人肾小球系膜细胞

人肾小球系膜细胞（精选六篇）

人肾小球系膜细胞 篇1

1 材料和方法

1.1 材料

脂多糖 (LPS, Sigma公司) ;RPMI一1640、Trizol RNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自Amresco公司。新生小牛血清 (FCS) 为杭州四季青生物工程材料研究所提供。

1.2 系膜细胞培养

以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基, 于37℃、饱和湿度下、5%CO2培养箱中培养, 细胞呈单层贴壁生长, 2~3d传代一次。取对数生长期细胞。

1.3 实验分组

(1) 对照组, 细胞不作任何处理; (2) LPS (10μg/mL) 处理12h组; (3) LPS (10μg/mL) 处理24h组; (4) LPS (10μg/mL) 处理48h组。

1.4 细胞增殖水平检测

取培养系膜细胞胰蛋白酶消化, 加RPMI-1640完全培养液于离心管中, 吹打混匀, 按每孔200μL, 密度103/mL接种于96孔板。待细胞贴壁24h后, 换5%血清培养液200μL, 同步24h。再按上述分组孵育, 刺激时间为12、24、48h。置37℃、5%CO2孵箱培养, 加人噻唑蓝 (MTT) , 于4h后分别加人二甲基亚矾 (DMSO) , 酶标仪620nm波长处记录吸光度值 (D值) 。

1.5 qRT-PCR法检测不同细胞处理组FoxM1B mRNA含量

不同处理组系膜细胞, 加入TRIzol试剂裂解提取总RNA。用逆转录试剂盒以Oligo (dT) 将总RNA逆转成cD-NA。反应条件:42℃20min、99℃5 min、4℃5 min。以cD-NA作为模板通过qRT—PCR法检测细胞中FoxM1B mR-NA的含量, 反应条件:95℃3min、95℃30S、65℃30S、72℃30S;扩增45个循环。以β-肌动蛋白作为内参, 用ΔΔCt法进行结果分析。FoxM1B及β-肌动蛋白荧光定量PCR引物由本室设计。并由上海生物工程有限公司合成。FoxM1B上游引物:5’ATGAAAACTACCCCCGTC3’, 下游引物:5’TGGGGTGGTTAATAACTTGG3’。β-肌动蛋白上游引物:5’CCAGC-CTTCCTTCTTGGGTAT3’, 下游引物:5’TTGGCAT-AGAGGTCTTACGG 3 7。

1.6 蛋白质印迹法 (western blotting) 检测

细胞处理后, 用0.5%胰蛋白酶消化, 4℃PBS漂洗3次, 加入600μL细胞裂解液 (2×106个细胞, 内含磷酸酶抑制剂) , 置冰上30min后, 4℃、15000×g离心30min, 上清液即为总的细胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍十二烷基硫酸钠上样缓冲液在十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳, 然后电转膜到醋酸纤维素膜上, 用5%脱脂奶粉封闭, 以兔抗人 (1:5000) 为一抗, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (1:500) 为二抗进行抗原抗体反应, 发光试剂盒显色。Alphalmager2200图像系统分析灰度值, 取β-肌动蛋白灰度值的比值进行统计学分析[2]。

1.7 统计学处理

用SPSS 13.0软件进行统计学处理, 数据±s用表示, 计量资料比较分析用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。相关分析运用Speaman秩相关。

2 结果

2.1 LPS诱导系膜细胞增殖的结果

用MTT方法检测。与对照组相比, 在12、24、48h, 10μg/mL的LPS能促进MCs增殖。结果见表1。

注:*与正常对照组比较, P<0.05。

2.2 两组细胞FoxM1BmRNA的水平

采用qRT-PCR法检测两组细胞FoxM1BmRNA的含量.以对照组mRNA水平为基础, LPS处理组mRNA水平用对照组的倍数来表示;结果显示:LPS处理细胞FoxM1B mRNA水平明显高于对照组 (P<0.001) 。结果见图1。

2.3 LPS对人系膜细胞FoxM1B蛋白表达的影响

FoxM1B和β-肌动蛋白灰度值的比值见表2、图2。

注:*与正常对照组比较, P<0.01。

3 讨论

肾小球内MC增生和细胞外基质增多是多种肾小球疾病、肾小球毁损、硬化过程中的主要表现[3]。MC属于血管周细胞, 是反应活跃的肾小球固有细胞, 在炎症过程中不但是被动受害者, 而且是直接参与者。我们发现:LPS能明显诱导系膜细胞的增殖, 这与以前的报道是一致, 目前认为:其作用机制与LPS调节多种炎症和细胞生长因子相关[4]。叉头框 (forkhead box, Fox) 蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子, 目前已发现17个亚族。Foxm1属Fox转录因子的一个亚型, 根据转录后不同的剪切形式又分为A、B、C三个亚型。其中FoxM1B与细胞增殖密切相关。FoxM1B可见于所有胚胎组织及正在扩增的细胞中, 终末分化细胞及静止期细胞中几乎没有表达, 但是当静止期细胞再次进入细胞周期时则又恢复高水平表达。成年组织中仅在胸腺及睾丸中高表达 (由于此两种器官中存在活跃的细胞增殖过程) , 在正常肝脏中的表达水平很低, 若部分切除肝脏后, 由于残留肝细胞重新进入分裂周期, 其表达水平又可见明显增加, 此外在许多肿瘤组织及肿瘤细胞系中均有表达。因此, 多数学者认为FoxM1B是与细胞增殖密切相关的特异性转录因子。FoxM1B的表达受c-Myc和核转录因子E2F的调控。细胞进入有丝分裂前c-Myc和E2F表达增高, 二者可以结合在FoxM1b启动子区, 上调FoxM1B的表达, 进而促进细胞有丝分裂。研究证实FoxM1B的表达水平及其活性在G1末期即明显升高, 且一直持续到有丝分裂完成。FoxM1B通过调控下游靶基因促进细胞分裂, 目前已发现的20多个FoxM1B靶基因几乎都与细胞周期及分裂增殖有关, 如FoxM1B可以促进cyclins和CDKs的表达。同时, cyclins及CDKs又可促进FoxM1B的磷酸化水平, 一方面增强其转录活性, 另一方面有助于其向核内转移[3]。我们研究发现:正常培养的系膜细胞仅能表达极微量FoxM1b, 这与其它的研究结果是一致的, 而LPS在诱导系膜细胞增生同时, 能明显诱导FoxM1b表达增加, 表明FoxM1B与LPS诱导的MCs增殖可能有关;但其详细的作用机制需要进一步的实验加以探讨。我们的研究结果将有助于进一步确认FoxM1B在MCs过度增殖从而引发肾小球硬化及肾单位损害中的作用, 为延缓乃至阻止肾单位的进行性破坏提供新的生物治疗靶点。

