超声靶向微泡破裂

超声靶向微泡破裂（精选四篇）

超声靶向微泡破裂 篇1

1 UTMD的转染原理

超声波本身具有促进基因转染的作用[1], 联合使用超声造影剂微泡可进一步提高转染效率, 其原理主要是目的基因通过表面黏附或内部包裹的方式与微泡结合, 然后通过超声介导在靶细胞或组织中, 由微泡靶向传输基因或药物[2], 超声波的空化效应可以导致组织细胞膜通透性增高, 而微泡又能降低超声波的空化阈值, 从而增强空化效应, 使局部毛细血管破裂, 邻近组织细胞间隙增宽, 从而使目的基因更容易进入组织细胞内而提高局部组织及细胞的基因转染和表达, 达到基因治疗疾病的目的[3,4]。Hallow等[5]证明空化效应释放出强大的声能, 引发多种生物学效应, 形成声孔。细胞膜出现暂时且可逆的小孔, 使细胞外大分子能够得以进入细胞的现象称为声孔效应, 声孔效应可能是基因成功转染的基础。虽然空化效应和机械效应使细胞膜通透性增加是增强基因转染的主要原理, 但UTMD促进基因转染效率的确切机制尚不明确。Bekeredjian等[6]认为目的基因的转染也与超声、质粒及微泡的结合方式有关, 由此可以认为细胞膜通透性增加不是UTMD增加转染效率的唯一机制, 而是多因素影响的过程, 其详细机制仍在进一步研究中。

2 UTMD在药物传输中的应用

超声造影剂微泡可以通过不同方式携带药物, 通过特殊的声孔效应经静脉途径靶向给药, 超声辐照介导微泡造影剂定向释放药物, 这种效应可以改变药物的分布, 增加药物局部浓度, 减少不良反应。康娟等[7]发现多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD能抑制兔VX2肝癌的微血管生成, 从而抑制兔VX2肝癌的生长。

溶栓治疗已经成为超声微泡药物运输系统的应用方向, 在理想条件下, 超声联合微泡可以完全溶解血栓[8]。Flores等[9]发现将溶栓剂组织型纤溶酶原激活物和超声微泡联合应用不仅能有效溶栓, 还能显著降低急性脑卒中患者的颅内出血。

UTMD对于肿瘤、炎症、血栓等都有显著的治疗效果, 对多种组织器官的疗效也在不同动物模型中得以证实, 相信在进一步完善各项参数条件后, UTMD能够真正运用到临床治疗中。

3 UTMD在基因转染中的应用

自2000年首次报道UTMD用于体外基因转染以来, 该技术在体内外实验中均取得较显著的效果, 用于转染各个系统脏器。作为一种非病毒转染方法, UTMD较传统的脂质体、阳离子聚合物等方法显示出其独特的优势。

3.1 UTMD在肿瘤基因治疗中的应用

目前常用的UTMD肿瘤基因治疗方法主要有以下几种: (1) 自杀基因疗法, 又称为基因介导的酶前药物治疗。Li等[10]发现超声介导下自杀基因KDRP-CD/TK对乳腺癌MCF-7细胞有显著的抑制作用。Zhou等[11]将单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-TK) 自杀基因微泡通过UTMD技术作用于小鼠肝癌模型, 效果明显。 (2) 抗肿瘤新生血管形成疗法。Kou等[12]通过RNA干扰 (RNAi) 技术阻断血管内皮生长因子受体后, 肿瘤血管生成减慢。而通过UTMD技术完全可以靶向干预血管内皮生长因子受体, 得到相同甚至更佳效果。 (3) 基因替代疗法。Luo等[13]利用UTMD将野生p53基因转染视网膜母细胞瘤Y79细胞, 不仅较传统转染方法效率更高, 抑制作用也显而易见。 (4) 反义基因疗法。载反义m RNA微泡经超声介导转染神经胶质瘤细胞, 经检测肿瘤特异蛋白表达水平显著降低, 充分说明其抑制作用。可见, UTMD在肿瘤基因治疗中具有良好的应用前景。

3.2 UTMD在组织器官基因治疗中的应用

除肿瘤外, 在心血管[14]、肺[15]、脑[16]、脊髓[17]、子宫[18,19]、胰腺[20]、肾脏[21]、视网膜[22]、皮肤[23]、睾丸[24]等的转染实验中, UTMD均表现出安全和高转染效率的优点。UTMD可高效、靶向转染目的基因而无明显组织损伤, 是一种安全、简单、有应用前景的非病毒基因传输方法。

4 UTMD的影响因素

UTMD对不同器官组织作用程度的不同会造成药物传输及基因转染效率的不同, 主要受到3个方面的影响:一是介导超声的参数;二是所使用微泡的特性;三是微泡输入的途径及超声微泡作用局部的环境。

