮洗, 再用流水冲洗干净, 放入灭菌的烧杯中。将培养基、无菌水、接种工具、酒精灯等置于接种台, 打开超净工作台紫外线开关, 同时打开接种室内的紫外灯, 用紫外灯照射30min, 然后关闭室内的紫外灯, 开送风开关, 关闭台内的紫外灯, 通风10min。再开日光灯进行无菌操作。
接种前用肥皂水洗手, 并用酒精棉球擦拭双手和台面。将70%的酒精倒入外植体的烧杯中浸泡30s, 再倒入0.1%Hg Cl浸泡10min, 重复无菌水清洗5道。无菌滤纸吸干水分, 将茎段和叶片放在装有滤纸的培养皿上吸干水分。接种时茎基部朝下, 将其1/3部分植入培养基;叶片应包含一部分中脉, 将叶片平置于培养基上, 下表面朝下, 接触培养基。
在培养瓶上写上日期, 移入培养室进行培养。培养温度25度左右, 光强1500~20000lx, 光照时间14h/d。2周后观察诱导情况。
2结果与分析
外植体对愈伤组织状态的影响:
经过实验观察, 发现两种外植体经过培养均诱导出愈伤组织, 叶片和茎段愈伤组织形态上差异不明显, 愈伤组织多数呈淡黄色, 松散程度不一, 但叶片诱导率愈伤组织100%, 比茎段稍高。
3小结
叶片和嫩茎均可用于诱导愈伤组织。愈伤组织的形成与否和长势好坏还受外植体材料、生长调节剂浓度、消毒等诸多因素的共同影响。其中, 生长调节剂的种类、用量及配比对调控植物器官产生愈伤组织的作用, 还有待进一步研究。月季生长繁殖速度较慢, 应用组织培养技术可大大缩短它的增殖周期, 必将带来巨大的经济效益、社会效益。
参考文献
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丰花月季低成本组织培养快繁的研究 篇2
关键词： 丰花月季；组织培养；快繁；低成本
中图分类号： S685.120.4+3 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0053-03
寒地丰花月季是近几年培育出的丰花月季新品种系列。具有能够在黑龙江地区露地越冬、花期长、耐粗放管理特点，亟需大量的苗木以进入推广应用环节。但是，通过一般的扦插繁殖，不仅繁殖速度慢、效率低、种苗易退化，而且成苗率受季节、插穗质量、插穗位置、基质、温度等诸多因素的影响，难以在相对较短的时间内获得大量种苗。因此，采用组织培养的方式进行快速繁殖是推动寒地丰花月季尽快推广应用的首选繁殖方法。然而，现有较成熟的丰花月季组织培养方案存在成本过高的问题，只有降低扩繁过程中的各项成本投入，才能在实际应用中产生更大经济效益、社会效益和生态效益。
本着节约成本、减少投入，同时提高生产效率，为丰花月季提供规模化生产模式的目的，本研究以寒地丰花月季“粉-A”为试验材料，通过对初代培养使用的器皿类型以及继代增殖阶段对培养基配制环节和配制原料的使用进行选择性的试验，寻找适宜丰花月季低成本组织培养快繁的生产模式，为丰花月季规模化、工厂化组织培养生产提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为丰花月季“粉-A”，由东北农业大学园林植物应用课题组提供。
1.2 培养条件
试验应用的常规培养基中水质为蒸馏水，碳源为30 g/L的蔗糖，卡拉胶浓度为6.5 g/L，初代和继代的培养基配方均为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，pH值5.8～6.0，培养条件温度（25±2） ℃，光照时长10～12 h/d，光照度 1 500～2 000 lx。
1.3 试验方法
1.3.1 培养容器对丰花月季组织培养降低成本的效应 设计初代培养容器单因素试验，2个因素分别为：（1）带盖透气塑料试管（直径5 mL，长15 mL）；（2）玻璃三角瓶（50 mL）。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。统计单位面积容器的摆放数量，20 d后统计其初代培养的污染率、芽苗生长情况，30 d后统计培养基失水、开裂的有效时间。培养基为常规培养基。
1.3.2 水质对丰花月季组织培养的影响 设计水质单因素试验，4个因素分别为：（1）蒸馏水；（2）自来水；（3）白开水；（4）沉淀白开水（自来水煮沸，静置2～3 h后，取上层液）。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。检测不同水质的pH值、电导率，观察培养基外观，60 d后统计其继代的生长情况。培养容器为50 mL玻璃三角瓶，培养基中除水质外，其他为常规培养基配方。