参考文献

人肾小球系膜细胞 篇2

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1细胞株:大鼠肾小球系膜细胞株 (Ratme-sangialcells, RMC) , 购自上海中科院细胞库。

1.1.2主要试剂:水溶性A771726 粉剂 (Sigma产品) 、低糖DMEM培养基 (Gibco产品) 、胰蛋白酶 (Amresco产品) 、CCK-8试剂盒 (Sigma产品) 、无支原体胎牛血清 (杭州四季青) 、碘化丙啶 (均为Sigma产品) 、PBS (上海生工生物) 。

1.2仪器与设备细胞培养箱 (美国Thermo公司) 、倒置相差显微镜 (Olympus公司) 、流式细胞仪 (德国Partec公司) 、酶标仪 (Bio-Rad公司) 。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养:大鼠肾小球系膜细胞培养方法参照赵丹等[5,6]的细胞培养方法。

1.3.2实验分组:收集对数期RMC, 计数后接种于培养板中, 待细胞完全贴壁, 弃完全培养基, 加入无血清DMEM培养液同步化24h, 按实验要求分为正常对照组、A771726 (25μg/ml) 组、A771726 (50μg/ml) 组、A771726 (75μg/ml) 组, 正常对照组加入同体积低糖DMEM培养液 (含5%FBS) 培养基。

1.3.3RMC增殖情况检测:RMC以2×104个/ml接种于96 孔板内, 200μl/孔, 按照实验分组干预48h, 严格按照CCK-8细胞增殖检测试剂盒操作, 用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度值 (A450) , 每个实验组设4 个复孔, 实验重复3 次, 并按以下公式计算抑制率 (Inhibitionrate, IR) = (A对照组值-A实验组值) / (A对照组值) 。

1.3.4RMC细胞周期分布检测:取对数期RMC, 以4×105个/ml接种于6孔板内, 2ml/孔, 按照实验分组干预48h, 收集细胞, PBS洗1遍, 用70%冰乙醇吹打混匀, 4℃ 冰箱固定过夜, 上机前, 再次离心, 收集细胞, 用500μlPBS重悬细胞, 加入RNA酶, 使其终质量浓度为0.25mg/ml, 于37℃ 反应30min后, 加入PI染液, 使其终质量浓度为50μg/ml, 室温、避光反应30min, 流式细胞仪检测细胞周期, 并按以下公式计算细胞增殖指数 (Proliferation index, PI) =S期和G2期细胞比例之和/G1期、S期和G2期细胞比例之和。

1.4统计学分析所得计量资料均以均数±标准差表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间多重比较采用LSD-t及SNK-q法, 采用SPSS19.0软件进行统计学处理, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CCK-8法检测各组RMC增殖情况与正常对照组比较, A771726 (25μg/ml) 组、A771726 (50μg/ml) 组、A771726 (75μg/ml) 组干预RMC48h后, 对其抑制率分别为18.85%、38.30%、66.07%, 差异有统计学意义 (均P<0.05) 。见表1。

注:▲与正常对照组比较, P<0.01;☆与A771726 (25μg/ml) 组比较, P<0.01;□与A771726 (50μg/ml) 组比较, P<0.01。

2.2流式细胞术检测各组RMC细胞周期分布

与正常对照组比, A771726 (25μg/ml) 、A771726 (50μg/ml) 、A771726 (75μg/ml) 组RMC, G1期细胞均显著增加, S期细胞均显著减少, 差异有统计学意义 (均P<0.05) 。见表2。

注:▲与正常对照组比较, P<0.01;☆与A771726 (25μg/ml) 组比较, P<0.01;□与A771726 (50μg/ml) 组比较, P<0.01。

3讨论

慢性肾脏病 (Chronickidneydisease, CKD) 在全球的发病率逐年升高, 进行性肾小球硬化及肾间质纤维化是其基本病因。随着病情进展, 最终发展为终末期肾脏病。2012年我国的一项CKD流行病学调查显示:我国成人CKD的患病率为10.8%[7]。流行病学调查显示:在中国, 终末期肾病的首要病因仍然是肾小球肾炎[8], 其中以系膜增生性肾小球肾炎的发病率最高[9]。正常生理状态下, MC的增殖与凋亡处于动态平衡, 当外界的炎症介质、细胞因子作用于MC后, 可引起MC的大量增殖, 导致增殖与凋亡的平衡被打破, MC大量增殖, 进而导致系膜增生性肾小球肾炎。因此, 寻找能够抑制MC增殖, 促进其凋亡的因子或药物对于临床上治疗进展性肾小球肾炎具有重要意义。

来氟米特是一种新型免疫抑制剂, 大量研究发现其具有抗炎、抗增殖的作用[10,11]。本课题组通过体外培养大鼠肾小球系膜细胞, 予不同浓度来氟米特干预相同时间, 采用CCK-8法检测各组RMC增殖情况, 结果显示:与正常对照组比较, 浓度为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml的来氟米特组干预RMC48h后, 均能够显著抑制RMC的增殖, 抑制率为18.85%、38.30%、66.07%, 差异有统计学意义 (均P<0.05) , 且随着来氟米特浓度的增加, 其对RMC的抑制作用亦随之增强。然本课题组通过倒置相差显微镜观察不同浓度干预RMC的形态, 结果显示:当来氟米特浓度为75μg/ml作用大鼠系膜细胞48h后, 倒置相差显微镜下观察MC形态, MC出现大量细胞漂浮, 且细胞形态发生严重变形。这说明来氟米特对RMC作用的最佳浓度应小于75μg/ml。

细胞分裂增殖, 其本质是通过细胞周期来实现的。本课题组流式细胞术检测MC细胞周期结果显示:正常对照组G1期细胞百分比为 (73.90±1.87) %, S期细胞百分比为 (19.30±0.98) %, G2期细胞百分比为 (6.80±2.74) %;而与正常对照组比较, 浓度为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml的来氟米特组干预大鼠肾小球系膜细胞48h后, G1期细胞均升高, S期细胞均降低, 这说明不同浓度的来氟米特均可抑制RMC的增殖, 各组MC均被阻滞于细胞周期的G1期, 进而抑制细胞的增殖, 这与CCK-8法检测RMC增殖的结果一致。

