高效苯酚降解菌研究

高效苯酚降解菌研究（精选五篇）

高效苯酚降解菌研究 篇1

苯酚及其衍生物属于芳香族化合物,是一种原生质毒物,与多数生物活性体接触可产生毒性[1]。随着现代工农业的快速发展,化工、焦化、炼油、合成纤维、医药等工厂排出的废水、废气、废渣中大多含有高浓度的酚类有机污染物,若处理不当不仅会导致生态环境的污染,也会对人体产生危害。当人体摄入过量的酚类物质时,体内蛋白质会变性,产生急性中毒症状,使人体中枢神经系统受损,导致死亡。鉴于苯酚对环境和人类造成的危害,各国相继将苯酚列入优先控制污染物的名单中。为有效降解含酚废水,国内外学者对废水中苯酚及其衍生物的降解进行了深入研究。目前处理含酚废水的主要技术有:物理-化学法、生物法、化学法、物理法。物理法和化学法适用于高浓度的含酚废水,但有设备投资高,能耗大,容易产生二次污染等缺陷[2],且物理处理技术和化学处理技术对废水的处理工艺要求较为严格;而生物降解法具有耗能较少、效率高、成本低、无二次污染等特点,将在污水治理上得到更广泛的应用[3]。

1降酚菌的降解机理

降酚菌对酚类物质的降解主要分为好氧降解和厌氧降解2种,多数情况下采用前者,且降酚菌好氧代谢途径较为复杂,如图1所示。降酚菌在好氧代谢过程中,苯酚及其衍生物在苯酚羟化酶的作用下被催化成相应的邻苯二酚,之后邻苯二酚在2种不同的途径和酶系统的作用下开环形成碳氢化合物[4]。由邻苯二酚2,3-双加氧酶的催化作用下间位开环转化为2-羟基粘糠半醛,经逐步转化后形成4-羟基-α-酮基戊酸,最终生成乙酸和丙酮酸等产物后进入三羧酸循环,进行糖代谢途径,最终被降酚菌分解;由邻苯二酚1、2-双加氧酶的催化作用下邻位开环转化为粘糠酸,沿β-酮基己二酸的途径降解,最终生成乙酰辅酶A、琥珀酸等产物进入微生物的三羧酸循环,继续被降酚菌利用[5]。此2种途径是微生物好氧降解苯酚的关键步骤,且在不同的降酚菌中这类双加氧酶具有高度的同源性。

研究表明,降酚菌在厌氧代谢过程中也能降解苯酚。如,Lack等[6]研究发现苯酚在厌氧代谢中是苯酚直接被羧化为4-羧基苯甲酸,使其转化为苯甲酰辅酶A,然后形成乙酸等小分子化合物,从而达到降解的目的,该途径被称作是Kolbe-Schmitt羧化反应。

2降酚菌的培育和改良

酚类物质虽然是一种中强度的原生质毒物,但很多微生物为适应环境中的酚类物质,将酚类物质作为其生长、发育的碳源之一[7,8]。因此,被酚类物质污染的土壤和水源中含有较多的此类降酚特性的菌株,为获得纯种的降酚菌株进行研究和生产,需要将降酚特性菌株从酚类污染地分离,再进行具有针对性的培养、改良和育种,最后人为地投入污染地区进行微生物修复。

2.1降酚菌的培养

降酚菌的传统培养方法主要是采用富集培养技术,此技术分为初代培养和次代培养2个阶段。将采集的标本置于富集培养基上进行初代培养,之后分离获得单一菌落;单一菌落投加到以苯酚为唯一碳源的培养基中进行次代培养,以逐量分批的方法提高培养基中苯酚的浓度,从而筛选出耐高浓度苯酚的高效降酚菌株。例如:郑贝贝[9]等利用富集培养技术从某焦化厂的焦化废水中筛选出的C3菌株为红球菌属(Rhodococcus sp.)细菌,该菌株可在28h内将浓度为600mg/L的苯酚完全降解,对浓度高达1000mg/L的苯酚同样具有高效的降解能力。

由于培养条件和培养基成分不同等原因,该方法具有一定的局限性。为了克服此局限性,高通量筛选技术、基因拼接技术等新的培养方法逐渐被运用到菌株的筛选和培养中。基因拼接技术又称为基因工程,该技术可通过对生物的基因进行重新组合和改造,产生符合人类需求的基因产物[10]。而高通量筛选技术则是以分子水平和细胞水平为基础,通过一次实验获得大量的信息,进而筛选出有价值的信息。同传统方法相比,新技术在分离培养菌株时不但灵敏快速、科学准确,而且较大限度的节省了实验材料,减小了培育菌株的操作误差,简化了实验流程。

