靶向作用

靶向作用（精选十篇）

靶向作用 篇1

1 材料与方法

1.1 动物分组

取40只 (35±2) g身体状况基本相同的小鼠, 随机分成2组, 每组20只, 在实验室环境下饲养2d后开始试验。对照组:胃灌服生理盐水, 0.2mL/ (10g·次) , 2次/日, 连续5d;试验组:胃灌服肉桂水煎剂, 0.2mL/ (10g·次) , 2次/日, 连续5d。

1.2 肉桂水煎剂的制备

将100g肉桂放入500mL温水中浸泡12h, 大火烧开后, 小火煎熬60min, 提取水煎液, 用小火浓缩药液至100mL, 放入4℃冰箱内保存备用。

1.3 样品处理

1.3.1 血样的采集与处理

在最后一次给药后2h, 断头采血1.0mL, 放入有柠檬酸钠的干燥洁净的灭菌试管内, 试管做好标记。取全血进行T细胞活性检测 (E-玫瑰花环试验) 。然后再3500r/min离心10min (如不能及时离心应-70℃保存) , 分离血浆, 移取上清液, 在-20℃下冷冻待检。

将上清液放入全自动生化分析仪中, 测定丙氨酸转氨酶 (ALT) 、天冬氨酸转氨酶 (AST) , 谷胱甘肽S-转移酶 (GST) , 血清白蛋白 (Alb) 、血肌酐、尿素氮/肌酐比值 (BUN) 、白细胞数。

1.3.2 免疫器官指数的测定

对大鼠断头采血后, 分别取其胸腺和脾脏称湿重, 计算胸腺和脾脏指数。脾脏指数=脾重 (mg) /体质量 (g) ;胸腺指数=胸腺重 (mg) /体质量 (g) 。

1.3.3 心、脾、肺、肝、肾匀浆的制备

将采血致死的小鼠腹部剖开, 取出心、肝、脾、肺、肾, 放入洁净的烧杯内, 用冰冷的生理盐水清洗2～3次, 除去表面的血液 (心脏还应除去内部血液) , 用小镊子剥掉表面的结缔组织和脂肪, 然后用滤纸将表面多余的生理盐水吸干。在烧杯中加生理盐水少许, 将其剪碎, 然后用组织捣碎机作成匀浆, 并用生理盐水冲洗组织捣碎机。将脏器的匀浆液装入离心管内 (1/3左右) , 3000r/min离心15min。移取上清液, 在-20℃下冷冻待检。

1.3.4 心、脾、肺、肝、肾SOD与c AMP值测定

将脏器匀浆后移取的上清液, 送至上海蓝基生物有限公司测定SOD与c AMP值测定。

2 结果

2.1 T细胞E-玫瑰花环试验阳性率

对照组的小鼠T细胞E-玫瑰花环试验阳性率为 (60±5) %;实验组为 (69±5) %。实验组与对照组T细胞E-玫瑰花环试验阳性率差异极显著 (P<0.01) , 说明肉桂水煎剂有提高小鼠T细胞活性的作用。

2.2 胸腺、脾脏指数

对照组与实验组胸腺指数差异不显著, 这可能是小鼠发育成熟后胸腺畏缩造成的;对照组与实验组脾脏指数差异显著, 这说明肉桂水煎剂有促进脾脏生长发育, 因而提高免疫力的作用。见表1。

注:*表示差异显著 (P<0.05)

2.3 血液指标

实验组白细胞数升高 (P<0.05) , 说明肉桂水煎剂有提高机体抵抗力的作用;丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、谷胱甘肽S-转移酶含量对照组与实验组差异不显著 (P>0.05) , 说明肉桂水煎剂对肝脏功能影响不显著;血清白蛋白、血肌酐、尿素氮/肌酐比值对照组与实验组差异不显著 (P>0.05) , 说明肉桂水煎剂对肾脏功能影响不显著。见表2。

2.4 心、脾、肺、肝、肾SOD值

心、脾实验组的SOD (超氧化物歧化酶) 值明显高于对照组 (P<0.01) , 说明肉桂水煎剂对小鼠心、脾细胞的抗氧化能力有提高作用;肺、肝、肾实验组与对照组的SOD值差异不显著, 影响不明显。见表3。

注:*表示差异显著 (P<0.05)

注:**表示差异极显著 (P<0.01)

2.5 心、脾、肺、肝、肾c AMP的含量

心、脾实验组的c AMP (环磷酸腺苷) 含量明显高于对照组 (P<0.01) , 说明肉桂水煎剂对小鼠脾、肺细胞内的“第二信使”影响明显, 即功能影响明显;肺、肝、肾实验组与对照组的cAMP含量差异不显著, 影响不明显。见表4。

注:**表示差异极显著 (P<0.01)

3 讨论

3.1 肉桂水煎剂对小鼠心脏功能的影响

心脏是机体的主要循环器官, 反映其功能的主要指标是心指数。但心脏组织细胞中SOD与c AMP值的变化, 在一定程度上也能说明药物对心功能的影响[5]。实验结果显示肉桂水煎剂对小鼠心脏的SOD与cAMP值影响极显著, 因此证明肉桂水煎剂对小鼠心脏功能影响极显著。

3.2 肉桂水煎剂对小鼠脾脏功能的影响

实验结果显示肉桂水煎剂对小鼠脾脏指数影响显著, 对SOD与c AMP值影响极显著, 因此证明肉桂水煎剂对小鼠脾脏功能影响显著。

3.3 肉桂水煎剂对小鼠免疫功能的影响

反映机体免疫功能的主要指标有脾脏指数、胸腺指数、T细胞E-玫瑰花环试验阳性率、白细胞数等[6]。实验结果显示肉桂水煎剂有提高脾脏指数、T细胞E-玫瑰花环试验阳性率、白细胞数和脾脏的SOD与c AMP值的作用, 进而证明其有提高机体免疫力的功效。

3.4 肉桂水煎剂对小鼠肺脏功能的影响

实验结果显示肉桂水煎剂对小鼠肺脏的SOD与cAMP值影响不显著, 因此证明肉桂水煎剂对小鼠肺脏功能影响不显著。

3.5 肉桂水煎剂对小鼠肝脏功能的影响

反映肝脏功能的主要指标有丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、谷胱甘肽S-转移酶、血清白蛋白、血肌酐、尿素氮/肌酐比值、SOD与cAMP值等。实验结果显示肉桂水煎剂对小鼠血液中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、谷胱甘肽S-转移酶、血清白蛋白、血肌酐、尿素氮/肌酐比值、肝脏的SOD与cAMP值影响不显著, 因此说肉桂水煎剂对小鼠肝脏功能影响不显著。

3.6 肉桂水煎剂对小鼠肾脏功能的影响

血肌酐、尿素氮/肌酐比值、SOD与cAMP值的变化在一定程度上能反映肾脏功能的变化。实验结果显示肉桂水煎剂对小鼠血液中的血肌酐、尿素氮/肌酐比值和肾脏细胞的SOD与cAMP值影响不显著, 因此说明肉桂水煎剂对小鼠肾脏功能影响不显著。

综上所述, 肉桂水煎剂对小鼠的免疫功能、心、脾功能有明显的影响;对肺、肝、肾功能的影响不显著。肉桂归经与其作用靶向有关联, 但并不完全吻合, 即中医归经理论与现代药物靶向概念不能等同看待。

摘要：目的 试验肉桂对入经器官功能的影响, 研究归经与靶向作用的相关性。方法 试验组小鼠胃灌服肉桂水煎剂;对照组灌服生理盐水, 在最后一次给药后2h, 分别采取心脏、胸腺、脾脏、肺脏、肝脏及血液。测定两组血液比值。结果 肉桂水煎剂对小鼠心、脾和免疫功能指标影响极显著 (P<0.01) 。结论 肉桂归经与其作用靶向有关联, 但并不完全吻合, 即中医归经理论与现代药物靶向概念不能等同看待。

关键词：肉桂,归经,靶向作用,相关性

参考文献

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[4]支政, 徐树楠, 王文智, 等.归经理论现代研究之不足与量化研究新思路探索[J].中国中医基础医学杂志, 2011, 17 (8) :860.

[5]顾浩, 王耘, 肖斌, 等.中药功效-药性组合关联关系研究[J].时珍国医国药, 2011, 22 (7) :1568.

靶向作用 篇2

双重作用机制卟啉靶向给药体系的研究进展

近年来卟啉化学研究的一个新热点是,依据卟啉类化合物在肿瘤细胞优先集聚的特点,将其作为携带剂介导现有抗癌药物,实现靶向给药,同时利用卟啉的光敏性,实现分子内加和增效,合成具有化学杀伤和光动力杀伤双重活性的`卟啉-抗癌药物体系.本文主要就双重作用机制卟啉靶向给药体系的研究进展进行综述.