综上所述, 来氟米特 (A771726) 可显著抑制RMC细胞的增殖, 且随着浓度的升高, 其抑制作用越显著, 呈明显浓度依赖性。

摘要：目的:探讨来氟米特 (A771726) 对大鼠肾小球系膜细胞 (RMC) 增殖的影响。方法:体外培养RMC, 随机分为正常对照组、A771726 (25μg/ml) 组、A771726 (50μg/ml) 组、A771726 (75μg/ml) 组, 干预培养48h后, 采用CCK-8法检测各组RMC的增殖情况, 流式细胞术检测各组RMC细胞周期的情况。结果:与正常对照组相比, A771726 (25μg/ml) 组、A771726 (50μg/ml) 组、A771726 (75μg/ml) 组RMC的增殖均被显著抑制, G1期细胞均显著增加, S期细胞均显著减少, 细胞周期被阻滞于G1期 (均P<0.05) , 并呈明显浓度依赖性。结论:来氟米特 (A771726) 可显著抑制RMC细胞的增殖, 细胞周期被阻滞于G1期, 且随着浓度的升高, 其抑制作用越显著, 呈明显浓度依赖性。

人肾小球系膜细胞 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小球系膜细胞株(human mesangial cell,HMC),(编号4200)及MCM系膜细胞培养基均购买于美国Science Cell公司;胰酶为美国Sigma公司产品;胎牛血清为杭州四季清生物工程材料有限公司产品;RNA提取液Trizol为美国invitrogen公司产品;引物、GAPDH、marker及RT-PCR试剂盒均购买于大连宝生物工程有限公司;MCP-1酶联免疫(ELISA)试剂盒和FN酶联免疫(ELISA)试剂盒为购买于上海森雄科技实业有限公司;PTX为美国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HMC培养

HMC用MCM培养加入10%的胎牛血清,青霉素100 u/m L,链霉素100 mg/L,置于37℃5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养。每2天换液1次,3、4 d传代1次。

1.2.2 取对数生长期的HMC进行分组实验

(1)正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);(2)高糖组(30 mmol/L葡萄糖);(3)甘露醇组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);(4)PTX甲组(30 mmol/L葡萄糖+0.03mg/m L PTX)(5)PTX乙组(30 mmol/L葡萄糖+0.1mg/m L PTX)(6)PTX丙组(30 mmol/L葡萄糖+0.3mg/m L PTX)每种培养条件均于24、48和72 h取细胞上清液及收集细胞备用。HMC以每孔2×105个细胞数接种到6孔培养板,每组设3个复孔(n=3)。

1.2.3 细胞总R NA的提取和检测

按1.2.2的实验分组及Trizol试剂产品说明提取24、48和72 h的细胞总RNA。提取的RNA用紫外分光光度仪测定其纯度和含量。

1.2.4 逆转录-

多聚酶链反应(R T-PCR)法检测MCP-1mR NA的表达引物碱基序列参考文献报道[11],MCP-1引物上游:5'-TCGCTCAGCCAGATGCA ATCAATGC-3',下游5'-CCCAGGGGTAGAACTGTG GTTCAA-3',扩增片段长度479 bp;GAPDH引物上游5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3',下游5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAG-3',扩增片段长度983bp。用AMV逆转录酶逆转录成c D-NA,反应条件:42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min;合成的c DNA用GAPDH引物扩增作为内参照进行MCP-1的扩增,反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性0.5 min,62.2℃退火0.5 min,72℃延长2 min,共进行32个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳,置于凝胶图像分析系统(UVP公司,美国)进行吸光度扫描,以管家基因GAPDH作为内参照校正,用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.2.5 细胞上清的检测

MCP-1和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)采用ELISA试剂盒,严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

统计分析采用SPSS13.0软件。计量资料用均数±标准差表示。多组间比较采用方差分析,任意两组间比较采用SNK-q法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMC的MCP-1mRNA的表达

MCP-1mRNA在正常对照组有少量表达,在高糖组明显上调,高糖组与正常对照组在同一时间点差异有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,PTX各组HMC的MCP-1mRNA表达有明显下调,且有统计学意义(P<0.01);其中以48 h最为明显。培养的HMC加入0.03、0.1、0.3 mg/m L PTX的刺激48 h后,MCP-1mRNA表达的吸光度值分别为(0.754±0.024)、(0.567±0.027)和(0.460±0.037),表明随着己酮可可碱浓度的增加,其抑制MCP-1mRNA表达的也逐渐加强,且有统计学意义(P<0.05)。72 h PTX各组MCP-1mRNA表达的吸光度值分别为(0.642±0.004)、(0.498±0.049)和(0.399±0.037),与48 h相比,MCP-1mRNA表达略有下降。见图1～3和表1。

M:marker;1:正常对照组;2:高糖组;3:甘露醇组;4:PTX甲组;5:PTX乙组;6:PTX丙组

M:marker;1:正常对照组;2:高糖组;3:甘露醇组;4:PTX甲组;5:PTX乙组;6:PTX丙组

M:marker;1:正常对照组;2:高糖组;3:甘露醇组;4:PTX甲组;5:PTX乙组;6:PTX丙组

2.2 MCP-1蛋白、FN的表达情况

在高糖刺激24、48和72 h的HMC上清液中,MCP-1,FN分泌增加,与正常对照组比差异有统计学意义(P<0.01)。尤其是在48 h时间点上作用最明显,而在72h时呈下降趋势。甘露醇组与正常对照组相比无明显抑制作用(P>0.05)。与高糖组相比较,PTX各组MCP-1,FN的分泌明显减少,且有统计学意义(P<0.05),并且随着PTX的增加其抑制作用增强(P<0.05)。提示PTX在0.03～0.30 mg/m L范围内,抑制作用呈剂量依赖关系,其中48 h作用最明显。见表2、3。