2.2降酚菌的鉴定方法

降酚菌株传统的鉴定方法主要是根据对菌种形态的观察、生理生化等表型特征来对菌种进行鉴定,其主要包括菌株形状、颜色、革兰氏染色结果,以及葡萄糖产酸实验、兼性厌氧实验、V.P实验、淀粉水解试验、甲基红实验等。根据菌株的鉴定结果,参考《常见细菌系统鉴定手册》[11]或《伯杰氏手册》进行比较和判断,从而实现对菌株的初步鉴定。但常规的鉴定方法具有步骤繁琐,耗时较长,准确性较低等缺点。张孝龙等[12]利用苯酚培养基对降酚菌分离和筛选,根据电子显微镜观察到的菌体形态、菌株生理生化特征和16Sr RNA基因鉴定,对菌株进行初步生物学鉴定。经鉴定筛选出的菌株中Phe-03为壤霉菌属(Agromyces),Phe-05为棒杆菌属(Corynebacterium)。

近些年来,随着生物技术的精细化与现代分子生物学理论和技术的普及化,BIOLOG法、操作分类单元聚类分析、16Sr DNA鉴定、全细胞脂肪酸分析鉴定系统和PLFA法等新的鉴定手段逐渐运用到降酚菌的菌种鉴定中。与传统方法相比,新的鉴定方法具有灵敏度高,分辨力强、速度快、无需分离培养纯种微生物、测定便捷等优点,一定程度的提高了鉴定效率。

2.3降酚菌的改良

传统改良降酚菌的方法包括以紫外线、微波、激光等射线作为诱变介质的物理诱变和以烷化剂、抗生素等化学药物作为诱变介质的化学诱变。菌株经过诱变介质诱变后,降酚能力有较大幅度的提高。例如:冯思琦[13]等,从土壤中筛选出一株可降解高浓度苯酚的酵母菌菌株。对该菌株直接采用紫外诱变技术进行驯化和培育,结果表明:未经诱变的菌株在48h内对苯酚浓度为500mg/L的溶液降解率为96.3%,而经过紫外诱变后,36h内可将500mg/L苯酚完全降解。

针对降解酚类有机污染物,可将苯酚作为底物培养降酚菌,使培养基中的苯酚浓度以逐量分批的方法进行提高,以此方法驯化的菌株降酚能力会有明显的提升。例如:关海滨[14]等将扩大培养的菌株首先接入苯酚浓度为0.5g/L的培养基中培养,重复上述培养步骤,使培养基中的苯酚浓度逐步达到2.2g/L,成功得到一株具有较高降酚能力的菌株GDYW-0027。实验表明,该菌株在48h内对初始浓度为2.2g/L苯酚的降解率为86.73%。

虽然驯化可以提高降酚菌的降解能力,但由于苯酚浓度不断的提高,菌株降解苯酚的速率却逐渐降低。例如:菌株GDYW-0027[15]对0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L和2.2g/L质量浓度的苯酚溶液48h内的降解率分别为100%、96.98%、95.68%、92.61%和86.73%,苯酚降解率明显降低。

2.4降酚菌的降解特性

利用降酚菌株处理高浓度含酚废水时,混合菌株降解苯酚的能力要明显大于单一菌株的降解能力,并且在苯酚浓度较高时仍具有较高的降解率。例如:李鲜珠[16]等从焦化厂污泥中分离出4株高效降酚菌。通过单一菌株和组合菌株对苯酚降解率的试验表明,在16h内4株混合菌株的苯酚降解率均高于单一菌株,混合菌株在降解苯酚时具有协同作用。沈锡辉[17]等分离到一株既可降解苯酚,又可降解萘及其它多种芳烃的红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.Strain PNAN5),该菌株能以苯酚、对甲酚、萘和苯甲酸为唯一碳源生长,具有降解单环和双环芳烃的能力。该实验表明,以苯酚为唯一碳源培育出的降酚菌除了可以降解苯酚外,还可降解其它酚类物质及其衍生物。

3生物法处理污水现状

目前,随着国内化工行业一体化进程不断加快,工业园区污水处理设施逐渐完善,一些大型化工园区污水处理设备和技术已达到国际水平。淄博市的建陶企业采用投加菌株的方法处理建陶企业的含酚废水[21],针对企业废水的复杂程度,投加了28种不同的菌株,实验表明,6h内酚的去除率为89.1%,实现了回用水标准及国家城镇污水处理厂一级排放标准。Peyton等[22]以苯酚为模型化合物,利用耐盐微生物对高盐度的工业废水进行处理,并进行高盐(10%)对苯酚的生物降解动力学的探讨。实验表明,对苯酚的生物降解动力学为苯酚浓度(0-50mg/L)的零级动力学。