作 者：惠扬 马静 陶敏莉 周雪琴 刘东志 Hui Yang Ma Jing Tao Minli Zhou Xueqin Liu Dongzhi 作者单位：天津大学化工学院,天津,300072刊 名：化学通报(印刷版) ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY年，卷(期)：70(11)分类号：O6关键词：卟啉 靶向给药 化学杀伤 光动力杀伤 抗癌药物

靶向药物初探 篇3

靶向药物：相对传统的治疗药物而言，这类药物具有很强的针对性，目前主要用于肿瘤的特异性治疗，其特点是基于正常细胞与肿瘤细胞存在的分子差异，对肿瘤细胞进行特性杀伤而对正常细胞没有影响或影响很小，好像具有靶向性。表现为特异性强，毒副作用小，是个体化治疗的理想药物。

靶向药物作用的机制

靶向药物通过与其特异的靶分子结合，改变该分子的构象，阻断或减弱其天然分子与其结合的能力，阻止细胞接受增殖信号的能力或阻断该信号在细胞内的传递，进而引起细胞的凋亡，而正常细胞由于表达分子的差异，则不受或很少受到影响，从而达到治疗肿瘤的目的。

靶向药物的分类

靶向药物目前用于临床治疗的种类从结构上可分为单克隆抗体类和小分子化合物类。单克隆抗体是一种特异识别抗原单一表位的抗体，如：用于治疗乳腺癌靶向药物赫赛汀、用于治疗结直肠癌以及头颈鳞癌的艾比妥、用于治疗恶性淋巴瘤的美罗华；小分子化合物是一种模拟天然分子（如：ATP）并与功能分子特殊结构域结合的化学合成分子，其特点是其与功能分子结合后将阻断天然分子的结合或减弱天然分子结合的能力如：用于白血病以及胃肠道间质瘤治疗的格列卫、用于非小细胞肺癌治疗的易瑞沙、用于非小细胞肺癌以及胰腺癌治疗的特罗凯、用于胃肠道间质瘤以及肾癌治疗的舒尼替尼、用于肾癌治疗的索拉非尼等。

根据其作用的靶分子所分布的细胞部位可分为靶向受体的膜外区、靶向受体的膜内区以及靶向细胞内关键调控分子（注：细胞膜受体通常具有细胞膜外结构域、跨膜区、细胞膜内结构域，通常细胞膜外结构域与天然调控分子结合后会导致其细胞膜内的结构域活化）。靶向受体膜外区类药物，如：赫赛汀，艾比妥，美罗华）；靶向受体膜内区类药物，一般是受体酪氨酸激酶抑制剂类 （TKI）如：易瑞沙，特罗凯；靶向细胞内关键调控分子类药物，如：格列卫，舒尼替尼，索拉非尼。

另外从作用靶标的数目还可分为单一靶标类（赫赛汀，艾比妥，美罗华，易瑞沙，特罗凯等）和多靶标类（格列卫，舒尼替尼，索拉非尼）。

靶向药物发展的历史

靶向药物的发展与肿瘤标志物的鉴定与功能研究密切相关，自上世纪八十年代以来，肿瘤相关分子的研究取得了很大的进展，一些肿瘤特异的分子标志物以及其致病机制逐渐被人们所认识，其中的细胞增殖调控涉及的重要信号传导途径引起了极大的关注，干预这些调控途径无疑将干预细胞的增殖，通过大量的前期筛选，1997第一个用于治疗非霍奇金式淋巴瘤的分子靶向药物（针对细胞膜受体CD20的单克隆抗体）问世， 1998年针对乳腺癌治疗的分子靶向药物（针对HER-2/Neo过量表达的单克隆抗体）赫赛汀也获得临床应用批准，随后针对其它细胞受体相继推出，如：针对CD33的麦罗塔，针对EGFR的艾比妥等。

如前所述，肿瘤相关的异常分子除了表达于细胞膜上的受体外，更多的是位于细胞内部，由于单克隆抗体分子较大，正常情况下无法自由进入细胞的内部，所以探索可以自由进入细胞内部的小分子化合物就成为另一研发方向，针对细胞受体内部结构域以及重要信号传导途径中的组分设计并筛选的小分子化合物，显示出对肿瘤细胞显著的抑制作用，随后相继获得临床批准应用，如：抑制EGFR酪氨酸激酶活性的易瑞沙和特罗凯，抑制细胞增殖信号传导途径中重要分子RAF激活的索拉非尼。

由于肿瘤的发生是多层次的调控异常，针对肿瘤细胞内其它非信号传导途径中的重要分子的靶向药物最近也获得重要的进展，如抑制细胞内甲基化转移酶活性的阿扎胞苷和地西他滨，抑制细胞内蛋白降解复合体的万珂，抑制叶酸代谢的普拉曲沙，抑制细胞色素CYP2D6的阿比特龙，促进免疫增强的易普利姆玛等

最近单一分子作用于多个作用靶点小分子化合物相继也获得了临床应用批准，如：用于肾癌治疗的舒尼替尼和帕唑帕尼，该类分子由于作用于多个位点，不仅疗效显著，而且也不易产生耐药，是小分子化合物重要的研发方向。

靶向药物的临床应用状况

目前靶向药物的临床应用主要集中于肿瘤患者治疗，随着肿瘤发病率的增高，常规的放化疗不仅副作用大，造成患者的生活质量下降，而且对患者的生存期的延长有限，临床上迫切需要开发肿瘤靶向治疗药物，近年来靶向治疗药物的研发正在加速进行，获批的种类也在显著增加。临床应用显示，靶向治疗药物疗效显著，副作用很小，患者的生活质量也明显改善，生存期对大部分靶向治疗患者得到了显著的延长（虽然统计显示易瑞沙对非小细胞肺癌的治疗没有显著延长生存期，但患者的生命状态得到了显著改善）。像常规的化疗药物一样，患者随着治疗时间的持续，将从药物的敏感逐渐转变为耐药，所以如何克服耐药性将是靶向药物治疗的关键。国外临床资料显示，多种靶向治疗药物的联合应用将显著降低患者的耐药性，所以随着靶向治疗药物价格的下降，多种靶向治疗药物的联合应用将成为有效的治疗手段。同时需要强调的是，多作用靶点的靶向药物相对于单一靶点的药物而言可明显降低或推迟耐药性的出现。另外靶向药物与化疗药物的联合应用也明显提高敏感性增强治疗的效果，所以在肿瘤治疗中靶向药物的联合应用或与化疗药物的联合应用将成为重要的手段。

另外需要强调的是，靶向药物治疗机制是以其作用的分子特征为依据的，由于个体以及肿瘤发生过程的差异，只有带有靶向药物特异作用靶分子的部分患者才表现为对靶向药物的敏感性，而其他患者即使则表现为不敏感，再加上目前靶向药物的价格相对较为昂贵，而且不同的生产地区价格差异也较大，所以在评判靶向药物使用与否之前，对患者进行靶向分子的检测将是非常必要的。

我国靶向药物有关的状况

我国靶向药物起步较晚，目前我国自主开发的抗肿瘤靶向药物较少，其中属于单克隆抗体药物有：泰欣生(尼妥珠单抗)，其作用靶点为EGFR，广泛用于EGFR高表达肿瘤患者的治疗；美妥昔单抗，其作用靶点为细胞表面抗原CD147，主要用于原发性肝癌的治疗。属于小分子化合物的药物有：盐酸埃克替尼（商品名：凯美纳），其作用靶点为EGFR，主要用于晚期非小细胞肺癌的治疗。总之我国目前靶向药物仍处于起步阶段，其种类与规模与国外还有较大的差距，随着研发成本地下降，相信不久的将来靶向药物将会成为医保范围内的常规治疗药物，造福于广大肿瘤患者。

背景链接：美国食品药物监督局（FDA）批准临床应用的靶向药物：

单克隆抗体药物

药名靶分子批准年份应用

美罗华CD201997非霍奇金式淋巴瘤

泽娃灵CD202002非霍奇金式淋巴瘤

百克沙CD202003非霍奇金式淋巴瘤

麦罗塔CD332000急性粒细胞白血病

坎帕斯CD522001慢性淋巴细胞白血病

阿瓦斯丁VEGF2004；2008非小细胞肺癌，结直肠癌（2004）；乳腺癌，脑癌（2008）

艾比妥EGFR2004非小细胞肺癌；结直肠癌

赫赛汀HER-2/Neo1998乳腺癌

小分子化合物药物

药名靶分子批准年份应用

格列卫BCR-ABL，KIT，PDGFR2001慢性粒细胞白血病

易瑞沙EGFR2003非小细胞肺癌

阿扎胞苷甲基化转移酶抑制剂2004骨髓增生异常综合征

地西他滨甲基化转移酶抑制剂2006骨髓增生异常综合征

特罗凯EGFR2004，2005非小细胞肺癌（2004）；胰腺癌（2005）

索拉非尼多靶点2005肾癌

万珂蛋白降解复合体抑制剂2005套细胞淋巴瘤

驮瑞塞尔mTOR2007肾癌

达沙替尼/扑瑞赛BCR-ABL2006慢性粒细胞白血病

舒尼替尼多靶点2006肾癌

普拉曲沙叶酸代谢抑制剂2009T细胞淋巴瘤

阿比特龙CYP2D6抑制剂2011前列腺癌

依维莫司mTOR2009肾癌

帕唑帕尼多靶点2009肾癌

靶向作用 篇4

1 材料与方法

1.1 试剂与动物

海藻酸钠(温州东升试剂厂);阳离子瓜尔胶(美国E-conomy公司);盐酸表阿霉素(法玛西亚有限公司);抗VEGFR2单克隆抗体(美国Biodesign公司);碳化二亚胺(EDC)(美国Pierce公司);人肝癌Bel 7402细胞株(由中科院上海细胞生物研究所提供);三级BALB/c裸鼠(由中山大学医学动物实验中心提供)。

1.2 E-ADM-Ab-NPs的制备及抗体活性的检测

依据文献方法[5],利用聚电解质复合法制备E-ADM-NPs和未载药NPs。称取10 mg E-ADM-NPs和2 mg抗VEGFR2单抗溶于p H值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中,缓慢加入5 mg EDC,4℃条件下搅拌2 h而后静置过夜。将所得溶液离心后用蒸馏水洗涤3遍,冷冻干燥即可制得E-ADM-Ab-NPs。依法制备未载药Ab-NPs,参考文献[6]利用酶联免疫测定法(ELISA)对E-ADM-Ab-NPs和未载药Ab-NPs中抗VEGFR2单抗的活性进行检测。

1.3 荷人肝癌裸鼠模型的建立

取对数生长期的人肝癌Bel 7402细胞,用含15%小牛血清的PRMI 1640培养液按1×107/m L的浓度配成细胞悬液供皮下接种。取一定数量4~6周龄的三级BALB/c裸鼠,分别于右侧肩胛部皮下种植0.1 m L细胞悬液,饲养2周后选择生长良好、皮下肿瘤直径0.5~0.7 cm的裸鼠用于肿瘤治疗试验,饲养6周后选择生长良好、皮下肿瘤直径约1.0~1.2 cm的裸鼠用于药物的组织分布试验。

1.4 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布

取体重为(20±2)g/只的荷人肝癌裸鼠12只(雌雄各半),随机分为E-ADM-Ab-NPs组和E-ADM-NPs组,两组按含E-ADM 5 mg/kg的剂量分别经尾静脉注射E-ADM-Ab-NPs及E-ADM-NPs。每只裸鼠给药后1 h经眼静脉窦取血1.0 m L作样品,然后断颈处死裸鼠,手术分别取出肿瘤、心脏、肝脏、肾脏等组织作样品。利用高效液相色谱法(HPLC)检测荷人肝癌裸鼠组织和血液中E-ADM的浓度。