1.3.3 碳源对丰花月季组织培养的影响 碳源的单因素试验中2个因素分别为：（1）蔗糖；（2）白砂糖。蔗糖浓度为 30 g/L，白砂糖浓度3个水平分别为30、20、10 g/L。其他培养条件相同，30 d统计其污染率，60 d统计其继代的生长情况。培养容器为50 mL玻璃三角瓶，培养基中水质为沉淀白开水。
1.3.4 溶胶方式对丰花月季组织培养的影响 （1）传统培养基：在培养液中添加卡拉胶后进行加热熬制，至卡拉胶全部溶解后，对每一个培养容器进行定量分装，高压灭菌后，取出自然冷却。（2）不熬制培养基：先将定量的卡拉胶6.5 g/L均匀地添加进去，再将培养液均匀倒入每个培养容器中，按量定容，进行高压灭菌后，取出自然冷却。
初代培养每个塑料试管培养基定量为5 mL，卡拉胶含量为0.033 g，50 mL玻璃三角瓶培养基定量为20 mL，卡拉胶含量为0.13 g。继代培养中每个100 mL玻璃方瓶培养基定量为40 mL，卡拉胶含量为0.26 g。其他培养条件相同，观察培养基的外观、平均凝固时间和软硬程度，60 d统计继代的生长情况。培养基中水质为沉淀白开水，碳源为 20 g/L 白砂糖。
2 结果与分析
2.1 培养容器对丰花月季组织培养降低成本的效应
传统植物组织培养中，多以玻璃三角瓶为培养容器，最大优点是透光性好，一般使用于科学研究。但是，三角瓶占用空间大，并需要较多的培养基，在大批量生产中会相应增加生产成本。
本试验以50 mL玻璃三角瓶为对照，用塑料试管对丰花月季进行初代培养试验，培养容器对丰花月季组织培养，可有效降低生产成本（表1）。
表1 不同培养容器对丰花月季组织培养的效果
[HJ*5][BG（！][BHDFG4*2，WK5，WK4。6W]容器 摆放数量（个/m2） 每容器培养基体积（mL） 污染率（%） 培养基有效时间（d） 原料价格（元/个） 生长情况
[BHDG1*2]玻璃瓶 289 20 10.6 25～30 3.5 芽苗健壮
塑料试管 1 000 5 3.4 35～40 0.8 芽苗健壮
从表1可以看出，用试管代替三角瓶作为初代培养容器对丰花月季初代芽的生长状况无显著影响；但由于试管的占用空间小，在同样单位面积的组培架上的摆放量是三角瓶的3.46倍，1 m2可多摆放711棵苗；试管盛装的培养基仅为三角瓶的25%；初代组培苗的污染率试管容器比三角瓶降低了68%，可能与口径及培养基表面积较小有关；同时，由于试管盛装的培养基深度较大，在相同时间内配制的培养基的有效时间，试管要比三角瓶长10 d左右；另外，用试管代替三角瓶作为初代培养容器，容器价格由原来的3.50元降至080元，每个试管成本为三角瓶的22.86%。
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带盖试管在丰花月季组培生产的初代培养中进行应用，不仅可以提高单位面积的摆放数量，减少培养基用量，降低污染率，降低容器成本，由于用带盖塑料试管接种初代月季外植体时，省去了用三角瓶接种时拆掉和固定封口膜的时间，可以在单位时间内接种更多的外植体。在丰花月季规模化、工厂化生产中可极大地提高工作效率，节省空间，降低成本。
2.2 水质对丰花月季组织培养的影响
在组织培养中，蒸馏水制备是费时、费工、费电的过程，在试验阶段用量较少时购买蒸馏水比较合算，但是在规模化生产中购买或制备蒸馏水配制培养基成本都会极大提高，如果自来水经过简单处理能够作为基质水源使用，无疑是最经济合理的。
本试验以蒸馏水为对照，分别用自来水、白开水、沉淀白开水配制培养基进行丰花月季的组培试验，不同水质对丰花月季生长的影响见表2。
从表2可以看出，不同水质的pH值从低到高依次为蒸馏水、自来水、白开水、沉淀白开水；水质pH值的大小对组培苗生长无影响，用蒸馏水和自来水配制培养基时，需加碱能达到规定pH值；用白开水和沉淀白开水配制培养基时，需加酸能达到规定pH值。电导率测量主要用来检测水的纯净度，是检测水中离子杂质的一种有效、简便和可靠的方法 [1]。从不同水质的电导率可以看出，自来水中的离子杂质最多，蒸馏水离子杂质含量极少；使用蒸馏水和沉淀白开水配制的培养基均为透明、无色且无杂质沉淀，二者对组培苗的生长、叶色和长势也都有利，植株生长较好。自来水在不添加任何药剂的情况下进行高压灭菌，会在瓶壁上产生大量白色水垢，影响瓶壁的透光性，因此将自来水煮沸，使杂质沉淀，取上层液用于配制培养基效果较好。