与传统的物化处理技术相比,新技术在废水的处理工艺上因其鲜明的特点而逐渐被应用于某些企业的废水处理中。在处理过程中由于针对性较强、效率高等优势,亦是将来废水治理的发展趋势。

4问题及展望

含酚废水毒性高、来源广,严重威胁着人类的健康安全,是环境保护中不可忽视的问题。因此,筛选出对酚类物质具有高降解能力的微生物,对于含酚废水的生物修复具有深远的意义。从被污染环境中获得高效降酚菌后,研究其降解特性后,应用到含酚废水处理系统中,是现今处理含酚废水较为经济有效的途径之一。但大多数降酚菌株能够降解的酚浓度较低。而且,废水是一个十分复杂的混合体系,用单一菌种处理含酚废水,很难达到国家排放标准。因此,对于高浓度的含酚废水在生物学方面的研究,有待进一步的探索。

随着科学技术的快速发展,现代化技术手段逐渐被运用到高效菌株的培育中,如利用细胞融合技术处理菌株、生化技术培养菌株等。而且,利用细胞融合和基因重组等技术选育高效降解菌也已成为发展的趋势。高效菌株的研究和应用技术已得到蓬勃发展,可以预想,降酚菌株用于处理工业废水必将在实际应用中发挥出巨大的作用。

摘要：本文主要从苯酚的生物降解机理,高效苯酚降解菌的分离、筛选、鉴定、分类、菌种改良及降酚菌的降解特性等方面阐述了苯酚降解菌降解含酚废水的研究进展,并将降酚菌株的传统培养技术与新培养技术进行比较,总结培养技术的优点与不足;对生物法降解苯酚处理含酚废水的应用前景进行了展望。

高效苯酚降解菌研究 篇2

苯酚高效降解菌固定化小球的制备及其降解条件研究

摘要：对采自某印刷厂的.污泥进行驯化、富集、筛选,得到一株以苯酚为唯一碳源生长的高效苯酚降解菌,并以海藻酸钠为载体对该苯酚高效降解菌进行固定化包埋,并通过正交试验确定了制备固定化小球的最佳条件,研究表明,固定化的该高效苯酚降解菌在对苯酚的降解率与对苯酚的耐受程度均高于游离细胞,经30 h,1 200 mg/L的苯酚可以完全降解,固定化降解苯酚的最适温度范围30～35 ℃,最适pH范围为7～9,最适摇床转数为120～150 r/min.作 者：张黎    魏炜    冯思琦    ZHANG Li    WEI Wei    FENG Si-qi  作者单位：沈阳建筑大学,辽宁,沈阳,110168 期 刊：辽宁化工   Journal：LIAONING CHEMICAL INDUSTRY 年，卷(期)：2010, 39(2) 分类号：X703 关键词：苯酚    固定化    苯酚降解菌    海藻酸钠   

高效苯酚降解菌的筛选及其降酚性能 篇3

1.1实验材料

菌源:某钢铁集团公司焦化厂废水处理池的活性污泥。

唯一碳源培养基:KH2PO40.5g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,CaCl20.1g/L,NaCl0.2g/L,MnSO4·H2O微量,FeCl2微量,NH4NO31.0g/

琼脂平板培养基:牛肉膏5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,氯化钠5.0g/L,琼脂15.0~20.0g/L,苯酚1.0g/L。

斜面培养基:酵母膏5.0g/L,蛋白胨5.0g/L,氯化钠5.0g/L,琼脂15.0~20.0g/L,pH 7.07.2。

仪器设备:721可见分光光度计,Xy-X3恒温摇瓶机,电热恒温培养箱。

1.2实验方法

1.2.1苯酚含量的测定

采用4-氨基安替比林分光光度法(GB 7490-87)测定。

1.2.2降酚菌的筛选及驯化

取活性污泥1.0g接种于酚浓度为500mg/L的唯一碳源培养基50mL中,在30℃、180r/min的条件下振荡培养24h。取该培养液5.0mL接种于酚浓度为1 000mg/L的唯一碳源培养基50mL中,在相同条件下培养。依次类推,分别接种到酚浓度为1 500mg/L、2 000mg/L的培养基中振荡培养,共驯化4个周期。