1.5 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的抑瘤试验

取体重为(18±2)g/只的荷人肝癌裸鼠48只(雌雄各半),随机分为8组,每组6只。A组:E-ADM-Ab-NPs组;B组:E-ADM-NPs组;C组:Ab-NPs组;D组:E-ADM原药加抗VEGFR2单抗组;E组:E-ADM原药组;F组:抗VEGFR2单抗组;G组:未载药NPs组;H组:空白对照组。各组制剂分别溶于生理盐水中,按E-ADM每次10 mg/kg、抗VEG-FR2单抗每次0.1 mg/kg的剂量经荷瘤裸鼠尾静脉注射,空白对照组注射生理盐水,每隔2天给药1次,共5次。于治疗第11天断颈处死裸鼠,取血清检测谷丙转氨酶、肌酐及白细胞计数。完整剥离瘤体测量长径及短径并称重,用体积=(长径×短径2)/2计算肿瘤体积,观察瘤体积抑制率及瘤重抑制率。瘤体积抑制率=[(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积]×100%,瘤重抑制率=[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-ADM-Ab-NPs的抗体活性

ELISA法检测表明,E-ADM-Ab-NPs浓度稀释至1∶1600时,其抗体仍表现出对靶抗原良好的免疫结合活性,其效价与游离抗VEGFR2单抗基本相当。

2.2 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布

E-ADM-Ab-NPs组肿瘤组织中的E-ADM浓度为(31.85±4.78)mg/kg,其显著高于E-ADM-NPs组(P<0.05),而血液、心脏、肝脏、肾脏等组织中的E-ADM浓度分别为(5.21±0.49)mg/L、(4.40±0.33)mg/kg、(3.14±0.27)mg/kg、(2.38±0.39)mg/kg,均显著低于E-ADM-NPs组(P<0.05),见表1。

注:与E-ADM-NPs组比较,*P<0.05

2.3 E-ADM-Ab-NPs对荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用

治疗11 d后与空白对照组相比,除未载药NPs组外其余各组的肿瘤体积和重量均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。E-ADM-Ab-NPs组的平均肿瘤体积及瘤体积抑制率为(79.17±18.63)mm3和60.69%,平均肿瘤重量及瘤重抑制率为(0.51±0.16)g和58.54%,显示其抗肿瘤作用强于其他组(P<0.05)。见表2、3。

注:与H组比较,*P<0.05;与A组比较,#P<0.05;“-”表示无数据

注:与H组比较,*P<0.05;与A组比较,#P<0.05;“-”表示无数据

2.4 毒副作用统计结果

E-ADM-Ab-NPs组的血白细胞计数及血清谷丙转氨酶水平为(6.82±1.09)×109/L和(40.26±15.27)U/L,与空白对照组相近,差异均无统计学意义(P>0.05)。E-ADM原药组及E-ADM原药加抗VEGFR2单抗组的血白细胞计数分别为(3.95±0.84)×109/L和(4.08±0.91)×109/L,明显低于其他组,而血清谷丙转氨酶水平则分别为(72.46±17.02)U/L和(68.51±15.94)U/L,显著高于其他组,差异均有统计学意义(P<0.05)。血肌酐水平在各组中的差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

注:与H组比较,*P<0.05;与E组比较,#P<0.05

3 讨论

原发性肝癌化疗的总体疗效一直不甚理想,传统的全身静脉化疗对机体有较强的毒副作用,限制了化疗药物在肿瘤局部达到有效浓度,而局部化疗如肝动脉栓塞化疗(TACE)等往往需要创伤性操作才能实现。如何在提高肿瘤组织药物浓度的同时降低正常组织中的药物浓度,是目前肿瘤化疗研究的热点,因此载药纳米微粒靶向治疗具有广阔的前景。

本研究利用聚电解质复合法合成载E-ADM纳米微粒,其载体材料海藻酸钠的分子链上富含羧基和羟基,可通过化学交联与抗VEGFR2单克隆抗体相结合,ELISA法检测表明在E-ADM-Ab-NPs制备过程中抗体活性无明显丧失。VEGFR2主要分布于肿瘤血管内皮表面及原发性肿瘤细胞表面,而在正常组织及良性血管增生性组织中仅呈低水平表达,是介导血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管形成中发挥功能的主要受体[7,8,9]。原发性肝癌组织的VEGFR2阳性表达率达60%~70%[10],而抗VEGFR2单抗是针对VEGFR2的特异性抗体,能将化疗药物携带至肿瘤组织中发挥免疫靶向治疗作用[11,12,13]。荷人肝癌裸鼠模型体内的分布试验表明,E-ADM-Ab-NPs可选择性地集中于肿瘤组织,而在血液、心脏、肝脏、肾脏等正常组织中的分布较少。E-ADM-Ab-NPs具有的良好缓释性能可使肝癌组织较长时间处于有效的药物浓度中,同时抗VEGFR2单抗可竞争性抑制VEGF与VEGFR2结合,从而抑制肿瘤血管的生成[14,15]。荷人肝癌裸鼠模型的体内治疗发现,E-ADM-Ab-NPs组的瘤体积抑制率和瘤重抑制率明显高于E-ADM原药组,有助于临床上减少化疗药物的单次用量,并避免长时间持续静脉用药所带来的不便。包含E-ADM原药各组的荷瘤裸鼠血白细胞计数明显低于空白对照组,血清谷丙转氨酶水平明显高于空白对照组,而E-ADM-Ab-NPs组的血白细胞计数和血清谷丙转氨酶水平则与空白对照组相近,表明E-ADM-AbNPs可减少E-ADM原药的骨髓抑制和肝功能损害等毒副作用。

综上所述,本研究合成的E-ADM-Ab-NPs由于纳米微粒的缓释性能及抗VEGFR2单抗的导向作用,可明显提高其对荷人肝癌裸鼠模型的抗肿瘤效应,并降低E-ADM原药的全身毒副作用,是一种安全有效的新型肝癌靶向治疗制剂,具备良好的临床应用前景。

摘要：目的 制备表阿霉素(E-ADM)免疫纳米微粒(NPs),观察其对荷人肝癌裸鼠模型的靶向治疗效应。方法利用聚电解质复合法合成载表阿霉素纳米微粒(E-ADM-NPs),化学交联法合成载表阿霉素的抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体纳米微粒(E-ADM-Ab-NPs),观察E-ADM-Ab-NPs在荷人肝癌裸鼠模型体内的分布特点,观察药物的靶向抗肿瘤效应及其毒副作用。结果 E-ADM-Ab-NPs保留了抗VEGFR2单克隆抗体的活性;E-ADM-Ab-NPs组肿瘤组织中的E-ADM浓度为(31.85±4.78)mg/kg,显著高于E-ADM-NPs组(P<0.05);E-ADM-Ab-NPs组的瘤体积抑制率及瘤重抑制率为60.69%和58.54%,较E-ADM-NPs组和E-ADM原药组均明显增强(P<0.05);且E-ADM-Ab-NPs组的血白细胞计数、谷丙转氨酶及肌酐水平与空白对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);而E-ADM原药组的血白细胞计数较空白对照组下降42.68%,血清谷丙转氨酶水平则升高88.06%(P<0.05)。结论 E-ADM-Ab-NPs具有免疫活性,其在动物模型体内呈导向性分布,可提高E-ADM的疗效并有效降低E-ADM的毒副作用,是一种安全的新型药物纳米靶向制剂。

靶向作用 篇5

1 与表皮生长因子受体家族相关的分子靶向药物 有25%～30%过度表达HER2)。目前拉帕替尼已被

批准与卡培他滨或来曲唑联合治疗HER2高表达的转移性乳腺癌患者[6]。

1.2 单克隆抗体 (monoclonal antibody, mAb) mAb一方面可以特异性地识别受体的胞外区, 与配体相互竞争, 从而阻断EGFR家族的激活及其下游信号蛋白的磷酸化; 另一方面还可引发受体的内吞降解, 减少受体密度, 从而减弱细胞生长信号的传导。此外, 表皮生长因子受体 (epidermal growth factor mAb与受体的结合还可以激发补体介导的细胞杀伤

receptor, EGFR) 家族属于受体酪氨酸激酶家族, 包括EGFR (HER1/ErbB-1)、ErbB-2 (HER2/neu)、ErbB-3 (HER-3) 和ErbB-4 (HER-4)。EGFR家族蛋白定位于细胞膜上, 由胞外配体结合区、跨膜疏水结构区和胞内酪氨酸激酶区三部分组成。当与配体 (主要为表皮生长因子和转化生长因子α) 结合后, 受体蛋白可以形成同型/异型二聚体, 发生自磷酸化, 激活下游包括Ras-Raf-MAPK和PI3K-Akt-mTOR等信号通路。这些信号通路的激活参与了细胞生长、分裂和分化等调控, 从而介导了细胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程[2]。

近年对EGFR家族受体的研究主要集中于ErbB1和HER2, 根据药物作用靶点和性质的不同, 可将其分为酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体两类。 1.1 酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitor, TKI) TKI可以进入细胞内, 直接作用于EGFR家族受体的胞内区, 干扰ATP结合, 阻断激酶的自身磷酸化, 从而阻断异常的信号传导产生抑瘤效果。目前FDA批准上市的药物有吉非替尼 (gefitinib, Iressa?, 2003)、厄洛替尼 (erlotinib, Tarceva?, 2004)、拉帕替尼 (lapatinib, Tykerb?, 2007) 和阿法替尼 (afatinib, Gilotrif?, 2013)。

吉非替尼作用于EGFR (ErbB1), 2003年第一个被批准用于二线/三线治疗非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 患者[3]。研究发现, EGFR是否为突变型成为吉非替尼能否产生良好疗效的预测因子, 该临床指导意义同样适用于随后上市的厄洛替尼 (EGFR TKI) 和阿法替尼 (EGFR/HER2 TKI)。对于检测出EGFR突变体阳性的NSCLC患者, 厄洛替尼效果更优, 可以作为一线治疗药物用于临床[4]。与前两种药物相比, 阿法替尼与受体以不可逆方式结合, 不易从ATP结合位点被替换, 一定程度上克服了肺癌患者长期服用这类药物后所产生的获得性耐药[5]。