注:1)与正常对照组相比,P<0.01,2)与高糖组相比,P<0.01,PTX各组比较,P<0.05

注:1)与正常组相比,P<0.01;2)与高糖组相比,P<0.05,PTX各组之间两两比较,P<0.05

注:1)与正常对照组相比,P<0.01;2)与高糖组相比,P<0.05,PTX各组两两之间比较,P<0.05。

3 讨论

MCP-1是一种重要的炎症趋化刺激因子,调控单核细胞的聚集,在许多肾脏疾病包括糖尿病肾病被上调。高糖通过PKC(蛋白激酶C)和ROS(活性氧簇)的产生迅速激活NF-κB,从而使得MCP-1被上调。在实验性肾小球肾炎MCP-1通过TGF-β被上调,使得胶原沉积增多,从而促进肾小管间质的损害[11]。PARK[12]等人已经证实在肾小球内皮细胞NF-κB和AP-1通过调控TNF-α来诱导MCP-1的表达。MCP-1通过多种途径参与DN的发病。MCP-1使血循环的单核细胞在肾炎症处聚集和活化,加快肾小球损伤,对DN的进展起了重要作用。MCP-1可以促进系膜细胞分泌FN,MCP-1诱导FN的产生是通过NF-κB以及TGF-β的依赖机制[13]。GIUNTI等[14]人报道了在人肾小球系膜细胞中,MCP-1结合CCR2诱导ICAM-1的产生,提高单核细胞的黏附,而且作用单核细胞后,能引起呼吸爆发,快速诱导花生四烯酸的释放以及钙离子浓度改变,从而加重炎症反应。在单侧输尿管阻塞的大鼠模型中,敲除MCP-1的受体CCR2或给予CCR2受体拮抗剂,可以减少大鼠肾脏单核细胞的浸润和肾脏的纤维化[15]。TAM[16]等人发现在有微量蛋白尿的DN病人中,尿中MCP-1的水平升高,并且与肾功能降低有关,而与尿蛋白/肌酐比率关联不大。

DN是糖尿病的慢性微血管并发症之一,主要的病理改变是肾小球肥大、细胞外基质积聚以及肾小球硬化。DN的发病是多种因素综合作用的结果,如高血糖、脂代谢紊乱、氧化应激反应增加、全身血压升高和肾小球高灌注以及细胞因子的参与等。虽然高血糖与DN的发生发展有密切关系,但机制尚不十分清楚。因此,研究高糖状态下HMC生物学功能的改变对于探讨DN的发病机制和防治具有重要意义。本实验通过体外培养HMC,观察PTX对高糖条件下HMC MCP-1表达的影响,同时进一步揭示PTX在防治DN中可能的作用机制。

从实验结果可以看出,正常情况下HMC可以表达一定水平的MCP-1,而在高糖的刺激下,MCP-1m RNA和蛋白表达明显增多,以48 h最为明显,72 h则呈下降趋势,可能是由于HMC长期暴露于高糖环境中,高糖对HMC产生代谢毒性作用,进而诱导部分HMC凋亡,从而使得MCP-1mRNA的表达减少。而甘露醇组和正常对照组相比,对MCP-1表达的影响没有明显的差异,提示高糖对HMC的影响与渗透压的改变无关。

PTX干预组显示PTX可以明显抑制高糖所致的MCP-1 m RNA和蛋白表达增加。当PTX浓度在0.03～0.30 mg/m L范围内,随着PTX浓度的增加,其抑制作用增强,具有剂量依赖性,这与CHEN[10]等人研究的PTX以剂量依赖的方式抑制PDGF刺激的HMC增殖和胶原分泌结果相同;在同一时间段(24和48 h),随着PTX浓度的增高,其抑制作用也增强,具有时间依赖性。至于PTX对DN的保护的确切机制,目前现有的资料尚未完全阐明。临床实验已证实在DN及膜性肾病,PTX能降低内源性的TNF-α及降低蛋白尿[17]。在体外,有报道称PTX能下调MCP-1在外周血单核细胞及近端肾小管的表达[18,19]。在HMC,PTX通过抑制磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)组成性活化,引起丝苏氨酸激酶的磷酸化,从而抑制HMC的增殖。本实验结果表明PTX可能通过抑制HMC MCP-1的表达而减少FN的分泌,可能对DN有防治作用。在实验性肾小球肾炎的大鼠模型同样证实了PTX可以减少肾脏MCP-1的分泌,减轻肾小球系膜基质增多和基底膜增厚[20]。近年来发现PTX还可减少DN患者的尿白蛋白排泄率,抑制多种炎症因子,减轻肾脏损害,延缓DN的发展[21]。PTX已被证明可减少糖尿病(DM)和非糖尿病病人的蛋白尿,2型DM患者尿中MCP-1水平增加与尿蛋白程度成一定比例,与N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)呈正相关,PTX可能通过抑制NAG的产生来下调尿中的MCP-1[22,23]。

4 结论

PTX能抑制高糖诱导的HMC MCP-1的表达,减少HMC分泌FN,提示PTX可能通过阻止MCP-1的表达,减少细胞外基质(ECM)积聚,延缓DN中肾小球肥大和肾小球硬化的进展,从一个新角度证明了PTX对DN肾脏的保护作用。

摘要：目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表达的影响及己酮可可碱(pentoxifylline,PTX)对其干预作用。方法 将培养的人肾小球系膜细胞分为6组:正常对照组、高糖组、甘露醇组、PTX甲组、PTX乙组、PTX丙组,分别在24、48和72 h采用RT-PCR法和ELISA法检测PTX对高糖条件下系膜细胞内MCP-1mRNA及蛋白、细胞外基质纤维连接蛋白(fi-bronectin,FN)表达的影响。结果 高糖组人肾小球系膜细胞MCP-1mRNA及蛋白、FN的表达较正常对照组明显增加(P<0.01);己酮可可碱各组比高糖组有明显下降(P<0.01);不同浓度的己酮可可碱对高糖诱导的系膜细胞MCP-1的表达抑制程度不同(P<0.05)。结论 己酮可可碱可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞MCP-1的表达以及FN的分泌,呈时间、剂量依赖关系,己酮可可碱可能对糖尿病肾病的防治起到有益的作用。

人肾小球系膜细胞 篇4

关键词：肾小球系膜细胞,丹参注射液,血管紧张素Ⅱ,Janus激酶,信号转导子与转录激活子

在慢性肾脏病的中医治疗中,活血化瘀法的应用有着重要的临床意义。而具有活血化瘀功效的丹参常常被用于慢性肾脏疾病治疗,临床研究证实,丹参及其活性成分能延缓慢性肾脏病进展[1,2,3]。动物实验也证实丹参注射液可降低阿霉素大鼠肾脏皮质Ⅳ型胶原和层黏连蛋白的含量,减轻阿霉素所致肾小球硬化程度[4]。

血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是公认的致肾小球硬化因子。有研究表明丹参能抑制AngⅡ导致的血压升高[5]。笔者的既往研究发现,丹参能够下调AngⅡ诱导的系膜细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen Activator Inhibitor 1,PAI-1)表达的增加,以及抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌增加与细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平的增高,从而发挥抗肾小球硬化作用[6,7]。笔者从Janus激酶/信号转导子与转录激活子(Janus kinase/signal ransducers and activators of transcription,JAK/STAT)信号通路的角度对丹参注射液抑制血管紧张素Ⅱ的作用发挥抗肾小球硬化的机制进一步进行深入研究,现报告如下。