与超声相关的参数变量有声强、持续时间、频率、束流截面、衰减作用等。对超声参数的优化主要体现在参数设定方面, 即能够产生足够的声能形成尽可能多的外溢孔, 使得所传输的药物及基因能够进入细胞及组织间隙中, 提高药物作用效能及基因转染效率, 但这应基于在细胞组织耐受并不会产生明显不良反应的基础上。因此, 对超声参数的优化对于成功地应用UTMD介导药物传输或基因转染都是至关重要的。在组织能耐受的情况下高声强和低频率超声照射对细胞转染是最为有效的[25], 且超声辐照的时间不宜过长, 否则微泡会因为长时间的超声辐照而被大量清除, 使转染效率降低[26]。Zarnitsyn等[27]采用p EGFP-N1及p GL3对DU145前列腺癌细胞进行转染, 以优化转染过程中声强、微泡浓度、细胞密度、质粒浓度、温度、辐照时间等转染条件, 实验结果显示, 优化后的超声参数能够在保证细胞耐受及DNA质粒完好的条件下提高转染效率。

微泡的性质也是UTMD介导药物传输及基因转染的重要因素, 只有适合的微泡才能完成运输转染。微泡相关变量有微泡外壳成分构成、微泡中气体的性质、剂量、浓度、输注时间等, 当超声微泡结合脂质体或阳离子聚合物时, 也会明显增加转染效率[19]。除自制的微泡外, 获批上市的微泡造影剂有Sono Vue、Levovist、Optison、Definity、Sonazoid及bi Sphere等。Wang等[28]用携带绿色荧光的DNA质粒分别与Sono Vue、Optison和Levovist混合, 结果显示, Optison在没有超声介导的条件下即能够提高转染效率。在超声辐照的条件下, Optison也能够提高基因转染效率, 但是与仅使用Optison造影剂条件下的转染率无明显差异。而Sono Vue在联合超声辐照后, 转染效率较单独使用时明显增加。只有Levovist无论是否结合超声辐照对转染效率均无明显益处, 在没有超声辐照的条件下反而会降低转染效率, 而且较Sono Vue及Optison的安全性低。Optison及Sono Vue能提高转染效率在很大程度上与其自身化学组成有关, Optison微泡的白蛋白外壳及八氟丙烷气体、Sono Vue微泡的磷脂外壳及六氟化硫气体不同于Levovist微泡的半乳糖外壳及空气, 带正电荷的白蛋白及阳离子脂质体均有助于基因转染, 而且全氟化碳气体溶解度比空气低, 保证其稳定性更佳, 同样拥有脂质体外壳及全氟化碳气体的Definity微泡对基因转染也起促进作用, 证明了这一点[29]。而Sono Vue结合超声能够进一步提高转染效率是因为超声作用时产生的声孔效应比作用于Optison的转染过程更为明显。故建议在基因转染实验中选用Sono Vue、Optison及Definity等白蛋白或脂质体外壳, 全氟化碳气体的微泡造影剂更为适合。Li等[30]分别比较Optison、Imagent和Definity 3种超声微泡对心肌血管通透性的作用, 结果显示, 3种微泡对微血管损害的潜在性无明显差异, 仅Definity组有较多的微血管渗出。

由于UTMD介导转染还受到造影剂给药途径、转染部位、超声仪器等因素的影响, 对UTMD各方面影响因素的限定至今仍无法达成共识。

5 UTMD的安全性

自超声造影剂问世以来, 其安全性备受关注。2007年, FDA要求在超声微泡造影剂标签上加上黑框警告, 以警告其有引起严重心肺反应的危险, 因为有4例患者在注射造影剂当时或之后30min内死于心脏骤停, 还有一些患者发生严重但非致死性的心肺并发症。但一系列大规模回顾分析[31,32]证明了超声微泡造影剂使用的安全性后, FDA修改了黑框警告。

UTMD技术所要求的超声参数与诊断用超声不同, 为高声强、低频率、高强度超声, 会引起组织细胞不可逆的损伤[33,34]。此外, 超声联合微泡所产生的空化作用, 即在微泡破裂的瞬间所释放出的巨大声能与高温, 都会使组织细胞受损伤的风险大大增加, 已有超声联合微泡引起组织出血、血管内溶血、体外培养细胞和含气组织及器官损伤的报道[35]。并有学者认为UTMD还能通过局部产生自由基和微射流, 引起血管内皮损伤, 进一步损伤细胞和组织。

目前绝大多数学者认为UTMD较病毒转染方式相对安全。Hynynen等[36]将去除部分颅骨的新西兰兔作为实验模型, 采用超声联合微泡造影剂对实验模型的脑部进行20s辐照, 声强为16~690W/cm2, 实验结果显示, 联合微泡超声局部辐照可使血-脑屏障短暂地、可逆地开放, 并不引起损伤。此外, 大多数关于UTMD的实验多采用离体器官或细胞为研究对象, 使用剂量远大于临床所需剂量。所以UTMD在药物传输及基因转染过程中对人体产生损伤的概率应该很低。

6 UTMD的应用前景

目前基因治疗需要寻找一种安全、高效、可重复、靶向性强的转运载体, 而UTMD技术的出现正可以解决这个难题, 虽然该技术的效率相对于病毒转染方式很低, 但是它克服了病毒转染的细胞毒性及免疫原性问题, 创伤小、安全性高, 也可以直接携带药物进行治疗, 在分子生物学中具有广阔的应用前景。