分别测定培养后的上述4种菌液的苯酚含量,选取苯酚已降解完的浓度为1 000mg/L的培养液在琼脂平板上划线分离,30℃恒温培养48h后挑取单一菌落接种于斜面培养基,培养48h后在4℃冰箱保存备用。

1.2.3紫外诱变选育高效降酚菌

取上述筛选出的菌株,用生理盐水配制成菌悬液4.0mL移入无菌空培养皿中,放一无菌磁力搅拌子后置磁力搅拌器上,30W紫外灯下30cm处照射,时间分别为1,2,3,4min,所有操作均在红灯下进行。

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL进行不同程度的稀释,取最后3个稀释度的稀释液涂于琼脂平板上,每个稀释度涂3个平板,每个平板加稀释液0.1mL,用无菌玻璃涂棒涂匀,用黑布包好,30℃恒温培养4h。挑取单菌落再分别接种到苯酚琼脂平板上30℃培养48h后转接至斜面培养基,培养好后置于4℃冰箱保存

1.2.4高效降酚菌株的筛选

将上述保存的菌株无菌操作分别接种于苯酚浓度为500,1 000,1 500,2 000mg/L的唯一碳源培养基各50mL内,30℃、180r/min的条件下振荡培养,测定6,12,18,24,48h各培养瓶内酚含量。最后选取48h内能将2 000mg/L苯酚浓度基本降解完的菌株,命名为Y5菌株。

1.2.5高效降酚菌降解条件试验

分别测定接菌量、通气量、不同温度及pH值等培养条件对菌株降酚性能的影响。

1.2.6高效降酚菌COD测定

按《化学需氧量的测定重铬酸钾法》(GB 11914—1989)测定。

2结果与讨论

2.1高效降酚菌Y5在不同时间对不同浓度苯酚的降解

图1表示Y5菌株在不同时间对不同浓度苯酚降解。按2.0%的接入量将培养好的Y5菌液接入不同苯酚浓度的液体培养基中,30℃,180r/mim的条件下振荡培养,分别测定6,12,18,24,48h各培养瓶内酚含量。如图1所示,Y5菌株在12h时已能将500,1 000mg/L苯酚溶液中的苯酚完全降解,而此时1 500及2 000mg/L浓度的苯酚溶液降解率分别为22.79%和18.11%;随着苯酚浓度的升高及降解时间的延长,48h时1 500mg/L苯酚溶液降解率为100%,2 000mg/L苯酚溶液残余仅为47.7mg/L,降解率达97.61%。可见苯酚浓度的增大对该菌株生长有一定的抑制作用,从而使其降酚能力有所下降。该菌株比同类报道的菌株(600mg/L苯酚浓度90%降解耗时16h[5])的降酚能力要高很多。

2.2 温度对Y5菌株降酚性能的影响

温度主要影响微生物体内酶的活性,只有在特定酶促作用下,微生物才能完成生长过程所发生的化学反应[6]。而每种酶都有最适合的酶反应温度,因此温度的变化影响酶促反应速度,最终影响细胞物质合成[7]。温度对Y5菌株降酚性能的影响如图2所示,在25～35℃范围内Y5菌株降酚效果较好,其中30～35℃达高峰;小于25℃以及大于35℃时菌株降解率在逐渐下降,如20℃ 和40℃时Y5菌株降酚率最低,说明该菌株酶促反应温度应为25～35℃,低于或高于此温度范围其酶活将受到抑制。因而Y5菌株降酚最适温度范围为25～35℃。

2.3 pH对Y5菌株降酚性能的影响

环境的酸碱度影响着微生物的生理活动,每种酶都有其最适合的pH范围。将Y5菌株接入pH值分别为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的唯一碳源培养基中,30℃,180 r/min的条件下振荡培养后测定苯酚含量,结果如图3所示。图3表明Y5菌株在pH 7.0时降酚率最高达100%;pH小于7.0及大于7.0Y5菌株的降酚率都在下降,而在pH 4.0和pH10.0时降酚率分别为8.66%和6.01%,两者都小于10%。因此Y5菌株降解苯酚的最适pH值范围应为6.5～7.5。