1 材料

1.1 细胞来源

大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY21):购于中国典型培养物保藏中心。

1.2 药物

丹参注射液:正大青春宝药业有限公司产品,批号:0508242;氯沙坦:美国Sigma公司。

1.3 主要试剂和仪器

AngⅡ:美国Sigma公司;MEM培养基:美国Gibco;FN ELISA试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒:碧云天生物技术研究所;0.45μm PVDF膜:德国Millipore;山羊抗大鼠Rac-1抗体:美国Epitomics;山羊抗大鼠P-STAT1抗体:美国bioworld公司;山羊抗大鼠P-STAT3抗体:美国EPI公司;山羊抗大鼠P-JAK2抗体:美国ABCAM公司;山羊抗大鼠Actin抗体:美国Santa Cruz公司;HRP标记的兔抗羊Ig G二抗:美国KPL;超敏ECL化学发光试剂盒Beyo ECL Plus:碧云天生物技术研究所。Western blot实验设备:北京市六一仪器厂,Vasamax酶标仪:美国MD公司。

2 方法

2.1 细胞培养

将HBZY21细胞接种于培养瓶,生长于含10%胎牛血清、100 U·m L-1青霉素、100μg·m L-1链霉素的MEM培养基中,在5%CO2、37℃培养箱内孵育,待细胞生长至80%融合状态时,更换为无血清MEM培养基使细胞同步化24小时,使细胞处于相对静止期后分组。

2.2 AngⅡ诱导剂量的选择

系膜细胞+AngⅡ(浓度分别为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mmol/L)共同孵育24小时。

2.3 分组处理

先用1μmol/L氯沙坦及丹参注射液与系膜细胞孵育30分钟,然后再加入浓度为10-6mmol/L的AngⅡ刺激系膜细胞,共同孵育24小时。具体分组为:A:系膜细胞;B:系膜细胞+AngⅡ(浓度为10-6mmol/L);C:系膜细胞+AngⅡ(浓度为10-6mmol/L)+氯沙坦(1 mol/L);D:系膜细胞+氯沙坦(1/μmol/L);E:系膜细胞+丹参注射液(终浓度为150 g/L);F:系膜细胞+AngⅡ(浓度为10-6mmol/L)+丹参注射液(终浓度为37.5 g/L);G:系膜细胞+AngⅡ(浓度为10-6mmol/L)+丹参注射液(终浓度为75 g/L);H:系膜细胞+AngⅡ(浓度为10-6mmol/L)+丹参注射液(终浓度为150 g/L)

2.4 观察指标测定

2.4.1 系膜细胞P-STAT1、P-STAT3、P-JAK1、RAC-1表达的测定

Western blot。用TBS冲洗贴壁细胞2~3次,最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂(NP-401%、Tris HCl(p H 8.0)50 mmol/L、Na Cl 150mmol/L、PMSF 0.1 mmol/L、Pepstatin 1μmol/L、Leupeptin 0.5g/L、Aprotinin 0.3μmol/L,使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)处理3~5分钟。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5 m L离心管中。冰浴30分钟,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。12 000 g离心5分钟,收集上清,即为总蛋白溶液。蛋白含量按BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。取总蛋白40μg经SDS-PAGE凝胶电泳后,转移至0.45μm PVDF膜上。然后用含5%脱脂牛奶的TBST 4℃封闭2小时,洗膜后加入羊抗大鼠抗体(均为1:1000)孵育过夜。再用1:3000的HRP标记的兔抗羊Ig G进行二抗杂交,最后加入ECL试剂显色并曝光成像。将胶片进行扫描存档,Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

2.4.2 系膜细胞上清液FN检测

ELISA。收集细胞上清,根据试剂盒说明书对对照品和样品进行检测。酶标仪450nm处,以空白对照孔调零,测取A值;以A450值对FN对照品在Excel上作标准曲线,根据标本的A值求出FN含量。

2.5统计方法

数据以(±s)表示,应用SPSS 17.0软件包进行统计分析,采用One-Way ANOVA检验。

3 结果

3.1 不同浓度AngⅡ(0,10-9~10-5mmol/L)对系膜细胞JAK/STAT信号通路中P-STAT1、P-STAT3、P-JAK1、Rac-1分子表达及FN分泌的影响

见表1~2。

表1 不同浓度AngⅡ对系膜细胞JAK/STAT信号通路的影响(±s)

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

表2 不同浓度AngⅡ对系膜细胞分泌FN的影响(±s)

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

如表1~2所示,随着AngⅡ刺激系膜细胞浓度的升高,Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3、FN表达升高,在10-5mmol/L时达到最高,在10-6mmol/L浓度作用相对稳定。

3.2 不同浓度丹参注射液对AngⅡ(10-6mmol/L)刺激系膜细胞后JAK/STAT信号通路的影响

见表3。

表3 各组系膜细胞JAK/STAT信号通路相关指标的变化(±s)

与A组比较*P<0.05;**P<0.01;与B组比较△P<0.05,△△P<0.01

如表3所示,氯沙坦先与系膜细胞共同孵育30分钟后,再加AngⅡ,结果氯沙坦能完全抑制AngⅡ刺激系膜细胞后Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3的升高,而单独氯沙坦对系膜细胞Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3表达没有影响。采用37.5 g/L丹参注射液孵育后Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3表达分别为空白对照组(A组)的4.6、2.6、2.1、5.1倍,并随着丹参注射液的浓度增加,表达下降,150 g/L丹参注射液孵育后能降低Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3的表达到正常水平(H组与A组比较P>0.05);而150 g/L丹参注射液对基础状态下Rac-1、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3的表达没有影响(E组与A组比较,均P>0.05)。

3.3 不同浓度丹参注射液对AngⅡ(10-6mmol/L)刺激系膜细胞分泌FN的影响

见表4。

表4 各组系膜细胞分泌FN表达的测定(±s)

与A组比较*P<0.05,**P<0.01;与B组比较△P<0.05,△△P<0.01

4 讨论

肾脏纤维化是各种原因肾脏疾病进展到慢性肾衰竭的共同途径和主要病理基础,是各种肾小球病变发展至终末期的一种不可逆的病理改变,包括肾小球硬化、肾小管萎缩和毁损、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)异常增多和过度沉积等病理过程,其发病机制尚未完全明晰,治疗难度大,预后较差。系膜基质增生是导致肾小球硬化的重要因素,采取有效的治疗方法抑制由系膜细胞产生的ECM增多将会在很大程度上延缓肾小球硬化的进展,因此探讨肾小球硬化机制及防治措施在临床上有很重要的意义。