拉帕替尼作为EGFR/HER2双重激酶抑制剂, 主要用于治疗HER2阳性的乳腺癌 (原发性乳腺癌患者

效应 (complement dependent cytotoxicity, CDC) 和抗体依赖的细胞杀伤效应 (antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity, ADCC), 发挥间接抗肿瘤作 用。目前FDA已经批准上市的该类药物包括曲妥珠单抗 (trastuzumab, Herceptin?, 1998)、西妥昔单抗 (cetuximab, Erbitux?, 2004)、帕尼单抗 (panitumumab, Vecibix?, 2006)、帕妥珠单抗 (pertuzumab, Perjeta?, 2012) 和ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla?, 2013)。

西妥昔单抗特异性针对EGFR (ErbB1) 受体, 其药效与K-RAS基因是否突变密切相关。野生型的K-Ras受上游的EGFR信号调控, 但当其基因发生突变时, K-Ras蛋白处于持续活化状态, 不受上游信号影响。因此针对ErbB1的单克隆抗体在K-RAS突变时无法有效发挥抗肿瘤作用[7]。这种用药对象的筛选同样适用于2006年上市的帕尼单抗 (EGFR-mAb), 一种完全人源化的IgG2单克隆抗体[8]。与西妥昔单抗 (人鼠嵌合型单抗) 相比, 帕尼单抗具有更高的受体亲和性, 且半衰期更长, 免疫原性更低, 治疗前不需预处理。

曲妥珠单抗于1998年首次由Genentech公司 研发, 选择性作用于HER2, 与其他化疗药联合可以用于治疗HER2阳性的乳腺癌和胃癌患者[9]。此后Genentech公司又推出了靶向HER2的帕妥珠单抗和抗体?药物偶联物ado-trastuzumab emtansine。帕妥珠单抗作为第一个HER2二聚化抑制剂, 与曲妥珠单抗的作用靶点有所不同, 因此这两种单抗被批准可以用于联合治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[10]。Ado- trastuzumab emtansine作为一种较新的药物形式, 由曲妥珠单抗和微管抑制剂药物DM1 (一种美登素的衍生物) 通过硫醚链接子 (MCC linker) 共价链接。通过与HER2受体的结合, ado-trastuzumab emtansine被内吞进细胞, 在溶酶体内降解后释放出DM1, 对细胞周期产生阻滞作用, 引发细胞凋亡。目前FDA批准ado-trastuzumab emtansine作为单药可用于既往接受过紫杉类和曲妥珠单抗治疗的HER2阳性、转移

・ 1234 ・

药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (10): 1232?1239

性乳腺癌[11]

。 2 与血管生成抑制相关的分子靶向药物

近年来, 靶向肿瘤新生血管的治疗逐渐得到了人们的关注, 通过抑制肿瘤血管生成, 阻断肿瘤的营养来源和迁移通道, 从而达到治疗目的。促进新生血管生成的活性物质有很多, 其中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 起着非常重要的作用, 以VEGF和VEGFR为靶点成为最常见的抗血管生成分子靶向研究。

2.1 靶向VEGF的药物 VEGF家族结合3种类 型的酪氨酸激酶受体: VEGFR1 (flt1)、VEGFR2 (flt2或KDR) 和VEGFR3 (flt3)。其中VEGFR2是与血 管生成和血管渗透性相关的最重要受体, 且主要和VEGF-A结合发挥作用。目前已开发的针对VEGF药物有贝伐单抗 (bevacizumab, Avastin?, 2004) 和ziv- aflibercept (Zaltrap?, 2012)。贝伐单抗高亲和力结合所有VEGF亚型 (主要为VEGF-A), 抑制新生血管生成, 是首次批准上市的VEGF抑制剂, 同时也是最成功的血管抑制类药物。其适应证广泛, 可以与其他化疗药联合治疗转移性结直肠癌、NSCLC、转移性肾癌和胶质母细胞瘤等, 临床效果明显[12]。Ziv-aflibercept是一种重组的融合蛋白 (由VEGF和VEGFR结合的片段和IgG1的Fc段融合得到), 作为一个可溶性的受体, 可与VEGF-A、VEGF-B和PLGF结合发挥抑制作用。

2.2 靶向VEGFR的药物 针对VEGFR的药物大多为小分子的酪氨酸激酶抑制剂, 其机制与EGFR TKIs类似, 但特异性不强, 往往这些抑制剂同时结合许多其他受体家族 (如血小板衍生生长因子受体、干细胞因子受体等), 因此这类药物也被称为多靶点激酶抑制剂。目前已被批准的有索拉菲尼 (sorafenib, Nexavar?, 2005)、舒尼替尼 (sunitinib, Sutent?, 2006)、帕唑替尼 (pazopanib, Votrient?, 2009)、凡德他尼 (vandetanib, Caprelsa?, 2011)、cabozantinib (Cometriq?, 2012)、阿西替尼 (axitinib, Inlyta?, 2012)、瑞格非尼 (regorafenib, Stivarga?, 2012) 和乐伐替尼 (lenvatinib, Lenvima?, 2015)。由于这些药物所针对的不同靶点与肿瘤细胞的增殖、血管的生长及肿瘤基质微环境的维持密切相关, 因此多靶点激酶抑制剂既可以抑制血管的形成又能直接抑制肿瘤细胞的增殖, 临床批准用于多种恶性肿瘤, 如肾癌、甲状腺癌、胃肠道间质癌和结直肠癌等。关于抗体类的药物, 目前上市的只有刚批准的完全人源化的单抗ramucirumab (Cyramza?, 2014), 其特异性靶向VEGFR2, 阻断配体与受体的结

合, 从而达到信号转导抑制、血管形成受阻等目的。 3 与细胞膜特异性抗原相关的分子靶向药物

以特异性抗原分子为靶点的药物较多, 其中针对EGFR家族和VEGF家族的抗体药物已在前面有所涉及, 在此不再赘述。

CD20多表达于正常或癌化的B细胞, 在超过90%

B细胞非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin’s lymphomas, NHL) 和多数B细胞慢性淋巴细胞白血病 (chronic lymphocytic leukemia, CLL) 上均呈阳性表达, 同时 CD20 在正常造血干细胞、分化成熟的浆细胞及其他类型造血细胞系中无表达, 因此CD20成为B淋巴 细胞瘤治疗 一个很好的靶点[13]。这类药物包括利妥

昔单抗 (rituximab, Rituxan?, 1997)、替伊莫单抗 (90Y-ibritumomab tiuxetan, Zevalin?, 2002)、托西莫单 抗 (131I-tositumomab, Bexxar?, 2003)、ofatumumab

(Arzerra?, 2009) 和obinutuzumab (Gazyva?, 2013)。利妥昔单抗作为第一个被FDA认证的单抗类药物 (I型人/鼠嵌合单抗), 与ofatumumab (II型全人源化单抗) 和obinutuzumab (II型人源化单抗, 糖基化修饰) 均为单一的CD20单克隆抗体, 主要通过CDC 和ADCC作用诱发B细胞凋亡。经过人源化改造, ofatumumab较利妥昔单抗具有更低的免疫原性及耐受性, 但结合的亲和力也出现了一定程度的降低。随后obinutuzumab通过修饰Fc段增强了对受体FcγIIIa的亲和力, 对NHL的总体响应率及耐受性更强。替伊莫单抗与托西莫单抗是典型的mAb偶联物, 除上述促B细胞凋亡作用外, 该类型的药物还可将发射β粒子或α粒子的放射性核素引向药物靶点, 进一步杀伤肿瘤细胞。CD52同样高表达于B-CLL上, 因此也可以将CD52作为CLL治疗的分子靶点。基于此, 抗CD52的阿仑单抗 (alemtuzumab, Campath?) 于2001年获得FDA批准, 用于治疗难治复发性B-CLL[14]。

其他的特异性靶点还有CD33、CD30、CD3-CD19和GD2, 上市的药物分别为吉妥珠单抗 (gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg?, 2000)、brentuximab vedotin (Adcetris?, 2011)、blinatumomab (Blincyto?, 2014) 和dinutuximab (Unituxin?, 2015)。吉妥珠单抗是由单抗和细胞毒抗肿瘤抗生素calicheamicin偶联形成, 偶联的抗体特异性针对CD33抗原, 该抗原在80%以上的

分子靶向核医学显像 篇6

[中图分类号] R445   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）08-09-03

分子靶向核医学显像针对分子靶点有：反义分子、适体、抗体和抗体片段、肿瘤和神经细胞受体等。分子核医学影像可以提供疾病的病理生理及活体生物化学的相关信息，包括代谢、乏氧、细胞增殖、凋亡、血管生成、多药耐药等。

1 分子靶向核医学

所谓的分子靶向核医学，是在细胞分子水平上，针对已经明确的位（靶）点（该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段等），设计相应放射性核素标记的显像剂或治疗药物，其进入体内会特异地选择这个位（靶）点，结合发生作用，达到显像或放射治疗的目的。

目前，几个分子显像剂已经进入临床应用。其中最重要的是18F-FDG，作为葡萄糖转运蛋白表达的标记，被誉为“千年分子”。18F-FDG PET应用得到迅速地发展，作为一种常规的临床成像工具，它已被证明是一个敏感的肿瘤显像剂，可以提供肿瘤生物特性；可以监测肿瘤治疗反应等；其应用还包括评估存活心肌和癫痫的诊断等。两个生长抑素受体靶向显像剂，111In 标记的奥曲肽和99Tcm -depreotide，可以对神经内分泌肿瘤或肺癌进行特异的肿瘤显像。虽然抗体成像尚未充分发挥其潜力，一些抗肿瘤抗体已经成熟并具备实用的特点，这包括：靶向黏液状的表面糖蛋白TAG-72的111In-satumomab pendetide（Oncoscint），用于直肠癌或卵巢癌的诊断；靶向前列腺特异性膜抗原的111In-capromab pendetide（Prostascint），用于前列腺癌的诊断；靶向癌胚抗原（CEA）的99Tcm-arcitumomab（CEA Scan），用于肠道恶性肿瘤的诊断；靶向血小板糖蛋白Ⅱb / Ⅲa受体的一种肽类，99Tcm -Apcitide（AcuTect），用于检测下肢深静脉血栓形成等。这些成功的应用表明，分子核医学影像时代已经到来。