2.3 碳源对丰花月季组织培养的影响
碳源在组织培养试验中消耗量较大，传统培养基需要蔗糖30 g/L，是培养基中支出较大的部分。本试验以30 g/L蔗糖为对照，分别用30、20、10 g/L白砂糖配制培养基进行丰花月季的组培试验，不同碳源对丰花月季生长的影响见表3。
蔗糖和白砂糖的成分几乎相近，是葡萄糖和果糖脱水化合而成的还原性二糖。培养基中的糖，无论是蔗糖还是白砂糖都是先转化为葡萄糖再为月季的分化所吸收利用 [2]。白砂糖的市场价为蔗糖的1/10，大大节约了月季组织培养的生产成本。糖是各种微生物生殖繁衍的碳源，一旦被微生物侵染，很快在培养基上繁殖造成污染，使组织培养的成本上升，不利于规模化生产 [3]。从表3可以看出，当碳源为10 g/L白砂糖时，污染率最低，但是组培苗叶片颜色偏黄，苗细弱，长势较弱；碳源为30 g/L蔗糖、30 g/L白砂糖时，组培苗的叶片均为深绿色，苗生长健壮，长势旺盛，污染率较高，蔗糖成本高；碳源为20 g/L白砂糖时，植株生长健壮，叶片绿色，长势旺盛，污染率偏低，成本较低。
研究结果表明，组织培养苗长期依赖外源糖，叶片表皮结构发育不良，叶片小，叶绿素含量降低，丧失光合作用能力或光合作用受到抑制，影响组织培养苗的质量 [4]。适当降低糖（碳源）浓度，有利于提高组培苗的质量、降低污染率。综合考虑上述因素，在丰花月季规模化、工厂化组织培养中，在对组培苗影响不大的情况下应尽量用较低的糖浓度。
2.4 溶胶方式对丰花月季组织培养的影响
传统配制培养基时，在添加卡拉胶后需要进行加热熬制，目的是为了将卡拉胶完全溶解于培养液中，有利于培养基的凝固，但是在大量生产月季组培苗时，熬制培养基是耗费时间和能源的过程。
[JP3]本试验以传统熬制培养基的方法为对照，与在溶液中添加培养基原料后直接进行高压灭菌，省略了熬制过程的培养基进行继代生长状况比较，不同溶胶方式对组培苗生长的影响见表4。
从表4结果可以看出，用2种方式配制培养基，无论是培养基外观、平均凝固时间、软硬度还是植株叶色、长势都较一致，对试验结果无不良影响。由此可见，在培养基配制过程中，溶液中添加卡拉胶后直接进行高压灭菌的方式是可行的，可以为丰花月季规模化、工厂化组织培养生产简化操作程序，节省能源，提高培养基配制效率。
3 与结论与讨论
[JP2]在继代增殖培养中，组培苗需要增殖分化，如果选用塑料试管（透气）作为培养容器空间太小，会影响组培苗的生长，因此塑料试管（透气）只适合作为月季组培的初代培养容器。曾有人利用密封的塑料袋来代替玻璃容器进行草本植物的继代培养，而对于月季这样的木本植物，密封的塑料袋易变形，不利于组培苗营养的吸收。可用果酱瓶和普通玻璃瓶来代替三角瓶作为继代培养容器。那宁馨等用果酱瓶等小罐头瓶替代三角瓶培养芦荟 [5]，程丽芬用广口果酱瓶代替三角瓶培养珍稀阴生观叶花木 [6]，李江等用玻璃瓶代替三角瓶培养樱桃 [7]，均不会影响组培苗的增殖和生长。因此对于培养容器来说，只要容器空间大小适宜，透光性好是最重要的选择条件。
从碳源角度降低培养成本，无糖培养无疑是最佳选择。李宗菊等用无糖培养基，在强光高CO2浓度条件下，小植株增重生长显著 [8]，表明在外界增施CO2的前提下，一些组织培养苗可以在少糖或无糖的培养基中生长得更好。但是，培养过程中提高培养环境的CO2浓度需要密闭性极好的空间，这种措施的实际操作性还有待进一步完善。
本试验中在培养基不熬制的情况下，为做到快速准确，添加卡拉胶需要找出容积正好为5、20、40 mL的容器和盛装卡拉胶的量为0.033、0.26 g的盛具。本试验中通过多次试验，利用不同型号的EP管并进行适度人工修整，制作出一套适合的容器和盛具。在规模化、工厂化的组培生产中，由于培养液和卡拉胶的量是定量添加到容器中的，根据需要定制称量容器和盛具，甚至是机械化称量，都具有较高的可行性。
降低组织培养成本的其他措施：庞淑敏等用蛭石代替高成本琼脂作为马铃薯快繁培养基的支持体 [9]；张和琴用蛭石固化物代替琼脂为月季生根 [10]；郑加协等用不加琼脂的简化培养基对蜜宝菠萝的芽继代增殖和生根进行液体浅层培养 [11]。张继东用果酱瓶代替烧杯作接种器械冷却支架试验 [12]。培养室温度、光源和外植体不同部位的选择也是降低成本的重点考虑因素，降低或控制月季组培过程中的污染率，也是降低生产成本不可忽视的关键问题。