近年有研究提示,JAK/STAT通路与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质分泌有关。而JAK/STATs能被G蛋白偶联受体活化,比如AngⅡ受体,这个过程需要膜转位和小GTP酶的活化,如Rac-1。JAK有4个家族成员,分别是JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。信号转导和转录激活子(signal transducers and activator of transcriptions,STATs)是一类能与靶基因调控区DNA结合的胞质蛋白,是JAKs的下游底物。STAT磷酸化活化后直接转入细胞核内,引发相应靶基因的转录。STAT有7种,分别是STAT1~STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6[8]。阻断JAK/STAT途径能抑制肾纤维化,保护肾功能[8]。

AngⅡ是致肾小球硬化的重要因子[9]。JAK/STAT途径在AngⅡ导致肾脏病损伤及进展中起到了很重要作用[8,9,10]。AngⅡ与AT1受体结合后,通过磷酸化JAK而活化STAT[11,12,13]。研究证实,磷酸化的JAK2、STAT1、STAT3也可以通过增加TGF-β1产生,TGF-β1是细胞外基质合成的关键因子,能刺激系膜细胞分泌细胞外基质成分纤维连接蛋白(fibronectin,FN),导致肾纤维化[10,14,15]。在本实验中,AngⅡ刺激系膜细胞Rac-1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3表达增加,与AngⅡ刺激剂量明显相关;与此同时,细胞外基质成分FN表达明显增加。采用AngⅡ受体阻断剂(angiotensinⅡtype 1 receptor antagonists,ARB)能抑制AngⅡ导致的JAK/STAT途径激活[16]。在本实验中,氯沙坦具有明显作用。

多种慢性肾脏疾病患者在病变过程中均可出现血瘀表现,如血尿、固定腰痛或痛如针刺、面色晦暗、舌质紫暗、肌肤甲错或有瘀点、瘀斑等。同时,从肾脏病理变化来看,肾小球发生硬化时,超微结构常表现出细胞外基质增多,基底膜增厚,球囊黏连,肾小球内微血栓,毛细血管管腔塌陷或狭窄,血管袢挤压、闭塞以及小管间质纤维化和萎缩等形态学改变;这些病理特征也和中医对血瘀证的认识有极其相似之处。因此中医在慢性肾脏病的治疗中,活血化瘀法的应用有着重要的临床意义。而具有活血化瘀功效的丹参常常被用于慢性肾脏疾病治疗[1,2,3]。

近年来,丹参拮抗AngⅡ而发挥抗纤维化的作用受到关注。中药丹参(Salvia Miltiorrhiza Bunge)防治肝脏纤维化效果确切[17],此作用与降低肝纤维化大鼠血浆AngⅡ水平,抑制肝组织AT1R的基因表达有关[18]。同样比较多的研究证实,丹参及其活性成分能有效抑制心肌肥大,该作用同样通过抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞合成I型、Ⅲ型胶原[19]。丹参亦对肾纤维化有一定影响,笔者以及他人研究均证实丹参及其活性成分能通过抑制血管紧张素Ⅱ的作用而发挥抗肾纤维化作用[6,7,20,21,22]。

本实验结果显示,丹参能够明显抑制AngⅡ刺激系膜细胞后Rac-1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3表达的增加,降低FN表达,与ARB(氯沙坦)作用相似。丹参抑制AngⅡ致纤维化的作用可能机制有:1)抑制血管紧张素转换酶的活性,类似ACEI样作用,能减少AngⅡ含量[20,23],其活性成分存在水溶性部分中,主要为含丹酚酸B等酚酸类物质[20]。2)抑制AngⅡ的受体AT1R表达[18]。3)阻断AngⅡ与AT1R结合,类似ARB药物作用[21]。4)促进ACEI的合成,抑制了AngⅡ的活性[22]。

人肾小球系膜细胞 篇5

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司),胰蛋白酶、胎牛血清(天津TBD灏洋生物技术有限公司),DMEM培养液(美国Hyclone公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。PVDF膜(Millipore,美国),辣根酶标记二抗(北京中杉金桥),ECL(Santa Cruz,美国),实验中所用化学试剂(如无特别说明)均为分析纯试剂及以上。TU-1201 紫外分光光度计(北京通用仪器设备公司),生物洁净工作台(北京半导体设备一厂),Thermo Multi-skan ascent酶标仪(美国Thermo Electron公司),Power-Pac Basic Power Supply 、Mini-PROTEAN 3 Ele-creophoresis Cell、Mini Trans-Blot Module(美国Bio-Rad公司)、Alpha View系统软件(美国Alpha Innotech公司)、Fluor Chem FC2 Imaging System (美国Alpha In-notech公司),Thermo Forma CO2孵箱(美国Thermo Electron公司),INVERTER MRX-151 高速低温离心机(离心半径=8 cm)(日本TOMY公司)。

1.2 n Cd S悬浊液制备n Cd S由南开大学环境科学与工程学院制备。首先,将无水乙醇n Cds原样自然风干后称取0.1 g,进行20 min 121 ℃高压灭菌,而后将其配制成浓度为1 mg/ml的混悬液(用含10%胎牛血清的DMEM培养基)。混悬液经48 h超声波振荡溶解制备成分散均匀的母液,4 ℃下储存备用。

1.3 细胞传代及培养HKC(河北医科大学基础医学院捐赠) 使用含有1.0%双抗(100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行常规培养。培养后细胞使用0.25%胰蛋白酶消化后传代。

1.4 MTT试验用0.25%的胰蛋白酶消化将对数生长期的HKC制成单细胞悬液,使用缓冲液调整其浓度为105细胞/ml,定容每孔400 μl,加入32 孔培养板中,再常规培养24 h(37 ℃、5% CO2及饱和湿度)。24 h后吸出原培养液加入含不同浓度(0、10、20、30、40、60 和80μg/ml,每组设4 个平行孔,不同染毒剂量组别由预试验判定)n Cd S的新培养液,在相同条件下培养24 h。于试验结束前4 h,各加入5 mg/ml MTT溶液摇匀后继续培养4 h后,倾去培养液,各孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO),用酶标仪测定吸光度(A)值。酶标仪上测定各孔A值,并计算细胞存活率(细胞存活率(%)= 实验组A值/ 对照组A值×100%)。