2.4 不同接菌量对Y5菌株降酚率的影响

选取唯一碳源培养基各50 mL,分别加入湿菌体0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 g(实验所采取的湿菌体由培养后的菌悬液经5 000 r/min,10 min离心后得到),观察2～6 h之内不同湿菌体接菌量对降酚性能的影响。图4既为不同接菌量对Y5菌株降酚率的影响。从图4可以看出在2 h时0.1 g接菌量的降酚率较低为15.72%,0.5g接菌量的降酚率较高47.53%,已明显看出接菌量越大降酚率越高。随着时间的延长及接菌量的增加降酚率明显提高,6 h时0.4,0.5g接菌量降酚率都达到了100%。说明随着菌量的增加去除苯酚的有效菌也增多,使苯酚的去除效果大大增强。

2.5 不同通气量对Y5菌株降酚率的影响

由于Y5菌株为好氧菌,因此通气量的大小对其生长和降解能力都有一定影响。本试验采用在相同容积的三角瓶中装入不同量的培养液来达到不同通气量的目的。在250 mL三角锥瓶中分别装入唯一碳源培养基50,75,100,125 mL,30℃,180 r/min的条件下振荡培养后分别测定2～6 h培养液中苯酚含量。图5为Y5菌株在不同通气量下不同时间降酚率的变化。由图5可看出,随着装液量的增加也即通气量的下降苯酚降解率在下降,在6 h时装液量为50 mL的苯酚溶液降解率达100%,而装液量为125 mL的苯酚溶液降解率仅为58.13%,说明通气量的减少对菌株生长有不利影响。

2.6 高效降酚菌Y5对COD去除率的比较

COD是化学需氧量,是表示废水中有机物完全氧化所需的氧量[8],它反映了水中受还原性物质污染的程度。图6表示Y5菌株对不同浓度苯酚溶液的COD去除率的变化。从图中可以看出,同对照相比500 mg/L、1 000 mg/L 苯酚溶液COD去除率都达到100%,1 500,2 000 mg/L苯酚溶液COD去除率分别达95.52%和93.77%。另外也可看出随着苯酚降解率的提高COD去除率也在提高,说明由于苯酚含量的减少溶液中有机物含量也在减少,最终使COD含量下降。

3 结论

(1)经紫外诱变获得一株高效降酚菌株Y5,该菌为好氧菌,随着通气量的增大降酚率有明显的提高,且接菌量越大降酚率越高。

(2)该菌在48 h内可将2 000 mg/L浓度的苯酚溶液降解到浓度为47.70 mg/L,降解率达97.61%。

(3)对其降解苯酚的条件进行研究表明,该菌最适降酚温度25～35℃,最适降酚pH 6.5～7.5。

(4)该菌株可将不同浓度的苯酚溶液中的大部分COD去除,并且对浓度为2 000mg/L的苯酚溶液 COD去除率达93.77%。

摘要：由某钢铁集团公司焦化废水池的活性污泥中筛选驯化出降酚菌株,并经紫外诱变得到一株高效降酚菌Y5。结果表明,该菌48h可使浓度为2000mg/L的苯酚溶液降解到47.70mg/L,降解率达97.61%,同时COD去除率为93.77%。该菌株最适降酚条件为温度25～35℃,pH6.5～7.5,并且降酚率随接菌量及通气量的增加而明显提高。

关键词：苯酚,高效降酚菌株,降酚条件

参考文献

[1]李勇,付金祥,蔡苏兰.微生物降解法处理含酚废水的研究进展.辽宁城乡环境科技,2005;25(5):26—28

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[4]沈齐英,刘录,申林波.紫外诱变选育高效降酚微生物.环境科学与技术,2004;27(1):82—84

[5]杨光,向阳,夏雷.一株苯酚高效降解菌的分离及其分解能力的初步研究.氨基酸和生物资源,2003;25(4):3—6

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[7]吕荣湖,付强.高浓度酚降解菌的选育及其降酚性能.环境科学,2005;26(5):147—151

高效苯酚降解菌研究 篇4

一株高效菲降解菌的筛选及降解条件研究

从南京某石化厂排污口附近采集土样,以菲为碳源的选择性培养基分离筛选到一株菲高效降解菌F10a,根据形态和生理生化特性初步鉴定为芽孢杆菌属,并对其降解菲的特性及各种影响因素进行了研究.结果表明,F10a在50 mg・L-1的条件下,28 ℃振荡培养27 h,菲的`降解率达到98.12%;静置培养84 h,菲的降解率达到98.47%.pH值分别为4、6、8时,F10a对菲具有良好的降解效能;pH值为10时F10a不生长.Zn2+与Pb2+的存在不影响F10a的降解效能,Cu2+可以延缓菲的降解,Cr2+对F10a有毒性.F10a在菲浓度为200 mg・L-1时,28 ℃振荡培养84 h,降解率为99.6%.菲的降解程度与细菌数量的增长呈正相关关系.