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在进行植物组织培养规模化生产中，节约生产成本、提高生产效率的措施落实在各个环节，通过系统的规划和设计，以最低的产能高效生产植物组培苗是完全可行的。
[JP2]带盖试管代替玻璃三角瓶（50 mL）应用在丰花月季组培生产的初代培养中，单位面积的摆放数量增加为原来的3.46倍，培养基用量减少为原来的25%，并减少了68%的污染率，培养基有效时间延长了10 d左右，容器成本为原来的2286%；用烧开后经过沉淀的自来水代替高成本的蒸馏水，价格由原来的200元/t降低为3.1元/t，在忽略污染损失的情况下，水成本降低了98.45%；选择低成本的20 g/L白砂糖代替高成本的30 g/L蔗糖为碳源，污染率降低了47%，碳源成本为原来的13%；在丰花月季组织培养配制培养基的过程中，去掉加热熬制培养基的步骤，培养基对月季组培苗生长无影响。采用上述有效措施培养效果相似，成本可大幅度降低。
[HS2*2][HT8.5H]参考文献：
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微型月季发展时机何在 篇3
种苗上量, 成品分散
微型月季植株小巧可爱, 花朵玲珑艳丽, 种苗供应渐成规模, 河南南阳是我国主要的微型月季种苗供应区。南阳合众月季进出口公司总经理王新:今年公司销售的微型月季种苗比往年翻了一番, 直立型品种走货50万株左右, 藤本型走货超过100万株。在品种方面, 目前市场上流通的品种有20多个, 均从不同国家引进。其中, “紫色时代”、“小仙女”、“彩虹”等都是走量较大的品种。另外, 南阳还有多个月季种苗企业供应微型月季种苗。王新说:“目前微型月季种苗销量占月季总销量的十分之一, 市场整体需求增加是微型月季种苗销量走势见好的主要原因。”
与种苗相比, 成品微型月季生产较为分散。目前国内还很难找到一家专业化、规模化生产微型月季盆栽的企业。在很多供应微型月季成品花的企业中, 微型月季只是一个小配角, 用来搭配生产, 供应量较少。同时, 目前从事微型月季生产的企业队伍中, 绿化苗企业居多, 专业盆栽企业少。北京园艺场自称是全国最大的成品微型月季盆栽供应企业, 但目前该公司微型月季盆栽的年销量还不到1万盆。
抓住时机, 品质为先
虽然微型月季在国际市场上非常受宠, 但在中国, 市场开拓道路走得并不顺畅。早在五六年前, 国内就有企业专业从事微型月季的生产和供应, 但都先后退出了。目前, 在市场上很难寻觅到高品质的盆栽微型月季。随着国内家庭园艺的兴起和室内公共场所花卉装饰的流行, 微型月季又被不少业内人士“盯”上, 在实地了解丹麦、日本等高品质微型月季的生产和市场后, 他们再度看好中国市场的需求潜力, 但多个因素让企业踯躅不前。
消费习惯设障。南阳合众月季公司销售经理直言:“微型月季花朵小巧, 好看是好看, 但在市场上就是比不上大花吸引人。”消费习惯依然影响着大众的选择, 虽然“迷你风”渐起, 但不稳定的市场需求让生产企业感觉有风险。
生长习性受限。月季灿烂的花朵离不开充足的阳光, 微型月季也不例外。王新说:“微型月季盆栽摆放的场所有一定限制, 阳台、庭院、光线充足的酒店大厅、开阔的写字楼走廊等场所比较适合, 而在光线不好的室内, 微型月季的表现就会大打折扣。”目前, 藤本微型月季比直立微型月季走货情况要好, 原因在于藤本微型月季的应用空间更大更灵活, 由于微型月季的枝条较细, 用花架很容易造型, 做成各类花球或者花柱, 能起到很好的装饰作用, 但这类产品多用于工程, 居家或租摆使用还相对较少。
养护不占优势。在众多的月季产品中, 微型月季相对“娇气”。北京华源发苗木花卉交易市场主营丰花月季的商户李女士说:“在同样的市场环境下, 微型月季的养护相对费事, 抗性也不及丰花月季, 因此进货时都比较谨慎, 只做配花备一些。”
品质亟待提高。生产不被重视, 导致微型月季的品质也一直处于马马虎虎的状态, 最终只能以四五元一盆的低价出现在市场上, 即使配上精致的盆器, 其单盆价格也难以超出20元, 能销售到四五十元一盆的微型月季寥寥无几, 这让微型月季盆栽的产销进入了一个恶性循环。