IC50值定义为细胞生长被抑制50%时的n Cd S浓度(剂量效应曲线取值),采用SPSS 18.0 for Windows统计软件进行计算IC50值。

1.5 抗氧化指标检测将对数生长期HKC按照预实验分组随机分成对照组(生理盐水)与不同n Cds染毒剂量组(10.00、20.00、30.00、40.00 μg/ml),并且每组设3 个平行样。经相应处理培养24 h后,进行MDA、GSH、GSH-PX、SOD指标检测。

1.5.1 MDA检测每个样品收集107个细胞,收集上清液,分别按照MDA测试试剂盒的方法检测细胞裂解上清液中MDA含量。

1.5.2 GSH检测收集细胞,转移至离心管中,以2 000 r/min转速离心5 min,之后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。每个样品分别按照试剂盒检测方法检测细胞裂解上清液中GSH含量。

1.5.3 GSH-Px检测酶促反应:(试剂- 应用液提前在37 ℃预温),37 ℃水浴准确反应5 min; 显色反应:GSH应用液、GSH标准液及样品上清液混匀,3 500~4 000 r/min,离心10 min,取上清1 ml作显色反应。混匀,室温静置15 min后,于412 nm处,用1 cm光径比色杯,双蒸水调零,测各管A值。

1.5.4 SOD检测本研究应用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力。经处理后细胞,用旋涡混匀器充分混匀,置37 ℃恒温水浴40 min,混匀,室温放置10 min,于波长550 nm处,用1 cm光径比色杯,比色。而后按照总SOD测试试剂盒方法分别检测每个样品细胞裂解上清液中SOD活力。

1.6 HKC中NF-κB蛋白表达水平检测选取对数生长期HKC细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,将HKC细胞悬液接种于50 ml培养瓶中,常规条件培养24 h(37 ℃、5% CO2及饱和湿度)。按照0、10、20、40、60 μg/ml不同染毒剂量分组,每个浓度设置3个平行样品。培养24 h后,收集细胞,按照蛋白提取液试剂盒操作步骤提取蛋白,调整蛋白含量。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转膜封闭液于37 ℃摇动封闭1 h,加入山羊多抗NF-κB抗体后4 ℃孵育24 h。HRP标记的二抗于37 ℃杂交1 h,洗涤后加ECL,经过显影、定影,数字成像分析蛋白的A值。

1.7 统计学分析实验数据采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析,数据均以±s进行表示,以P <0.05 为差异有统计学意义,多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA),组间两两比较时,若方差齐时,采用SNK检验(Student-Newman-Keuls法);若方差不齐时,采用Games-Howell检验,率间的比较采用 χ2检验。

2 结果

2.1 n Cds对HKC细胞生长的影响实验结果显示,HKC细胞的存活率随着n Cd S浓度的增加而下降,n Cd S各剂量组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2 n Cd S对HKC中细胞氧化应激的影响不同染毒剂量细胞内的SOD、GSH-Px活力和GSH含量,随着n Cd S浓度的增加而下降,检测结果40 μg/ml剂量组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);细胞内的MDA含量随着n CDS浓度的增加而增加,与对照组相比,20、30 和40 μg/ml n CDS组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:HKC—人肾小管上皮细胞;各剂量组与对照组比较,均P<0.05。

注:a与对照组比较,P<0.05。HKC—人肾小管上皮细胞;SOD—超氧化物歧化酶;GSH-Px—谷胱甘肽过氧化物酶;GSH—谷胱甘肽;MDA—丙二醛。

2.3 n Cd S对HKC细胞中NF-κB蛋白表达水平的影响随染毒剂量增加,NF-κB蛋白表达水平逐渐升高,除了10 μg/ml剂量组,其他各个处理组均明显高于对照组(P<0.05)。见图1。

3 讨论

目前对纳米材料的研究应用推动了纳米科学和技术的快速发展。纳米技术在医药、生物等各个领域的应用广泛,对其生物安全性进行评价至关重要[1,2,3]。但对于材料本身的毒性及安全性研究才刚刚开始。到目前为止,国内外学者对纳米材料的细胞毒性进行了诸多研究,发现了碳纳米管[4,5]、Ti O2、Cd Te等多种纳米材料均具有一定程度的细胞毒性,并且主要通过肝肾等靶器官进行代谢[6,7]。本研究中n Cd S属于低毒类化学品,常规材料毒性主要表现为慢性毒性损伤并特异性蓄积于肝肾中[8]。目前,采用动物细胞进行体外模型研究［4-5，9］表明,其细胞损伤首先表现为以肾小管重吸收功能障碍为特征的肾功能异常,损伤严重后可累及肾小球[9,10]。本次通过研究HKC氧化应激指标,进一步探讨n Cd S对HKC的氧化损伤影响及其机制。

目前,关于纳米材料的氧化损伤作用,国内外主要通过纳米物质的氧化应激和炎症反应等,探讨其生物学效应机制[11]。研究结果显示,纳米材料产生的氧化应激和炎症反应机制是其刺激生物体产生的活性氧超出自身抗氧化能力,导致了生物体氧化和抗氧化系统失衡,引发链式反应最终导致细胞凋亡[12,13]。另外,细胞抗氧化防御系统中拮抗自由基的重要酶类如SOD、CAT、GSH-Px等受到影响,也可导致氧化应激反应发生[5，14]。本研究中显示不同染毒剂量细胞内的SOD、GSH-Px活力和GSH含量,随着纳米硫化镉浓度的增加而下降;细胞内的MDA含量随着n Cd S浓度的增加而增加。抗氧化酶含量减少的原因有以下3 个方面:1增生活跃的滤泡上皮细胞消耗了大量的抗氧化酶;2ROS等自由基对细胞的损伤,特别是对粗面内质网的损伤而影响了抗氧化酶的合成[10];3过量的自由基对抗氧化酶蛋白的直接损伤所致[15]。由于自由基反应的最大特点是连续性,在从氧自由基到脂自由基的连续反应过程中,过多的自由基首先作用于生物膜类脂化合物上的多聚不饱和脂肪酸,经过一系列中间产物而生成脂质过氧化物(LPO),LPO可以再被氧化为最稳定的形式—MDA。LPO造成膜结构和膜功能的改变,而MDA具有很强的化学反应性,能与膜蛋白和酶交联而使他们变性,进而影响整个细胞的结构和功能。