作 者：周乐 盛下放 张士晋 刘静 ZHOU Le SHENG Xiafang ZHANG Shijin LIU Jing 作者单位：南京农业大学生命科学学院,农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,南京,210095刊 名：应用生态学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY年，卷(期)：16(12)分类号：Q93 X172关键词：降解 菲 多环芳烃 芽孢杆菌

高效苯酚降解菌研究 篇5

与化学、物理法相比,微生物法修复石油污染土壤具有成本低、效果好以及二次污染小等优点,被认为是最有前景的石油污染修复技术[[2,3]。目前,很多学者在石油降解菌的筛选及降解特性研究方面取得了诸多进展[4,5]。本研究以华中某油田石油污染土壤为菌种来源,通过富集、筛选出优势菌种并进行鉴定,探究其降解条件并对菌株在土壤中降解能力进行研究,研究结果可为石油污染土壤生物修复提供一定的指导意义。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验土样及原油

实验土样取自华中地区某油田倾倒石油点。采用梅花形布点法取距地表15 cm左右的土壤。土样去除植物残根和砾石后,过1.25 mm筛分,密封储存于塑料袋中。

石油样品的制备:取该油田开采的原油适量,经石油醚60~90℃沸程溶解,滤纸过滤后,用65℃水浴蒸出石油醚,并在65℃恒温干燥箱中干燥,每1 h称重一次直至其重量不发生变化为止,将其放入室温干燥器中备用。

1.1.2 培养基

无机盐培养基:NH4NO32 g,K2HPO41.5 g,KH2PO42.5 g,Mg SO4·7H2O 0.1 g,无水Ca Cl20.01 g,Na2EDTA·2H2O 0.02 g,蒸馏水1 000 m L,p H为7.3。

筛选培养基:无机盐培养基1 000 m L,石油0.7g。另加入20 g琼脂,121℃灭菌20 min可制成固体培养基。由于石油与水难以互溶,因此石油用石油醚溶解后,经0.22μm无菌滤器加至固体平板表面并使其均匀分散。

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,Na Cl 10 g,蒸馏水1 000 m L。

1.2 实验方法

1.2.1 石油降解菌的富集与筛选

取保存土样5 g,加到200 m L无机培养基的三角瓶中,在30℃,200 r/min的恒温摇床上振荡培养7 d。取上层悬浊液5 m L接入新鲜含油无机培养基中,在相同条件下振荡培养7 d,连续转接5次[6]。

驯化5个周期后,用涂布平板法,无菌操作,吸取0.2 m L富集培养液涂布于筛选固体培养基上,平板倒置于37℃恒温培养箱中培养72 h。挑取形态不同的单独菌落,在筛选培养基的平板上反复划线纯化,得到单一菌落,再将分离出的菌株接种至斜面培养基培养后,4℃保存备用。

1.2.2 石油含量与石油降解率测定

石油含量的测定采用紫外分光光度计法[7]。在灭菌后的含油培养基中接种石油降解菌,以未接种石油降解菌的含油培养基作为空白对照,然后同时放入30℃、200 r/min恒温摇床上培养,定时培养数天后,将溶液移至分液漏斗中,加入20 m L石油醚萃取,剧烈振荡5 min,静置3 min,溶液分层后,下层液滴入三角瓶中,上层液过滤至50 m L容量瓶内,重复萃取过程2次,定容后用UV759S分光光度计,λ=256 nm测定石油含量。石油降解率计算公式:

式(1)中,η为石油降解率,c0为处理前的石油含量,c1为处理后的残余石油含量。

1.2.3 菌种鉴定

经过筛选得到的高效石油降解菌,采用16S r D-NA分子生物学法进行鉴定到属。将纯化后的细菌总DNA适当稀释作为模板,使用16S r DNA的细菌通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增。

25μL的PCR反应体系为:模板10.0μL,d NTP混合液2.5μL,Buffer 2.5μL,Taq酶0.5μL,上下游引物各0.5μL,无菌水8.5μL。

PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,60℃退火1 min,72℃延伸2 min,以上共进行30个循环,72℃补充延伸10 min,然后4℃保存。

采用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测后,产物送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.4 最适降解条件及实际降解能力研究

以含油无机盐培养基为基础,通过改变不同的p H,改变微生物生长所需的氮源,不同氮磷比,探究它们对菌株的生长和降解率的影响,可得到各菌株的最适生长条件。将各菌株按相同接种量投至石油污染土壤中,添加适量营养元素,定期检测石油烃含量,研究其在土壤中的降解能力。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选及降解率的测定