超声靶向微泡破裂 篇2

1血栓溶栓治疗的现状

目前利用超声联合靶向微泡造影剂共同溶栓已被证实是一种快速溶解血栓的方法,其对预防急性冠状动脉和脑动脉血栓形成均起了重要作用。

Nederhoed等[2]通过制作猪急性周围动脉闭塞的模型验证了超声联合微泡溶解血栓是目前较好的溶栓方式。 微泡造影剂,尤其是联合超声的微泡造影剂在急性外周动脉闭塞疾病的治疗中,具有很好的溶栓前景[3,4]。 通过超声联合微泡造影剂共同作用,可进一步增强远端小血管的溶栓效果[5,6,7]。 在超声强度方面,体外低频超声,主要是通过加速纤溶酶对凝血块的纤溶作用从而达到溶栓,此时再将粒径为1~10 μm的微泡震荡后联合超声溶栓,那么尽管在更高强度的超声条件下也同样能达到血栓及血凝块的快速溶解[8]。 因此1~10 μm粒径大小的微泡在治疗下肢血栓的疾病中具有较好的溶栓效果。 研究表明使用微泡增强溶栓时,选择超声频率,主要考虑以下3个因素:微泡的大小,这会影响其谐振频率[8,9];衰减频率的增加,更高的频率下限制了治疗的深度;增加较低的频率时就可以形成定波的机会[10,11]。 亦有研究证实微泡空化作用的阈值会随频率的增加而提高[12,13,14,15]。 因此合理的超声频率、微泡的粒径大小以及溶栓的时间长短都是溶栓的关键因素,通过调整其中的条件,可使超声联合微泡起到共同作用从而提高血栓的快速和彻底溶解、达到预防血栓形成的目的。 Alexandrov等[16]通过靶向超声联合微泡对猪的下肢血管栓塞模型进行治疗[17],显示猪和人的凝血和纤溶系统有着类似的组成成分[18], 即当服用抗血小板药物并联合超声微泡两种不同的溶栓方法时, 对末端血管的溶栓效果结果显示更好, 能够达到血栓的完全溶解。

2超声频率的选择

选择超声频率,主要因素为:微泡的大小,这会影响其谐振频率;衰减频率的增加,更高的频率下限制了治疗的深度;增加较低的频率时就可以形成定波的机会;除此还有微泡空化作用的阈值会随频率的增加而提高。 过去的研究中有的采用“低”频率(20~500 k Hz), 有的采用“高”频率(MHz)的范围[19]。 迄今为止大多数临床和体内研究中使用过的较高的超声频率,最常见范围是TCD设备中常规的1~2 MHz。 使用频率较低的超声具有通过体积较大的声波作用来改进的颅骨穿透力与定位的优点。 然而一定要慎重选择照射参数以确保其安全,一个有名的临床试验中使用了300 k Hz的超声(无微泡),因高发的颅内出血情况被迫提前终止[21]。 后续的工作建议涉及血-脑屏障的破坏,这可能是由于使用超长、超宽主脉冲[20]造成多反射干扰或高于空化阈值的压力形成定波,这两者都可以通过改变照射的参数进行补救[22]。

3与溶栓有关的指标

尽管经皮冠状动脉介入治疗或药物溶栓,远端微栓塞的现象仍有发生。 使用超声微泡溶栓治疗是诱导微气泡振荡导致血块破坏和恢复灌注的方法。 微血管阻塞是一个复杂的多因素现象,包括微循环痉挛,血小板聚集和微血管血栓。

3.1微血栓的形成

微血栓发生于微循环血管内, 是一种透明血栓, 由嗜酸性同质性的纤维蛋白构成, 是纤维素性血栓。 血栓颗粒尺寸范围从10 ~200 μm, 平均直径为(17.3±3)μm。

3.2影响溶栓的相关因素

3.2.1组织因子(tissue factor,TF) TF由凝血蛋白酶级联细胞引发,参与止血,在血栓的形成过程中具有重要作用,在炎症和细胞免疫反应,组织中TF的细胞分布尚未被描述。 TF是在组织中选择性表达,与细胞而不是细胞外基质相关。 在血管内皮细胞和外周血细胞中可检测。 TF作为凝血途径的起始因子[23,24], 也被名为血小板组织因子、 因子Ⅲ、 凝血活酶或cd142,它是一种蛋白,在内皮组织和白细胞中存在, 是启动凝血酶形成凝血酶原的必要因子,TF作为外膜细胞,在细胞核平滑肌细胞参与了凝血途径[25]。 Golinp等[26]研究发现,TFPI21在动脉粥样硬化病变时表达会代偿性增高。 Kong等[27]研究证实,在离体实验中TFPI22能抑制MMP22活性。

3.2.2 P/T比值即血浆6-酮-前列腺素Flα(6-keto- prostaglandin1-α,6-keto-PGF1α) 与血栓素B2(throm- boxane B-2,TXB-2)的比值。 P/T比值升高易导致血小板聚集、血栓形成,促使动脉粥样硬化和冠心病。 出血、 损伤和内毒素休克动物血浆中TXB2显著增加, 这与休克时肺循环阻力升高有关。 李小鹰等[28]的研究表明:在正常生理情况下6-leto- PGF1a和TXB2保持着一定的比例关系,P/T比值变化可反映血管舒缩状态和血小板聚集能力,二者平衡在维持正常组织灌注和血流通畅方面起重要作用一旦失衡就可能导致血小板黏附、聚集,微血管痉挛,微血栓形成、组织灌注不良等一系列病理改变。