2 目前已经取得的进展

2.1 反义靶向

反义基因显像是利用放射性核素标记的反义寡核苷酸分子探针，与肿瘤中过度表达的目标mRNA特异性互补结合，在体外通过SPECT（单光子发射型断层显像）、PET（正电子断层显像）等检查手段，在基因表达水平早期、定性诊断疾病。虽然反义基因显像在细胞及动物实验取得一定的成功[1-2]，但是目前报道经修饰或不同载体的反义寡核苷酸分子探针由于穿透生物屏障、细胞膜的能力，体内稳定性等方面原因，导致反义寡

核苷酸分子探针进入肿瘤细胞靶点的数量少，靶区/本底比值低，不能满足体外显像的要求。这使反义分子探针的进一步设计合成及加载必要的载体成为迫切的需要。

除了典型的DNA-DNA和DNA-RNA杂交，寡核苷酸还可以绑定到胞浆内或核内蛋白质。反义寡核苷酸成像应用还包括病毒（艾滋病毒，巨细胞病毒，EB病毒）感染，炎症，心肌缺血（热休克蛋白70）等[3]。

2.2 肿瘤抗原

随着杂交瘤技术、单克隆抗体技术的快速发展，放射性核素标记的抗体得到相当大的进展。如目前市售针对显像使用的癌胚抗原，肿瘤相关糖蛋白（TAG-72）和前列腺特异膜抗原的抗体；针对角蛋白8、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、多形性上皮黏蛋白抗原（黏蛋白）和表皮生长因子受体的抗体等；放射性核素标记CD20抗体被批准用于治疗淋巴瘤。

然而，抗体成像的技术问题，包括抗体（HAMA）反应、交叉反应、非特异性摄取、肝摄取和免疫反应等因素，限制了抗体成像的进一步发展。为此，抗体的设计合成的改进、多级抗体的应用、人或嵌合鼠抗体的研制等工作是下一步研究的方向。

另一种方法是使用高亲和力的肽。检测内源性结合最优的肽序列后，利用放射性核素标记，进行相关显像。肽的优点：可以直接合成、无FC受体、更快的吸收动力学和血液清除率高等[4]，且有价格优势。

2.3 肿瘤受体

2.3.1 σ-受体 σ-阿片受体包括两个亚型，σ-1和σ-2。包括前列腺癌在内的某些肿瘤过度表达σ-1受体。σ-2受体过度表达在多种类型的肿瘤，包括恶性黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺小细胞癌。σ-2受体的表达与肿瘤细胞的增殖状态（细胞增殖）相关。放射性核素标记的σ-1或σ-2受体的特异性配体可以进行相应的受体显像[5]。

2.3.2 乳腺癌受体 乳腺癌的内分泌治疗是公认的。约55％～65％的原发性乳腺癌表达雌激素受体，45％～60％表达孕激素受体。放射性核素标记的雌激素类似物已用于人类乳腺肿瘤检测，可以评估肿瘤雌激素受体状态，并监测响应抗雌激素治疗。Her-2/neu是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在17％～30％的原发性乳腺癌表达。曲妥珠单抗（赫赛汀）是一种单克隆抗体，131I标记anti-HER-2/neu单克隆抗体可以与HER-2/neu细胞外部分结合[6]。在荷乳腺肿瘤小鼠实验中观察到肿物的摄取。

2.3.3 其他受体 各种在肿瘤过表达的受体都可以用于显像。这包括：G-蛋白偶联受体、胃泌素释放肽受体、血管活性肠肽受体、生长抑素受体、酪氨酸激酶受体、血小板衍生生长因子（PDGF）-B受体、生长因子受体（VEGF）、胰岛素样生长因子1型受体、表皮生长因子受体（EGF-R）、白细胞介素-2受体的β-亚基等。放射性核素标记的相应配体进行的体外显像，可以用于肿瘤的诊断、靶向抗肿瘤药物的选择、药物治疗的监测等方面。

2.4 肿瘤代谢

肿瘤细胞的葡萄糖代谢、蛋白质代谢、氨基酸代谢等均发生异常，利用放射性核素标记的相应代谢底物，可以进行肿瘤代谢显像。如目前大量应用的18F-FDG葡萄糖代谢显像用于肿瘤的诊断、分级、分期等。因涉及内容繁多，这部分内容将另文详述。

2.5 肿瘤乏氧

组织缺氧是肿瘤、脑血管疾病、缺血性心脏疾病、周围血管疾病和炎症性关节炎的发病机制的核心之一。肿瘤乏氧程度可以判断其侵袭力，并与化疗或放疗抵抗相关。乏氧诱导因子（HIF）是在这个过程中的关键因子。在脑肿瘤中，HIF-α表达程度与肿瘤的分级相关。目前，还没有直接针对乏氧诱导因子的显像剂。一些可以反映组织乏氧程度的显像剂得到应用。如18F-fluoromisonidazole（FMISO），18F-fluoroerythronitroimidazole，123I-iodoazomycin arabinoside （IAZA）。SPECT乏氧显像应用较多的是99Tcm-HL91，它是一个非硝基咪唑类化合物；其他PET示踪剂还有64Cu-和60Cu-标记的copper–diacetyl–bis（N4-methylthiosemicarbazone）（ATSM）[7]。

2.6 肿瘤增殖

不受控制的细胞增殖是恶性肿瘤的标志之一，细胞有丝分裂活动的组织学指标增强与肿瘤细胞间变和肿瘤侵袭性增强相关。针对增殖的显像可用于区分良或恶性病变；确定高分化肿瘤的失分化趋势；确定最佳活检部位、手术切除范围或放射治疗布野等。18F-FDG葡萄糖代谢显像可以间接反映肿瘤的增殖情况；直接反肿瘤映增殖情况的放射性核素标记的核苷类似物包括18F-1’-fluoro-5-（C-methyl）-1-β-D–arabino furanosyluracil（FMAU）[8]，124I-iododeoxyuridine和124I-5-iodo-1-（2-fluoro-2-deoxy-β-D-arabinofuranosyl）-uracil（FIA U）等。

2.7 细胞凋亡

细胞凋亡（程序性细胞死亡）是一个活跃的、能量依赖的机制。可以清除已经受伤、感染或经免疫认为有害或多余的细胞。凋亡级联反应是复杂的，为成像提供了一些潜在的目标。细胞发生凋亡时，通常在细胞膜内的磷脂，突然易位到细胞膜外部。膜联蛋白V可以结合在暴露的磷脂上。99Tcm-Annexin V已在动物模型用于凋亡显像[9]。

2.8 血管新生

血管生成抑制剂是最有前途的新的肿瘤治疗药物之一。已经确定促血管生成和血管生成抑制因子有几十个。在血管内皮细胞生成和血管重塑过程中，在VEGF刺激下整合素αvβ3高表达，而在成熟的血管或在非肿瘤性上皮细胞无表达。其包含基序：-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列。几项研究表明：采用18F、99Tcm锝、111In、64Cu标记RGD肽，已经在荷瘤动物模型上获得成功[10]。

2.9 神经受体和神经递质

2.9.1 多巴胺系统 黑质多巴胺能神经元的缺失是帕金森氏症病理生理机制的核心。这个系统还与精神分裂症、抽动秽语综合征、自闭症和吸毒等有关。第一个显像剂是18F-6-L-fluorodopa，它是多巴胺的前体，可以直接评估多巴胺功能；在临床研究中，对帕金森氏症病的早期诊断和鉴别诊断方面，已得到了很好的验证。在欧洲临床中，SPECT显像剂2β-carbomethoxy-3β-（4-123I-iodophenyl）tropane（β-CIT）[11]得到广泛应用。

已确定至少5种多巴胺受体亚型，可归类为D1-D2类，分别激活或抑制腺苷酸环化酶。D2类受体一般在纹状体的GABA能神经元分布。受体显像可以帮助鉴别非典型帕金森氏综合征、渐进性核上性麻痹、多发性系统萎缩下降等。D2受体的配体包括11C-raclopride和123I-s（-）iodobenzamide（IBZM）。D1受体的配体包括11C-SCH 23390和11C-NNC-112，11C-NNC-687，和11C-NNC-756等。

2.9.2 胆碱能系统 突触后毒蕈碱乙酰胆碱受体在大脑皮质和基底节广泛表达。被认为与学习和记忆有关，并已在AD和匹克氏病、精神分裂症等出现异常。研究配体包括[N-11C-methyl]benztropine，123I-IPIP和（R，S）-3-quinuclidinyl-4-123I-iodobenzilate （IQNB）。神经元烟碱受体分布相对局限，包括丘脑，海马，纹状体和下丘脑等。其在认知和记忆，情感，运动控制中发挥的作用；并在抑郁，焦虑、精神分裂症、帕金森氏病等发生改变；皮质烟碱乙酰胆碱受体受损已被证实与AD的临床严重程度有关。代表配体包括11C-nicotine和5-123I-iodo-A-85380[12]。

2.9.3 谷氨酸系统 谷氨酸钠是一种兴奋性神经递质，是已经确定了六个神经元上受体家族之一；在海马锥体神经元上这些受体的密度最大，推测在学习和记忆中起关键作用。其中，电压门控钙通道被称为NMDA受体，是研究最多的一个。NMDA受体的过度刺激，被认为是癫痫和脑缺血神经元损伤的主要机制。其代表配体N-（1-naphthyl）-N’-（3-125I-iodophenyl）-N’-methylguanidine（125I-CNS 1261）[13]。

2.9.4 阿片系统 阿片受体家族中的μ亚型（阿片类镇痛药）和δ和κ亚型（脑啡肽和强啡肽）是被研究较多的亚型。阿片受体的改变见于疼痛、成瘾及帕金森氏病、亨廷顿氏病、癫痫等。11C-Carfentanil是μ亚型的特异配体，已被广泛研究。11C-Methyl naltrindole是一种δ亚型的特异配体。Diprenorphine作为非特异的配体，已被11C、18F和123I标记，并进行相关研究[14]。