通过富集、分离、纯化等培养步骤,从石油污染土壤中筛选出8株以石油为唯一碳源的菌株,分别编号为S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7、S-8。将石油污染土样加入100 m L无机盐培养基配成泥浆,控制相同土样种类(石油浓度为1 250 mg/L)、重量及外部环境,按10%的接种量分别接种8株菌到泥浆中,以不接种菌株为空白对照,用分光光度计法测定各菌株的石油含量,每2 d检测一次,振荡培养14 d后,各菌株的石油降解率不再增高,记录各菌株的最终石油降解率如图1所示。

由图1可知,由于土壤本身含有可降解石油的土著菌,空白样的降解率为12.09%,在添加筛选的菌株后,各瓶中的石油降解率均得到了提高。其中,降解率最高的为S-7菌株,降解率为43.53%,降解率最低的为S-6菌株,降解率为20.53%与S-1菌株的20.80%相差很小,S-2、S-3、S-8菌株的降解率基本持平,为29%左右,而S-4、S-5菌株的降解率均超过了40%。因此,选择S-4、S-5、S-7作为高效菌株,用作下一步实验研究。

2.2 菌株的16S r DNA鉴定结果

3株菌的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示(图中S-4与S-4'、S-5与S-5'、S-7与S-7'分别为平行样)。

由图2可知,3株菌PCR产物的长度均在1 500bp左右,有足够长度,且条带清晰无杂质,序列适合进行测定。

经序列测定,S-4、S-5、S-7菌株的16S r DNA基因长度分别为1 411 bp、1 433 bp和1 419 bp。将序列信息提交至NCBI网Gen Ban K数据库中,进行BLAST同源性比对,比对结果如表1所示。

由表1可知,S-4和S-5分别属于肠杆菌(Enterobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas),同源性均为99%;而S-7为Kosakonia属,同源性为100%。假单胞菌和肠杆菌为文献中经常提及并被发现具有高效石油降解能力的菌属[8],徐圆圆等[9]研究表明,肠杆菌X-11是一种良好的石油烃降解菌,其对石油烃代表物十六烷及菲都有较好的降解特性,应用前景广;陆昕等[10]。研究结果显示,利用假单胞菌Nwu1-mu对陕北黄土地区石油污染土壤样品进行生物修复实验,在不添加营养物质的前提下经过60d的处理时间,石油烃类物质总降解率可以达到86.50%。而Kosakonia菌在降解石油方面鲜有报道,可能为新发现的可降解石油污染物的菌种,且对石油降解效果较好,能为微生物处理土壤石油污染提供一定的参考。

2.3 石油降解菌的降解条件研究

2.3.1 最适降解p H

p H是影响微生物生长繁殖的重要环境因素之一,生物体内的生化反应需要酶的参与,而不同p H对酶的活性有影响,所以需找出菌株降解石油的最适p H范围。其他条件保持相同,配制初始p H值分别为3、5、7、9、11的含油无机盐培养基,分别加入相同接种量的S-4、S-5、S-7菌悬液,连续振荡培养5 d后,检测残余石油含量,各菌株的石油降解率如表2所示。

由表2可知,三组高效菌在初始p H为3时石油降解率最低,在p H为7时均达到最高降解率,分别为50.08%、48.82%、51.31%。三组高效菌的石油降解率在初始p H环境为碱性时的石油降解率要高于酸性环境,且S-4、S-5菌株,在p H为7~9时,其降解率要明显高于其他p H时的降解率,这与土壤p H呈中性或碱性情况相符。其中,p H对S-7的影响最为显著,在初始p H为3时,石油降解率仅为10.63%,而在初始p H为7时,降解率高达51.31%,是p H为3时的5倍。所以,三组菌株的最适降解p H为7。

2.3.2 氮源的选择

氮源是提供微生物生长所必需的核苷酸、维生素和矿物质元素等营养成分的合成原料,微生物对不同氮源的利用效果不同,因此氮源的选择对微生物的生长和石油降解有重要影响。其中氮源分为无机氮源和有机氮源,对3种代表性的无机氮源硝酸铵(NH4NO3)、硫酸铵((NH4)2SO4)、硝酸钾(KNO3)以及有机氮源尿素(CO(NH2)2)进行研究,保持各N元素含量相同,其他条件也相同,在30℃、200 r/min摇床上振荡培养一定时间后,检测菌株对原油的降解率和生长量OD600值,结果如图3和图4所示。