3.2.3 P-选择素(P-selectin) P-selectin是常用的血小板活化指标,其水平高低反映了血小板的活化程度,且敏感性、特异性均较高,化学性质稳定,测定程序已标准化。有研究表明静息血小板的 α 颗粒膜上有少量P-选择素表达。 Merten等[29]的研究发现:GPⅡb/ Ⅲa受体复合物逐渐陷入或移入血小板小管系统, P-选择素作为唯一的连接分子血小板表面仅留下大量的存在,它通过与相邻血小板表面的硫脂类受体相结合, 使血小板连接形成大而稳定的血小板血栓,因此P-选择素可作为检测早期动脉血栓的靶标, 在动脉血栓形成过程中发挥了重要作用。

3.2.4炎症因子与血栓的关系肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 被认为是导致全身炎症反应综合征一个最主要的炎性介质。 对于TNF-α 在急性缺血再灌注过程中的表达和作用的研究结果表明, 肢体急性缺血再灌注后,TNF-α 的表达显著增高,也与不少研究提示的脑缺血再灌注损伤后,TNF-α 达迅速增加一致[30]。 炎性反应介导了肢体再灌注损伤, 而中性粒细胞的聚集和浸润及白细胞介素l(inter- leukin-1,IL-1)、 白细胞介素6 (interleukin-6,IL-6)、 白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)等大量炎症因子的释放是炎性反应发生、发展的关键。

3.2.5血管性假血友病因子(von Willbrand factor, v WF) v WF是一种多聚体糖蛋白,主要由血管内皮细胞合成、储存(Weibel-Palade小体)和释放,亦有少量由血小板储存(α 颗粒)和释放。 它既可与小板膜糖蛋白在血栓形成过程中发挥着重要作用, 它既可与小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa结合,又可以和胶原介导血小板结合, 又可以和胶原介导血小板、黏附、聚集于受损的血管内皮下组织,导致聚集于受损的血管内皮下组织,导致栓形成,因此它可以作为血管内皮受损的标志物。

3.2.6血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) VEGF属于血小板源生长因子超家族重要成员,可由血管内皮细胞等多种细胞分泌, 具有生理和病理性血管增生和通透性调节作用。 Waltham等[31]发现VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)在大鼠的下腔静脉自然溶解血栓中表达, 在血栓的再通和机化中起了调节作用,并且VEGF和b FGF在下腔静脉壁未见有表达, 血清中VEGF和b FGF水平变化不明显。 静脉注射VEGF治疗静脉血栓研究表明,VEGF可促进管腔再通、血栓机化。

3.3溶栓后的病理改变

研究表明,血栓溶解后,大栓子脱落造成下游微血管(30~150 μm)栓塞,用Masson病理染色观察其结果为动脉微栓塞内,可见团块状、均质、绿染的纤维蛋白结构,其周边散在红色颗粒状沉积的红细胞。 徐亚丽等[32]通过制作股动脉血栓,在不同条件下溶栓后,对末梢微循环内微血栓进行检测:采集末梢血管标本,用中性甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,将组织切成4 μm厚的切片。 进行HE染色以观察微血栓的形成。 微血栓指在小于150 μm的微血管中,由血小板、纤维素和/或红细胞组成,HE染色呈粉红色,单纯的红细胞堆积认为是血管中残留的血液,HE染色呈点样深红色。同时取两张切片进行马休黄-酸性品红- 苯胺蓝(改良Lendrum法)染色,观察冠脉微血管栓塞组成成分,纤维素呈鲜红色,肌纤维呈红色,细胞核呈蓝褐色,胶原纤维呈蓝色,红细胞呈黄色,陈旧的纤维素成紫蓝色。

4传统的药物溶栓与靶向微泡、尿激酶联合超声溶栓的现状比较

近年来超声微泡造影剂制备被不断研发更新中, 不同的血栓助溶研究多采用不同的超声微泡,其血栓助溶效果也存在差异。 在体内,微泡的性能是受其材料结构、微泡粒径和血液中的稳定性影响的,也依次由许多参数,包含在微泡内的气体、外壳材质和分布决定。 其中,微泡膜和内核气体与微泡粒径及稳定性密切相关,是影响血栓助溶作用的主要因素。

微泡的靶向性能够增大血块附近微泡的浓度,从而增大它的溶栓作用,与此同时增加微泡在血块附近停留的时间。 这样可能能够降低超声的强度和微泡的剂量,以减少发生副作用的风险,并增加其安全性。 采用微泡注射,在体外和体内的相关研究表明,微泡通过携带或不携带溶栓药,可协助血栓溶解,而且对周围的微血管再灌注有作用。 在短时间内可提供增强了的造影;经实验证明,连续给药可以延长超声造影增强的有效期,同时还可增强造影,已被应用于一些超声溶栓的临床试验中。 微泡增强超声溶栓的另一个问题是如何使药物和微泡运输到血流减少的区域。 Culp等[33]关于低频超声下犬动静脉移植物的研究已经强调了微泡运输到血凝块的困难性,其中直接移植内注射微泡往往比静脉注射取得更多的再通。 Xie等[34]研究了“引导图像”超声治疗法,血凝块在诊断性超声中连续成像,并且只有当微泡在缺血区域中被检测到时才能触发高强度的治疗性脉冲。 通过超声联合微泡溶栓可能会使血栓破碎成小块,但如果碎片大于下游毛细血管的直径,这就会增加二次栓塞的风险。 血凝块碎片的大小在很大程度上取决于超声照射强度[35]。 有研究观察到在不使用微泡或纤溶药物的情况下,在体外用20 k Hz脉冲模式超声处理人类血栓时,99%的血凝块碎片都小于10 μm[34]。