NF-κB诱导产生的细胞因子中与慢性炎症反应相关的包括促炎因子、趋化因子、粘附因子以及产生次级炎症介质的酶,发生连锁反应从而扩大最初的炎症反应[13,14]。研究表明,NF-κB受到外界刺激后不需要蛋白控制立即发生反应,其作用机制为活化后的NF-κB二聚体进入胞核内与靶基因启动子或增强子上的特异序列结合,最终调控很多生物过程包括先天和适应性的免疫应答、氧化应激反应、衰老和癌症[15]。本研究中经n Cd S染毒后HKC细胞与对照组相比,随着染毒剂量的增加,HKC细胞中NF-κB蛋白水平逐渐升高,呈现出剂量- 反应关系。HKC细胞可能是在ROS、NO等一系列氧化因子的刺激后导致NF-κB活性增强,从而诱导细胞的氧化损伤。

本次是关于n Cd S生物体毒性的初步研究,若要全面了解n Cd S的毒性作用机制尚需要进行更深入的研究。另外,鉴于体外实验的局限性,本研究结果有待于在体内实验中进一步证实。

人肾小球系膜细胞 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2007年3月至2009年2月本科收治的肾脏病患儿, 经肾活检确诊为系膜增生性肾小球肾炎19例, 其中男11例, 女8例;年龄3.2～12.7岁, 平均 (9.5±4.1) 岁;从发病到肾活检的病程17 d～4年, 19例患者病理分型按WHO分类标准, 15例表现为肾病综合征, 其中肾炎型11例 (BUN、Cr升高3例, 轻度高血压2例) , 单纯型4例;单纯性血尿2例;单纯性蛋白尿1例;血尿伴轻度蛋白尿1例。

1.2 方法

所有病例均行尿常规、24 h尿蛋白定量、ASO、补体、乙肝表现抗原、肝功能、总蛋白、白蛋白、胆固醇、BUN、Cr、内生肌酐清除率检查及肾活检 (标本中含肾小球3-34个, 分别送光镜免疫荧光及电镜检) 。表现为肾病综合征者采用激素或激素加细胞毒性药物治疗;其余用维生素及中药治疗。

1.3 疗效判断标准

①完全缓解:临床症状消失, 血浆总蛋白及白蛋白恢复正常, 尿蛋白定性阴性;②部分缓解:血浆总蛋白及白蛋白正常或接近正常, 尿蛋白定性+-++, 24 h尿蛋白定量较首次治疗下降5%以上;③未缓解:临床症状好转或消失, 24 h尿蛋白定量较前变化不大, 定性+++或以上。

2 结果

2.1 临床疗效

本组中15例呈肾病综合征表现者, 经使用激素或激素加细胞毒性药物治疗, 完全缓解9例 (占60%) , 其中病理改变为轻度8例、中度1例;5例部分缓解, 其中病理改变为轻度1例、中度2例、重度2例;1例未缓解, 病理检查示重度系膜增殖及硬化, 伴肾小管萎缩、间质纤维化及炎性细胞浸润。其余患儿经用维生素、潘生丁及中药治疗, 病情均好转。

2.2 临床表现与病理改变的关系

在19例系膜增生性肾小球肾炎中, 原发性肾小球疾病15例, 继发性肾小球疾病4例, 临床诊断不同的肾小球系膜病变程度各有不同, 原发性肾小球疾病中以轻度系膜增生性肾小球肾炎多见, 而继发性肾病中则以中、重度多见, 两组比较有统计学意义。肾炎性肾病患儿病理损害较单纯性肾病重, 伴有肾功能受损 (BUN、Cr升高) 与高血压者均为重度系膜增殖, 且伴肾小管萎缩、间质纤维化及炎性细胞浸润。

3 讨论

系膜增生性肾小球肾炎是一组病理上以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。其病理特征为光镜下弥漫性肾小球系膜增生伴基质增多为其特征性改变, 早期以系膜细胞增生为主, 后期系膜基质增多, 全部肾小球的所有小叶受累程度一致, 肾小球毛细血管壁及基底膜正常, 当系膜重度增生时, 有时可见节段性系膜长入基底膜与内皮间的插入现象, 有时可伴有肾小球节段性硬化及球囊粘连[1]。电镜观察可见系膜及基质增生, 重症病例可见系膜细胞及基质增生, 重症病例尚可见节段性系膜插入, 肾小球基底膜基本正常, 约1/4～1/2病例可在系膜区见到少量稀疏的细颗粒状和云雾状的电子致密物。临床表现为持续性镜下血尿, 经常反复发作肉眼血尿, 病程可迁延多年。临床特点:①占肾活检病例的50%, 在原发性肾病综合征中占30%;②男性多于女性, 好发于青少年;③50%有前驱感染史;④70%患者伴有血尿;⑤病情由轻转重, 肾功能不全及高血压的发生率逐渐增加。病理特点:①系膜区细胞增多;②基质增宽;③有C1q沉着;④内皮细胞无增生;⑤基膜无改变;⑥上皮细胞无改变[2], 决定本病预后的主要因素是肾小球病理改变的程度, 病理改变轻者预后较好, 反之较差。

肾小球系膜增生性改变为肾小球肾炎进行性炎症过程, 但有学者认为系膜细胞对损伤的肾小球结构具有一定的修复功能。虽然系膜细胞增生到一定程度能导致肾小球硬化, 但并非不可逆性[3], 给予适当的治疗有可能阻断病变的进展, 使增生的系膜细胞得到恢复。由于系膜增生性肾小球肾炎在临床表现和病理改变上与微小病变性肾病有许多相似之处, 因而临床主张对表现为肾病综合征的系膜增生性肾小球肾炎使用激素加药物治疗。本组表现为肾病综合征者15例, 完全缓解9例, 表明系膜增生性肾小球肾炎的治疗效果与其病理损害程度有关, 轻度系膜病变、不伴有局灶硬化者治疗效果好;重度系膜增殖, 伴有明显局灶硬化、肾小球囊壁粘连、间质纤维化者, 治疗效果不好。由于系膜增生性肾小球肾炎临床表现多样化, 组织形态改变轻重不一, 预后亦相差甚远, 因此及早行肾活检对明确诊断非常重要。

参考文献

[1]潘凯丽, 付蓉, 陈威.小儿系膜增生性肾小球肾炎59例的病理与临床.第四军医大学学报, 2001, 22 (13) :1244-1245.

[2]Pan KL, Shen Q, Cheng W.Analysis of36 children’s kidney biop-sies.Di-si Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil MedUniv) , 2000, 2 (2) :17.