2.9.5 脑组织中的异常蛋白质 阿尔茨海默病（AD）是一个复杂的原发的神经退行性疾病。其病变主要包括：tau蛋白磷酸化、神经纤维缠结、神经元微管相关蛋白、老年斑、β-淀粉样变性等。大多数研究是针对这些病变成分展开的。如针对残留的β-淀粉样蛋白，99Tcm标记的单克隆抗体10H3[15]，123I标记的血清淀粉样P成分等。

2.10 多药耐药

P-糖蛋白（Pgp）是多药耐药基因MDR1的产物。一些恶性肿瘤Pgp过表达，限制了多种化疗药物如柔红霉素、长春新碱、阿霉素等的效果。心肌灌注显像剂99Tcm-sestamibi、99Tcm-tetrofosmin和99Tcm-furifosmin可以反映肿瘤的多药耐药基因或同源多药耐药基因的表达水平。这些示踪剂作为分子靶向剂，可以评估Pgp表达水平，从而预测化疗反应[16]。

2.11 报告基因

报告基因是人为地插入目标细胞或组织的一个外源基因，作为一种方便的方式来确认成功引入的治疗基因表达情况。迄今，在临床上已使用的报告基因系统主要包括多巴胺2型报告基因或单纯疱疹I型胸苷激酶基因（HSV-TK1）。HSV-TK1的靶向制剂包括18F-fluoroganci-clovir（FGCV）、18F-fluoropenciclovir（FPCV），9-[4-18F-fluoro-3-（hydroxymethyl） butyl] guanine（FHBG）等[17]。

3 总结

目前，分子靶向成像正处于起步阶段。开发、设计特异的、理化性质优良的分子探针尤为重要，一个成功的分子显像可以产生良好的效果。例如，许多癌前病变的成功检测是非常有益的，使“先发制人”的方式治疗恶性肿瘤成为可能。可以想象在现在和未来，分子靶向显像正在或将要改变我们的临床思维方式，从而改变目前患者检查和治疗的流程，以获得最佳的诊疗效果。

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靶向作用 篇7

为此, 本研究通过逆转录实时荧光定量PCR方法检测3种ABI-1相关mi RNA在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达差异, 从而筛选出可能靶向调节ABI-1蛋白表达的mi RNA, 为进一步研究其在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本研究为回顾性研究, 收集我院2000年1月~2007年12月间病历资料完整的59例胃腺癌手术后存档蜡块, 所有患者经术后组织病理学确诊, 术前均未接受化疗和放疗。每例患者各取2块标本, 分别为胃癌组织及距肿瘤边缘5 cm以上的癌旁正常组织。胃癌的组织学分型依据2000年WHO病理组织学分型标准, 肿瘤的临床病理分期依据2002年国际抗癌联盟 (UICC) 所定的胃癌分期法。

59例患者中, 男性46例 (78.0%) , 女性13例 (22.0%) ;年龄38~83岁, 平均 (65.1±11.6) 岁。管状腺癌51例, 黏液腺癌2例, 印戒细胞癌6例;高分化腺癌7例, 中分化腺癌22例, 低分化腺癌30例;早期胃癌6例, 进展期胃癌53例;淋巴结转移40例;远处器官转移15例。

1.2 实验材料与仪器

总RNA提取试剂盒购自美国Ambion公司, 逆转录 (RT) 试剂盒购自美国Qiagen公司, SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自日本Ta Ka Ra公司, PCR引物由上海欧易生物医学科技有限公司合成。实验所用主要仪器为ABI 9700型定量逆转录PCR仪及ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪。

1.3 确定待检ABI-1相关mi RNA

在基因网 (http://www.targetscan.org/) 上查找人类ABI-1基因相关的mi RNA, 确定mi R-181c、mi R-148b、mi R-9为待检测基因, 查找相应引物序列并合成引物。

1.4 石蜡组织中总RNA提取

挖取约100 mg石蜡组织标本, 按石蜡组织RNA提取试剂盒的说明书步骤, 经脱蜡、蛋白酶消化、核酸抽提及提纯等步骤提取石蜡组织中的总RNA。用琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行质量检测, 并进行定量, 将获得的达到质量要求的RNA低温保存用于后续实验。

1.5 逆转录实时荧光定量PCR法检测胃癌组织中mi RNA相对表达量

按逆转录试剂盒说明配制逆转录反应体系, PCR仪上37℃保温60 min使逆转录反应完全后, 95℃5 min终止反应, 得到c DNA作为模板扩增检测mi RNA基因表达。PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增引物序列, hsa-mi R-181c:5'-AACATTCAACCTGTCGGTGAGT-3';hsa-mi R-148b:5'-TCAGTGCATCACAGAACTTTGT-3';hsa-mi R-9:5'-TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA-3';内参基因U6序列为5'-CAAGGATGACACGCAAATTCG-3';反向引物采用Qiagen逆转录检测试剂盒自带的通用引物。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒说明配制实时荧光定量PCR体系, 应用荧光定量PCR仪进行PCR扩增, 每一个PCR设置3个重复孔。扩增条件为95℃30 s, 然后在95℃5 s, 60℃34 s下循环40次。结果分析采用相对定量方法, 根据PCR扩增曲线, 得到每个样品的Ct值, 按照公式相对表达量Y=2-ΔΔCt, ΔΔCt=[癌组织 (Ct目的基因-Ct内参基因) ]-[癌旁正常组织 (Ct目的基因-Ct内参基因) ], 计算出胃癌组织相对于癌旁正常组织的扩增效率[4]。

1.6 统计学分析

本实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用SPSS 13.0统计软件, 采用t检验统计方法。检验水准α=0.05, P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

mi R-181c、mi R-148b、mi R-9在胃癌组织中的相对表达量分别为 (2.32±1.04) 、 (0.82±0.67) 、 (1.07±0.95) , 其中mi R-181c在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织 (2.32:1) , 其表达的差异具有显著性 (P=0.000) , 而mi R-148b、mi R-9在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达无明显差异 (分别为P=0.321, P=0.774) (见附表) 。

3 讨论

micro RNA简称mi RNA, 是一类由19~26个核苷酸构成的单链非编码RNA分子, 参与细胞分化、增殖、凋亡等一系列生物学行为, 且具有调节基因表达活性的功能。而基因表达的紊乱是引起肿瘤发生发展的重要始动因素之一, 故mi RNA与肿瘤发生发展关系的研究为纷繁的肿瘤研究开辟了新的思路, 也成为当前肿瘤研究的热点之一。

目前研究已分离鉴定的mi RNA有500余种, 其中约200种参与癌症的发生, 在慢性淋巴性白血病、肺癌、B细胞淋巴瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌及乳腺癌等多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5,6,7,8,9]。而围绕mi RNA与胃癌相关性的研究也得到广泛开展, 并不断深入。ZHANG等[10]研究mi R-21在胃癌的发病机制中发挥重要作用, , 通过实时定量PCR分析发现胃癌组织中mi R-21表达水平明显升高, 并在胃癌SGC7901细胞系和AGS细胞系的研究中发现mi R-21可以调节RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif) 基因表达水平, 从而证实了RECK是mi R-21调控的靶基因;部分mi RNA或许成为胃癌的抑癌基因或癌基因的可能性也不断得到系列研究结果的支持[11,12,13,14,15,16]。本研究逆转录实时荧光定量PCR结果显示, mi R-181c在胃癌组织中的表达高于其癌旁正常组织, 提示mi R-181c在胃癌的发生中可能发挥重要的作用, 而已有的研究显示mi R-181c与ABI-1表达相关。

作为接合蛋白ABI-1参与肌动蛋白重建, 在细胞的多种生物学行为中发挥重要的作用[17]。通过形成多种不同的大分子复合物, ABI-1调控着多种与肿瘤细胞增殖、凋亡、黏附和迁移等相关的信号传导通路[18,19,20,21,22,23]。研究[1]显示ABI-1在胃癌组织中表达明显下调, ABI-1表达与胃癌分化程度、临床分期显著负相关, 而且ABI-1表达减少或缺如与胃癌患者生存时间缩短显著相关, 均提示ABI-1可能作为胃癌的抑癌基因, 在胃癌的发生发展中发挥重要的作用。目前认为, 在肿瘤细胞中mi RNA成熟体或前体表达水平异常, 而表达异常的mi RNA通过影响靶m RNA翻译发挥作用, 参与肿瘤的形成过程并起重要作用, 如Ras原癌基因受let-7家族的调控[24], BCL2抗凋亡基因受mi R-15a-mi R-16-1簇调控[25], E2F1转录因子受mi R-17-92簇调控[26], BCL6抗凋亡基因受mi R-127的调控[27]等。mi RNA通过抑制其靶基因的表达从而发挥作用, 是否mi RNA也调控ABI-1的靶m RNA基因, 进而影响胃癌组织中ABI-1蛋白的表达目前尚不清楚。为此, 本研究通过比较胃癌与其配对癌旁正常组织中3种ABI-1相关mi RNA表达谱的差异, 筛选了与胃癌特异的mi RNA的表达谱, 即mi R-181c在胃癌组织中高表达。而ABI-1蛋白在胃癌组织中低表达, 从而推测mi R-181c可能参与了靶向调节ABI-1蛋白的表达, 为进一步研究mi R-181c在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

靶向作用 篇8

关键词：肺腺癌,RACK1基因,裸鼠

RACK1 (receptor for activated protein kinase C-1) 是RACKs家族中第一个被识别的成员, 该蛋白结合能力广泛, 功能多样, 在细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭等过程中发挥重要的作用。文献[1]报道, RACK1在肿瘤组织中表达升高。有研究表明RACK1与口腔鳞癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展密切相关, 并且与肿瘤的病理分期、淋巴结转移、预后和治疗效果也有关[2,3,4,5,6,7,8,9]。