4结论与展望

综上所述,微泡结合超声溶栓是一个全新的研究领域,影响因素也较多,因此将携带溶栓药物尿激酶的靶向微泡造影剂经静脉注射后,如能充分考虑到超声的发射频率、强度、时间,溶栓药物的剂量等因素, 不仅可以达到对靶向血管内血栓的完全溶解,同时也能达到预防微循环的再栓塞。 超声联合微泡溶栓的治疗过程中,对相关参数最优化,治疗方案进一步优化及靶向微泡的合理应用,会进一步提高临床溶栓治疗的安全性和有效性。 因此,超声联合靶向微泡溶解血栓有望能快速提高目前溶栓治疗的安全性和溶栓效率。

摘要：在传统的溶栓过程中,一些血栓片段过大,不能通过末端分支小血管,易导致血栓的再栓塞。目前,超声溶栓在原有研究的基础上,对超声频率、强度、持续时间和溶栓和抗凝药物的剂量进行调整,使其达到对靶向血管内的血栓进行有效溶解的同时预防微循环再栓塞形成。与高频超声比较,在固定频率的低频超声作用下,使用低强度超声功率可以获得最好的溶栓效果;在超声照射时间上,超声作用时间越长,其溶栓效果越明显。比较单纯药物溶栓,微泡+超声+溶栓药联合应用可获得更好的溶栓效果。

超声靶向微泡破裂 篇3

1 超声微泡的概念

Gramiak等在1968年首次报道了小气泡可增强超声显影,开创了无创超声诊断和治疗新领域。超声微泡是一种内含气体的粒径为1~8μm的微球,与检验诊断微球不同,它以磷脂、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解高分子多聚物等物质为壳膜,内部包含气体[3]。超声微泡具有良好超声显像对比作用以及药物递送载体作用,它表面通过人工结合的靶向分子特异集中在病变组织细胞部位,不仅可提高超声分子诊断水平,同时通过微泡携带基因或药物靶向治疗在疾病治疗领域也发挥重要作用[4]。

超声微泡一般需要以下条件:(1)在体内有足够保持稳定时间;(2)具有超声回波强度;(3)对人体组织毒副作用小或虽有某种副作用,但可借助药物或仪器来消除或缓解;(4)能通过肺滤进入全身动脉系统而不造成栓塞。这要求微泡化学组成无毒可降解,结构稳定,且其粒径控制在8μm以下[5]。

2 超声微泡的分类

超声微泡主要分为非特异超声微泡和特异性靶向超声微泡两类[6]。前者微泡表面没有进行任何处理,进入到人体后,理论上可集中到任何一个组织或器官,但由于微泡外壳为蛋白质或脂质外膜与某些病变组织表达受体可进行非特异性结合, 实现疾病的早期诊断。此外,肝脏是主要体内异物处理和消化器官,所以,普通超声微泡可提高肝脏超声的灵敏度。早期研制的靶向超声微泡在超声造影中并不可行, 因为早期超声微泡造影剂经静脉注射后不能通过肺循环毛细血管网。改进后的超声微泡造影剂将含有靶向抗体脂质膜包裹可产气溶液(如碳酸氢盐), 使其到达靶组织处后酸化产生气体核心超声微泡,但产生的二氧化碳往往极易溶于血液中,导致造影后实际可观察时间非常短。目前,脂质膜包裹不溶性惰性气体的超声造影剂已经研制成功,利用单层脂质包裹的微泡进行了体外生物模型试验,取得满意效果[7,8]。

特异性靶向微泡是指超声微泡表面携带有生物大分子的微泡。人们将特异性抗体、配体和基因片段结合于微泡表面,这些靶向配体可通过两种方式连接在微泡表面,一是直接吸附连接于微泡表面, 二是通过某些化学活性物质如马来酰亚胺、吡啶二巯基丙酸等作为锚定物, 或用碳二亚胺激活微泡表面羧基将靶向配体间接连接到微泡表面[9]。靶向超声微泡常用聚乙二醇形成的长链和浓密的刷状短链构成外壳,由于聚乙二醇具有良好的柔韧性和延展性, 可向外伸入周围介质中数十纳米。配体位在这些聚乙二醇的长链顶端伸出浓密的刷状短链多聚物层, 提高了靶向作用的稳定性,浓密短多聚链层也可保证微泡体内稳定性,降低其非特异性结合几率[10]。靶向特异超声微泡表面分子可以是亲和素分子。首先,向体内注射可结合在病变部位的生物化的抗体,生物素化抗体与靶向组织上的特异抗原结合,再注射亲和素化的超声微泡声学造影剂, 通过微泡表面的亲和素与结合在靶组织抗原上的抗体的生物素结合,使超声微泡特异集聚在病变部位,并通过超声灵敏地诊断出来。特异性靶向微泡造影剂目前尚在实验室研究阶段,靶向超声微泡走向临床面临以下困难:(1)靶向微泡的规模化制备;(2)靶向微泡发现并黏附到病变靶位能力;(3)尽量减少配体与其他非特异性区域的结合以及毒副作用等[11]。