由图3可知,氮源不同时,菌种的石油降解率也不同。当氮源为硝酸铵时,三组菌株的石油降解率均最高,分别为45.09%、51.94%、48.69%,相比以硫酸铵为氮源时,分别要高10%左右。以尿素为氮源时,3株菌的石油降解率最低,只有20%左右。究其原因,仍然与环境中p H有关,以硫酸铵和尿素为氮源时,铵离子被菌株吸收后,环境呈酸性;以硝酸钾为氮源时,硝酸根离子被吸收后,环境呈碱性;而硝酸铵中,铵离子和硝酸根离子同时被利用,环境p H基本维持在中性,菌株降解石油无影响。

对照图4可知,不同的氮源对各菌株的生长状况的影响有显著的差别。当以无机氮为氮源时,各菌株对氮的利用效果大小为:硝酸铵>硫酸铵>硝酸钾。以有机氮尿素为氮源时,各菌株的生物量,要比以硫酸铵、硝酸钾为氮源时的生物量都高,而低于硝酸铵。虽然各菌株的对尿素的利用效果也不错,但是有机氮尿素同时也是碳源,将优先于石油被微生物利用,会影响微生物对原油的降解,则出现生物量虽高但石油降解率低的现象。

综合以上,以硝酸铵为氮源时,三组菌株的生物量最大,对原油的降解率最高。因此,选择硝酸铵NH4NO3为该三组菌株的最佳氮源。

2.3.3 最适氮磷比的选择

N源和P源的可利用性一直以来都被考虑为对石油烃降解最大的限制因素[11]。营养元素不足时,微生物生长繁殖缓慢,将影响微生物对石油污染物的降解,而添加过量,不光会造成浪费,甚至会起到抑制作用。黄廷林等[12]研究表明,当氮、磷比为4∶1时,菌株对石油的降解效果最好。而武海杰等[13]发现,氮、磷比为10∶1时微生物降解石油的降解率达到最高,氮、磷比继续升高,石油降解率反而下降。由此可见,不同的菌种对氮、磷营养元素比例的需求是不同的。

在确定了硝酸铵NH4NO3为最佳氮源的基础上,保持磷元素含量不变,改变氮元素含量,使得氮、磷质量比分别为N∶P=1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、14∶1、28∶1。进行振荡培养数天后,检测石油降解率,结果如图5所示。

由图5可知,当磷元素含量不变时,随着氮元素含量的增大,微生物对原油的降解效率逐渐升高,在氮、磷比为5∶1时达到最高值,继续增大氮元素含量,则降解率呈下降趋势,可见若氮元素过量,会起到抑制作用。因此,该三组高效菌的最适氮、磷比为5∶1。

2.3.4 各菌株在石油污染土壤中降解效果

取等量相同的石油污染土壤,检测其石油含量为1 869 mg/L,p H为7.5。将相同接种量的各菌株和添加适量氮、磷营养物质使土壤中氮、磷比为5∶1,与细木屑拌匀,一同投加至土壤,这能使其在土壤中分布均匀,以不投加细菌和营养物质为空白对照。每4 d取定量土壤检测其石油浓度,各土样的石油降解率如图6所示。

由图6可知,在不投加菌株的石油污染土壤中,土壤依靠自身土著微生物的石油降解效果很低,48d的降解率只有19.08%,而在投加了高效石油降解菌的土壤中,石油降解效果显著提高。降解约40 d后,由于土壤中营养物质被耗尽,各菌株的石油降解率趋于平缓直至不变,S-4、S-5和S-7的最终降解率分别为74.24%、71.66%和80.29%。

土壤中的环境因素较摇瓶中要复杂许多,三个菌株在土壤环境中的石油降解率仍然很高,由此可见,在添加适量营养元素的条件下,三个菌株在应用于石油污染土壤中的降解效果较好。

3 结论

(1)以华中地区某油田石油污染土壤为菌种来源,通过富集、筛选出8个菌株,检测8株石油降解菌的降解能力,降解率最高的为S-7,达到43.53%,最低的为S-6,只有20.53%,另两高效菌株S-4和S-5的降解率分别为41.60%和40.59%。

(2)通过16S r DNA序列比对,确定S-4属于肠杆菌属(Enterobacter),S-5属于假单胞菌属(Pseudomonas),S-7属于Kosakonia属,其中Kosakonia可能为新发现具有降解石油能力的菌种。

(3)通过实验确定,三菌株最适p H值为7,氮源为硝酸铵NH4NO3,氮、磷比为5∶1时,生物降解效果达到最佳。