课题组前期研究发现RACK1基因促进了肺腺癌的发生发展, 并且通过体外试验证明沉默RACK1蛋白在肺腺癌细胞株A549内的表达可以抑制肿瘤细胞的生长, 并且提高了A549细胞对顺铂和紫杉醇两种化疗药物的敏感性[10,11]。本研究将在前期工作的基础之上观察RACK1对肺腺癌动物模型肿瘤生长的影响, 以期为以RACK1为靶点的肺腺癌基因治疗提供理论和实验依据, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

A549细胞株由山西医科大学生化实验室馈赠, 胎牛血清购自杭州四季青公司, 0.25%胰酶购自美国Sigma公司, sh RNA表达载体试剂盒购自上海生工生物工程技术公司, Lipfectamine2000购自美国invitrogen公司。

1.2 质粒制备

据sh RNA设计原则, 设计并合成RACK1基因干扰寡核苷酸序列, 正义序列:5’-CACCGAGATAAGACCATCATCATGTT TCAAGA GAACATGATGATGGTCTTATCTCTTTTTTG-3’反义序列:5’-AGCTCAAAAAAGAGAT AAGACCATCAT CATGTTCTCTTGAAACATGATGATGGTCTTATCTC-3’sh RNA DNA:GAGATAAGACCA TCATCATGTTTCAA GAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTT sh RNA结构:

1.3 人肺腺癌裸鼠移植瘤模型的建立

雄性BALB/C裸小鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 合格证号SCXK (湘) 2011-0003], 4周龄左右, 体重18~22 g。实验前于山西医科大学动物实验中心SPF级饲养1周, 观察裸小鼠的生长情况。人肺腺癌细胞株A549用含有10%胎牛血清的F12K培养液在37℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至对数生长期, 用0.25%胰酶消化, 用PBS制成细胞悬液, 调整细胞密度至1×107/m L。于裸鼠背侧近后肢处皮下碘消毒并且皮下注射细胞悬液0.2 m L, 注射后裸鼠继续饲养于SPF级环境中, 待裸鼠肿瘤长径为0.3~0.5 cm时, 将荷瘤裸鼠随机分为3组, 分别为RACK1-sh RNA (实验组) 、Vector-sh RNA (空载质粒组) 和Control (空白对照组) , 每组6只。实验组裸鼠瘤体内多点注射sh RNA质粒-脂质体复合物 (20μg质粒+30μL脂质体+50μL无血清F12K培养基) , 严格按照脂质体2000的转染说明进行操作;空载质粒组裸鼠瘤体内多点注射空载质粒-脂质体复合物, 空白对照组裸鼠瘤体内多点注射生理盐水, 空载质粒组和空白对照组剂量同实验组。隔日注射一次, 连续注射6次。记录肿瘤生长大小, 于28 d时处死, 剥离肿瘤, 提取肿瘤组织的总蛋白, 测定蛋白浓度, SDS-PAGE电泳, 并进行Western blot, 使用Bandscan分析软件分析。

1.4 移植瘤生长状况的观察

每天观察裸鼠精神、活动及大便情况, 注射第7、14、2l、28天测量裸鼠体重和移植瘤的最长直径 (a) 和最短直径 (b) , 按公式V (mm3) =πab2/6计算移植瘤体积, 抑瘤率= (1-实验组肿瘤体积/空白组肿瘤体积) ×100%。停药24 h终止观察, 处死裸鼠, 剥取瘤组织, 测量体积并称重。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 多样本均数间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD方法, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染RACK1-sh RNA对裸鼠移植瘤生长的影响

皮下注射细胞后3~5 d, 空载质粒组和空白对照组裸鼠可在注射部位发现约小米粒大小的肺腺癌移植瘤形成, 镜下观察可见移植瘤为肺腺癌组织, 而实验组裸鼠移植瘤出现时间有所延迟。移植瘤形成后第28天, 空载质粒组和空白对照组移植瘤体积生长至绿豆般大小, 而实验组裸鼠移植瘤体积相对较小, 见图1、2。绘制生长曲线显示, 实验组移植瘤体积增大速度明显慢于空载质粒组和空白对照组, 而空载质粒组和空白对照组移植瘤体积增长速度基本无差别, 见图3。于移植瘤模型建立后28 d处死裸鼠, 对肺腺癌移植瘤进行取材并测量其体积和重量。结果显示空载质粒组和空白对照组移植瘤体积和重量明显大于实验组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。空载质粒组和空白对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1和图4。

2.2 Western blot法检测肿瘤组织内RACK1蛋白的表达

Western blot结果显示, 实验组、空载质粒组和空白对照组中RACK1相对表达量分别为 (0.21±0.11) 、 (0.76±0.08) 及 (0.83±0.05) 。与空载质粒组和空白对照组相比, 实验组RACK1蛋白的表达量显著降低, 差异均有统计学意义 (F=97.53, P<0.05) , 空载质粒组和空白对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。sh RNA表达载体转染后可下调RACK1蛋白在肺腺癌中的表达, 见图5。

*与空白对照组和空载质粒组比较, P<0.05

*与空白对照组、空载质粒组相比, P<0.05

注:A为空白对照组, B为空载质粒组, C为实验组

3 讨论

肺癌在我国是比较常见的恶性肿瘤, 发病率和病死率呈上升趋势, 而其生物学行为尚未完全清楚[12]。深入研究肺癌侵袭转移的机制, 积极探索有效的预防和治疗措施, 是当前肺癌研究中的重点和难点, 随着分子靶向药物的应用, 明显改善了患者的临床疗效。

阮元元等[13]对肝癌的临床研究表明, RACK1在肝癌细胞系中发挥了化疗抵抗的功能。沈芳荣等[14]通过下调RACK1表达证实在体内外实验中前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力均下调。Hu等[7]证实了RACK1促进了食管鳞癌细胞的生长与转移。杨丹丹等[8]研究表明RACK1对于宫颈癌的发生发展是一个促发因素。

在本实验中笔者建立了裸鼠皮下移植瘤模型, 采用脂质体转染方法抑制肺腺癌细胞A549中RACK1基因的表达, 蛋白印迹定量分析结果显示:转染干扰载体RACK1-sh RNA的肺腺癌移植瘤RACK1蛋白表达明显受到抑制。通过绘制并对比生长曲线显示转染干扰载体RACK1-sh RNA后21、28 d移植瘤生长明显减慢, 提示RACK1基因沉默可以减缓肺腺癌细胞A549的体内成瘤过程, 于28 d处死裸鼠, 称量移植瘤体积与重量, 显示实验组裸鼠移植瘤体积和重量明显低于空载质粒组和空白对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , RACK1-sh RNA组抑瘤率达39%。

*与空白对照组、空载质粒组相比, P<0.05

靶向作用 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

Tca8113细胞株(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室),Psilencer 2.1-U6-neo真核表达载体(美国Ambion公司),脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司),质粒小剂量提取试剂盒(美国Omega公司),大肠杆菌DH5α(武汉晶赛生物公司),G418试剂(美国Gbico公司),人VEGF-ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司),限制性内切酶、T4 DNA连接酶(美国NEB公司),HRP标记兔抗人的IgG抗体(美国Gbico公司),鼠抗人VEGF的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 血管内皮细胞生长因子基因特异的siRNA表达载体构建

根据基因数据库已知VEGF mRNA序列,参考siRNA的设计有关文献[3],设计针对VEGF基因不同剪切子的公共靶点,根据所选靶点人工合成VEGF基因RNAi靶序列(5′-GATAGAGCAAGACAAGAAA-3′)及其互补的反义链。以及一条实验对照序列(即无关序列HK:5′-GACTTCATAAGGCG-CATGC-3')及其互补的反义链。靶序列和实验对照序列各自的互补两条寡核苷酸片段经退火连接形成双链DNA模板链。用Bam HI+HindⅢ对质粒Psilencer 2.1-U6-neo进行双酶切。T4 DNA连接酶将线性化Psilencer 2.1-U6-neo和模板链连接成重组载体,靶序列与实验对照序列重组载体分别命名为Pu-VEGF-siRNA载体和Pu-HK载体。

1.2.2 重组载体的酶切和测序

重组的Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK载体转化感受态DH5α细菌,50μg/mL的Ampr抗性LB培养皿筛选阳性克隆,质粒提取试剂盒按说明提取重组载体。SalⅠ酶切重组载体,测序鉴定。

1.2.3 重组载体的转染

10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养Tca8113细胞,于37℃、5%CO2孵箱中培养至对数生长期。以每孔1×106/mL细胞接种24孔培养板并培养过夜。按说明书使用Lipofectamine 2000将含有重组Pu-VEGF-siR-NA和Pu-HK载体分别转染Tca8113细胞。实验分为三组,转染Pu-VEGF-siRNA为实验组,转染Pu–HK载体组作实验对照组,未转染组作空白对照组。实验组和实验对照组G418筛选1周后得到稳定转染细胞克隆。

1.2.4 免疫组织化学染色分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达

常规SABC法检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达,各组随机选取100个Tca8113染色细胞,使用MIAS-2000医用彩色病理图像免疫组化测量系统对其灰度值进行测定。

1.2.5 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorben-tassay,ELISA)测定Tca8113细胞上清液的血管内皮细胞生长因子蛋白表达

按照ELISA试剂盒操作说明进行操作,收集各组Tca8113细胞培养上清液,使用OD值作纵坐标,标准品浓度作横坐标,进行标准曲线绘制。根据Tca8113细胞上清OD值在标准曲线中可以查出对应浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差表示,多组间的比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组载体酶切鉴定

质粒Psilence 2.1-U6-neo基因序列里没有SalⅠ酶切位点,本研究插入的序列里设计有SalⅠ酶切位点,Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK质粒均能被SalⅠ酶切,即均为插入正确的质粒(图1)。

2.2 重组载体基因测序

经酶切鉴定的重组质粒送往上海生工公司进行DNA全长测序。所得结果如图2～3。经Blaster对比,测序结果与GenBank的VEGF基因序列完全一致,证实重组载体构建成功。

2.3 免疫组织化学染色SABC法分析Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子蛋白表达

结果如图4～6所示,实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较,细胞着色颗粒明显减少,而且着色变浅。对照组灰度值比实验组的明显降低(P<0.05)。实验对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 酶联免疫吸附法测定Tca8113细胞上清液血管内皮细胞生长因子蛋白表达