3 超声分子成像

超声分子成像主要是因为超声微泡内含气体,较其周围生物介质易于压缩,在超声场(MHz) 作用下微气泡压缩和膨胀产生有效的背向散射,可被超声探头接受并经成像系统检测成像[12]。由于体内的微泡在超声场作用下具有较强的回波反射性能,能显著增强超声信号,在人体微小血管和组织灌注检测与成像方面,具有成像效果好、实时、操作简便、无离子辐射、无损性、适用面广等优点,因此在医学临床检测中得到越来越多的应用。超声分子成像的另一个重要机理,就是要保证特定的组织细胞周围有足够的超声微泡,因此,一般的超声微泡进入身体被迅速稀释,到达某部位的浓度很低,超声分子成像需对普通微泡进行特殊的靶向微泡协助成像。靶向微泡与普通微泡一样,大都为含气体的微气泡,其外壳成分可为人体白蛋白、脂类物质、棕榈酸和聚合物。将针对组织高度特异的抗体或配体连接于微泡外壳,使其具有靶向性,进入体内后,可特异地集中在某组织细胞周围,超声成像效果好、特异性强。因为微泡太大易造成血管阻塞,太小影响超声诊断的灵敏性,微泡制备难度大。因此,靶向微泡体内靶点目前局限于血管内皮,主要用于炎症、肿瘤血管生成、血栓、缺血再灌注损伤等分子成像研究[13]。

超声分子成像包括三个过程,首先将靶向配体(蛋白质、抗体、肽类等)连接在微泡表面,制备靶向微泡,然后将靶向微泡送体内进入血循环后与靶点部位受体分子选择性结合并积聚,最后靶区与正常组织间超声信号对比度升高,实现对靶点(受体表达上调)的选择性成像。这种成像技术将在了解疾病发生的分子机制、指导肿瘤治疗、研发新的治疗靶点和药物等方面发挥重要作用。目前,这类超声微泡已成功应用于临床多种组织部位肿瘤细胞显像[14,15]。

4 靶向微泡的制备

靶向微泡由三部分组成,一是充满气体的空腔,二是包裹空腔的外壳,三是外壳外的靶向分子。内部空腔内的气体主要为惰性气体醛氟化碳或六氟化硫。外壳成分不仅决定微泡稳定性,还决定微泡逃逸网状内皮系统识别和清除能力以及在超声场中抵抗破裂的能力,微泡外壳主要成分有白蛋白、脂质类、表面活性剂或生物相容性较好的高分子聚合物,膜厚一般为2~500nm[16]。高分子多聚物抗压性、稳定性高,生物相容性好,克服了脂质微泡的不稳定性和蛋白微泡的免疫原性,氟碳气体分子量较大、溶解度和弥散度较低,因此,采用高分子多聚物作为壳膜材料内含氟烷气体制备的微泡具有直径小、粒径分布窄、半衰期长等优点,是近年来超声造影剂的研究热点[17,18]。

目前国内外常采用超声空化法、冷冻干燥法、喷墨打印法、中和法、机械匀化法、界面聚合法、薄膜-水化法、吸附法、乳化法等方法制备超声微泡[19]。Cui等[20]用双乳化-溶剂蒸发法制备了一种多孔、中空的平均直径为1.8μm的微泡,可以安全到达狗模型心脏中并可增强显影。Marcel 等[21]用喷墨打印技术制成粒径分布狭窄、高分子多聚物外壳、平均直径为5μm的中空微泡。超声微泡制备面临的困难主要包括:(1)粒径及壁厚难以控制;(2)所制备微泡稳定性尚存在问题,微泡必须能在人体内存在足够长的时间以便诊断。微泡制备过程中采用了许多特殊方法及设备,并涉及到了表面活性剂化学、界面及胶体化学、流体力学等多方面的知识[22,23]。目前医学造影用微泡制备常采用物理方法和化学方法两种。物理方法(如声振空化法、冷冻干燥法)所制备的微泡粒径分布均一性欠佳,很难通过调整粒径及壁厚来控制其声学特性;化学方法虽能制备得到粒径分布均匀的微泡,但很难实现大规模工业化生产,同时其所选用的成膜材料均为已聚合材料,其表面存在的活性官能团较少,难以满足后续微泡载药和携基因需要。采用化学方法制备微泡优点在于能通过控制反应条件从而更加有效地控制其形态结构,并能轻松实现其表面官能团化,可以为某种分子成像条件“量身定做”适合的造影剂。

5 超声微泡在超声影像诊断中的应用

超声微泡的应用大大提高了超声影像诊断的技术水平。超声微泡造影可以清楚显示病变组织的血流灌注特点,增大病变组织与正常组织的对比差别,从而提高超声发现病灶和定性诊断的能力。大量研究显示,超声微泡造影诊断与鉴别肝脏肿瘤和肾脏肿瘤等及评价局部治疗效果准确性能与增强CT和核磁共振诊断结果相媲美。此外,超声微泡造影还可以对肝移植、肾移植、肿瘤治疗效果进行无创动态监测以及用于脑梗死患者血管再通与否的评价等。超声仪器比CT和核磁共振设备体积小、可移动,对于不能搬动的患者诊断与治疗更具优势。微泡外壳本身的理化性质或连接在微泡表面特异性配体能够实现靶向分子影像,故能非侵人性地评价炎症、缺血再灌注、肿瘤等模式的病灶分布和灌注情况,为治疗提供更为详尽的信息。

5.1 非特异性靶向超声影像诊断

5.1.1 肝脏超声影像诊断

所有的微泡造影剂都会在一定程度上为肝脏所摄取。微泡造影剂在血流缓慢时,机械滞留于血窦并为Kupffer细胞吞噬入胞内,而某些肝实质局灶性病变(恶性肿瘤组织)缺乏正常的吞噬功能或缺乏肝血窦,不能保留微泡造影剂,当循环中微泡经由补体调理作用清除以后,病灶的延迟显影就呈现出来。肝脏细胞吞噬现象可导致肝脏造影效果减低,在肝脏微泡靶向造影中,部分造影剂在未到达靶位时即被Kupper 细胞或巨噬细胞吞噬,但如在微泡的外壳中加入乙二醇磷脂, 可避免该类现象[24]。

5.1.2 炎症部位超声影像诊断

微泡可以在声学特性保持不变的情况下被激活的中性粒细胞和单核细胞黏附并吞噬, 因此可以用来发现炎症发生的部位。将磷脂酰丝氨酸结合于脂质微泡壳上可以增强补体的活化, 提高微泡与激活白细胞结合程度。微泡外壳上的白蛋白或脂质能够亲和活化的粒细胞和单核细胞,因此在感染或受损区域滞留,数分钟后,大多数微泡被吞噬,但仍然保持声学特性,故循环微泡清除以后可以探测到感染区的声学信号[25]。

5.2 特异性靶向超声影像诊断

5.2.1 血管再生超声影像诊断

早期超声影像诊断新生血管则能早期发现肿瘤及微小转移灶,有利于肿瘤患者的治疗,动态性监测新生血管则可以评估抗肿瘤治疗效果[26]。内皮细胞是血管的组成细胞,人们通过制备内皮细胞整合素靶向微泡,将标记Echistatin微泡用于评价外周动脉闭塞性疾病的血管重构情况,通过结扎髂外动脉建立了大鼠下肢缺血模型,并将其分为碱性成纤维细胞生长因子治疗组和非治疗组,利用携带Echistatin 的靶向微泡评价其血管重构效果。结果表明:无论是治疗组还是非治疗组,靶向分子成像都能在缺血下肢的血流恢复之前探测到分子信号,可成功用于评价治疗性或内源性血管新生。

5.2.2 血栓超声影像诊断

体外和体内研究发现带有寡肽的微泡可识别血小板GP Ⅱb /Ⅲa 受体活化连接位点,黏附于新鲜血栓表面,从而提高血管和心脏内血栓的超声检出率。血栓微泡靶向技术不仅对动静脉和心脏血栓诊断,具有临床价值,而且在溶栓治疗方面也具有应用价值,微泡表面结合能识别纤维素或血凝块成分的配体即可使携溶栓药物分子的微泡到达靶点,利用超声空化效应使微泡破裂释放出药物,发挥靶向溶栓作用[27]。

5.2.3 肿瘤超声影像诊断

为提高肿瘤超声信噪比、靶向结合能力及增加图像清晰度,人们制备一种能同时结合多种肿瘤细胞标记物的多靶向超声微泡,为提高靶向结合能力提供了新的思路。多靶点微泡分子探针用于靶向定位于血管内皮生长因子受体和整合蛋白α/β的双靶向超声微泡,在卵巢癌小鼠上进行超声分子显像,证明双靶点靶向超声微泡更多聚集在靶部位,达到更好的特异肿瘤显像效果。此外,超声微泡还可以用于肿瘤血管新生评价研究,人们通过静脉注入表面耦联单克隆抗体或Echistatin分子(一种可与表达在新生血管内皮细胞特定分子结合的解离素)的脂质体超声微泡, 然后通过活体显微镜发现, Echistatin 和单抗包被的脂质体微泡紧密黏附在微血管内皮上。在此基础上, 他们通过给大鼠皮下注射由肿瘤分泌的胶状物质,造模10d 后,注入靶向超声微泡造影剂,超声发现微泡量与新生血管数密切相关[28]。

6 超声微泡在靶向治疗中的应用

超声微泡不仅用于诊断,而且还可以用于体内治疗。超声微泡体内靶向治疗首先要制备承载药物分子或治疗基因的靶向微泡,其次是进入人体集聚在病变组织细胞上,最后是通过加大超声强度,破坏微泡释放药物直接杀伤病变细胞或导入治疗基因。

6.1 超声靶向治疗微泡的制备

制备超声靶向治疗微泡,主要是让微泡能结合上药物同时不影像微泡的声学效果。微泡载药或基因的方法主要包括以下几种方式:(1)药物嵌入微泡外壳膜内;(2)共价结合在微泡表面;(3)疏水药物可混合在脂质体微泡的油脂层内;(4)将药物或基因包裹在微泡内,这样不影像微泡表面结合靶向分子。