实验组细胞与实验对照组及空白对照组比较,VEGF蛋白浓度有所降低(P<0.05)。以实验对照组VEGF相对水平作参照,实验组浓度下降34.64%。与空白对照组比较,蛋白质量浓度相似,差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

3 讨论

RNAi(RNA interference)是指由小分子双链RNA诱发的基因沉默现象,其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时,相应mRNA发生降解而导致基因表达沉默,它具有高稳定性、靶向性和高效率性等特点[4],目前已经成为筛选新基因、基因功能研究、基因疾病治疗和寻找药物靶点的重要工具[5,6,7]。

本实验以人VEGF基因作为RNAi的靶基因,目的通过VEGF siRNA靶向阻断或抑制VEGF的表达,达到阻断或抑制VEGF促舌癌血管形成,进而抑制舌癌细胞增殖和转移的目的。VEGF mRNA的剪切方式的不同可产生5种不同形式蛋白分子:VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。不同的VEGF分子协同作用促进肿瘤血管形成[8]。本实验利用基因重组技术,根据基因数据库已知VEGF mRNA序列,参考siRNA的设计有关文献,设计针对VEGF mRNA公共序列的靶点,体外构建Pu-VEGF-siRNA重组载体,然后利用转染技术将其转染Tca8113细胞并使其在细胞中稳定表达。常规SABC法和ELISA检测Tca8113细胞VEGF的蛋白表达结果表明:转染Pu-VEGF-siRNA重组载体后,实验组Tca8113细胞的VEGF蛋白表达较空白对照组和实验对照组有所减弱,而且空白对照组和实验对照组的VEGF蛋白表达无明显差异;说明所构建的真核表达载体Pu-VEGF-siRNA对人舌癌细胞株Tca8113中VEGF有较强的特异性抑制效果。这与其他学者[8]构建针对VEGFmRNA公共序列靶点,体外构建重组载体,转染相应癌细胞后有效抑制VEGF表达结果一致。

笔者通过构建Pu-VEGF-siRNA重组载体并体外转染舌癌Tca8113细胞,实验结果表明能够特异和有效地抑制癌细胞VEGF的表达。这为应用RNA干扰技术对舌癌进行基因治疗提供了实验基础和理论依据,为舌癌的治疗选择开辟了新的途径。

摘要：目的 构建靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用。方法 设计合成靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与Psilencer2.1-U6-neo连接,构建VEGF-siRNA表达载体(Pu-VEGF-siRNA),酶切鉴定和测序确认后,经脂质体Lipofectamine2000转染入Tca8113细胞,以空载体组为实验对照组(Pu-HK),未转染组为空白对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)和免疫组化方法检测染后Tca8113细胞VEGF蛋白表达差异。结果 经过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了靶向Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体。与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA后Tca8113细胞的VEGF蛋白表达明显下降(P<0.05),但两对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 成功构建了靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Tca8113细胞VEGF蛋白的表达。

关键词：血管内皮细胞生长因子,RNA干扰,舌癌

参考文献

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[2]Chen J,Wen YM,Li LJ,et al.Expression of vascular endothelial growthfactor in oral squamous cell carcinoma[J].West China J Stomatol,2001,19(5):303-305,308.

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[5]Davis ME,Zuckerman JE,Choi CH,et al.Evidence of RNAi in humansfrom systemically administered siRNA via targeted nanoparticles[J].Nature,2010,464(7291):1067-1070.

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[7]Brosnan CA,Voinnet O.Cell-to-cell and long-distance siRNA move-ment in plants:Mechanisms and biological implications[J].Curr OpinPlant Biol,2011,14(5):580-587.

靶向作用 篇10

1材料与方法

1.1 细胞株

转染shLivin的SiHa细胞(SiHa-shLivin)和转染阴性对照质粒的细胞株(SiHa-shVector)由本室构建,宫颈癌细胞SiHa由本室保存。

1.2 主要试剂

DMEM培养液及小牛血清购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Ameresco公司;别藻青蛋白/碘化丙啶(AnnexinV-APC/PI)细胞凋亡试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司;顺铂购自山东齐鲁制药厂,紫杉醇购自美国百时美施贵宝公司,多柔比星购自意大利法玛西亚公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

宫颈癌SiHa细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养传代,倒置显微镜下观察细胞生长状况。稳转Livin shRNA的SiHa细胞及阴性对照质粒细胞株shVector的培养条件同前,每隔两代培养液中加入终浓度为500 mg/L的遗传霉素G418进行抗性筛选。

1.3.2 MTT法检测细胞对不同化疗药物的敏感性

实验分3组: 空白对照组(SiHa组)、SiHa-shLivin组和转染空载体的SiHa-shVector组。取对数生长期细胞传代接种于96孔培养板(8000个细胞/孔),培养24小时后,加入不同浓度的各种化疗药物继续孵育(顺铂的浓度为0、3、6、9、12、15、18、24、30、36 mg/L,紫杉醇的浓度为0、3、6、9、12、15、18、30、45、60 mg/L,多柔比星的浓度为0、2、4、8、12、16、20、24、28、32 mg/L),每浓度设3个复孔。24小时后,用MTT比色分析法在酶标仪上测定各孔在490 nm的吸光度(A)值,检测各组细胞存活率。实验重复3次,细胞存活率(%) = 实验组A值/对照组A值×100%。以药物浓度为横轴、存活率为纵轴,绘制浓度效应曲线,再用SPSS统计软件包的概率单位法(PROBIT)确定半数抑制浓度(IC50)。

1.3.3 流式细胞术Annexin V/APC

双标检测细胞凋亡 取对数生长期细胞传代接种于6孔培养板,每孔4～8×105个细胞,培养24小时后,加入shLivin IC50药物培养各组细胞24小时,设3个复孔。将结合缓冲液(Binding buffer)用蒸馏水稀释成工作浓度。常规消化各组细胞,调整密度为 5×105～1×106个/ml,2000rpm,离心5分钟。弃上清,冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次,Binding buffer重悬细胞,加入 5 μl Annexin V-APC,混匀,室温避光孵育10分钟。加入10 μl碘化丙啶(PI)溶液,避光5分钟后加入300 μl Binding buffer,混匀后上机。Cell Quest 软件分析。本实验重复3次。

1.4 统计学处理

计量资料结果用undefined表示。用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析,两组数据使用成组t检验,两组以上数据采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MTT法检测化疗药物对3组细胞存活率的影响

SiHa-shLivin组对顺铂、紫杉醇、多柔比星的IC50值明显低于SiHa 组和SiHa-shVector组,差异有高度统计学意义(P<0.001),SiHa组与SiHa-shVector组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。

①与SiHa组比较,P>0.05;②与SiHa-shVector 组和SiHa组比较,P<0.001

2.2 流式细胞术检测shLivin IC50药物对3组细胞凋亡率的变化情况

SiHa-shLivin组对顺铂、紫杉醇和多柔比星的早期凋亡率明显高于SiHa 组和SiHa-shVector组,差异有高度统计学意义(P<0.001),SiHa组与SiHa-shVector组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

①与SiHa组比较,P>0.05;②与SiHa组和SiHa-shVector组比较,P<0.001

3讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率呈增高趋势,发病年龄趋于年轻化,加之肿瘤细胞耐药性的存在,其治疗效果仍有待进一步提高[1]。肿瘤细胞的特点就是抵抗凋亡从而无限增殖,对人体造成伤害,因此抑制抗凋亡基因的表达,从而促进肿瘤细胞凋亡为肿瘤治疗的思路之一[2]。Livin 是最近发现的IAP家族的新成员,其在成人正常组织中表达极少或不表达,而在多种恶性肿瘤细胞组织中表达,其N端的BIR结构域为高度保守的长约70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列,能结合凋亡蛋白酶[3]从而抑制细胞凋亡。有研究表明在黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌等[4,5,6]患者中化疗药物的耐药性与Livin相关,如果凋亡抑制蛋白能够被抑制将可提高化疗的疗效。Vucic等[6]的研究证实,Livin基因高表达时黑色素瘤细胞对化疗不敏感,从而影响化疗药物的致细胞凋亡作用,达不到治疗的目的。

RNA干扰技术用于沉默Livin基因的表达是肿瘤基因治疗的新手段,其前景在于特异性高并能增加肿瘤细胞对凋亡的易感性。Crnkovic-Mertens等[7,8]发现,通过RNA干扰技术沉默Livin基因的表达并加以不同的凋亡促进剂如多柔比星、紫外线及肿瘤坏死因子TNF治疗后,发现细胞的凋亡率明显提高。Wang等[9]用小干扰RNA抑制Livin,可以降低两种不同的遗传稳定的肿瘤细胞系LoVo和SPCA-1的细胞增殖和肿瘤形成,增加凋亡和对化疗药物的敏感性。上述研究均表明,抑制Livin基因的表达对凋亡刺激有增敏作用,可作为新的方法来治疗恶性肿瘤。

本课题组已经应用构建成功的shLivin,转染宫颈癌HeLa细胞,在mRNA和蛋白水平上抑制了Livin基因的表达,并随时间延长,顺铂浓度增加,细胞凋亡率增加[10]。本实验中我们用已经构建好的shLivin,转染宫颈癌SiHa细胞,并选用了3种目前临床上抗恶性肿瘤的一线药物顺铂、紫杉醇、多柔比星作为化疗药物,结果发现shLivin重组质粒稳定转染SiHa细胞24小时后3种药物的IC50值明显下降,SiHa-shLivin组对3种药物的IC50值明显低于SiHa 组和SiHa-shVector组(P<0.001),用shLivin IC50药物测得各组细胞的凋亡率,SiHa-shLivin组凋亡率明显高于SiHa-shVector组和SiHa组(P<0.001)。以上结果均提示Livin沉默对化疗药物有增敏作用。

因此,本研究证实了Livin基因作为宫颈癌化疗增敏的分子靶点是可行的,为宫颈癌的基因治疗奠定了基础,具有潜在的临床应用前景,当然细胞凋亡的调节机制非常复杂,还有很多机制需要我们作进一步的研究。

参考文献

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[8]Crnkovic-Mertens I,Semzow J,Hoppe-Seyler F,et al.Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells[J].J Mol Med,2006,84(3):232-240.

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