6.2 超声微泡靶向治疗的机理

超声微泡靶向治疗利用微泡在超声介导下的空化效应、对特定病变组织和细胞靶向传输基因或药物,实现治疗疾病的目的。空化效应是指液体中存在微小气泡(空化核)在超声场负压相半周期迅速膨胀,在正压相半周期又急剧收缩,从而造成微泡内爆。空化核在由急剧收缩到崩溃爆裂过程中,吸收大量声能,并能集中释放在极小区域。微泡核内产生局部高温高压对肿瘤细胞具有杀伤作用,同时通过微泡选择性识别、结合靶细胞、靶组织或病变组织,释放药物杀伤肿瘤或病变细胞[29]。

6.3 超声微泡靶向治疗的应用

超声微泡靶向治疗主要用于肿瘤等疾病治疗,方式包括药物治疗、基因治疗和细胞因子治疗。超声微泡作为药物、细胞因子或基因的载体将其送入待治疗部位,超声破坏微泡促药物或基因释放(UTMD),发挥直接的治疗作用。对正常组织有毒副作用,很多药物在体内被稀释,病变部位的药物浓度偏低无法发挥有效作用。微泡靶向治疗可有效延长药物在体内的半衰期,在特定部位达到很高的浓度,成为国内外研究的热线。药物传输微泡可以以多种方式携带药物。当微泡复合物在“感兴趣区”特异性聚集时,增强声压使微泡破裂,这种效应可在药物的运输中加强药效并能在特定的靶器官产生药效,减少副作用的产生。研究发现,溶栓剂组织型纤溶酶原激活物(Tissue-type plasminogen activator,tPA)和超声微泡的联合应用可显著增强溶栓效果,溶栓治疗已成为超声微泡药物运载研究的热点[30,31]。超声微泡用于基因治疗已有很多文献报道。利用兔大血管阻断和缺血模型,证明了用超声给压微泡爆和Prison转染裸露肝细胞生长因子基因(Hepatocyte growth factor,HGF)以促进血管生成,超声辐射使HGF转染成功5d后,血管造影发现毛细血管的数量明显增加[32]。人们还研究了通过诊断超声加微泡造影剂对实验兔肝脏VX2肿瘤的治疗作用,在电镜下可见肿瘤新生毛细血管明显超微结构受到破坏[33]。

摘要：超声微泡是一种超声造影剂,利用超声微泡声学特征和靶向功能可提高超声分子诊断的灵敏性和特异性,利用其药物载体和释放功能可进行靶向药物治疗。现对超声微泡及其在分子影像诊断和靶向治疗中的应用进展作一综述。

超声靶向微泡破裂 篇4

1 材料与方法

1.1 实验材料

昆明小鼠10只,体质量为25～30g,雄性,南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:scxk(粤)2006-0015;二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC,美国Sigma公司)、聚乙二醇(PEG,德国Applichem公司)、生物化脂质(DSPE-PEG2000-biotin,美国Avanti公司)、链亲和素(Streptavidin,美国Sigma公司)、抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体(美国RD公司)、EnVision免疫组织化学显色系统(丹麦Dako公司)、Sequoia 512超声心动图仪(德国Siemens公司)。

1.2 制备超声微泡

参照文献[4],以上述脂质材料为原料制备普通脂质微泡和生物素化脂质微泡。生物素化微泡按一定比例加入链亲和素后再分别加入抗小鼠IL-2Rα单抗和同型对照抗体,制备出靶向超声微泡(MBIL-2Rα)和同型对照微泡(MB)。

1.3 体外评价超声微泡

构建出MBIL-2Rα和MB后,以库尔特计数仪测定微泡的浓度(%)及平均粒径(μm);采用绿色荧光标记的二抗与MBIL-2Rα相结合,荧光显微镜下观察抗IL-2Rα单抗与微泡连接情况。

1.4 建立肾IRI模型

对所有小鼠采用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉;将小鼠俯卧位,固定四肢于鼠板上;尾静脉插留置针用于注射微泡。备皮后在脊柱左侧0.5cm处行2.0cm左右纵形切口,游离左肾;用无损伤动脉夹夹闭肾蒂,造成左肾缺血;50min后释放动脉夹,逐层缝合切口。

1.5 肾对比超声检查

再灌注24h后,对实验小鼠行对比超声检查(CEU),并根据注射超声微泡的不同分为靶向超声微泡组(MBIL-2Rα)和对照超声微泡组(MB)。实验小鼠取俯卧位,用支架固定Sequoia512超声机(德国Siemens公司)的高频超声探头(17L5)于小鼠肾上方,调整探头位置获得良好肾显像;实验中探头位置和仪器参数保持不变。CEU检查均采用相干脉冲序列成像技术(coherent pulse sequence,CPS)实时观察,探头发射频率为7.0MHz,机械指数为0.2。每只小鼠采用微量进样器经尾静脉随机先后注射(间隔30min)MB和MBIL-2Rα的数量约为1×108个。注入微泡5min后行CEU检查,获取第1帧图像,后继续存储图像23帧后给予高机械指数(mechenical index,MI)的连续超声发射2～3s以破坏微泡,继续存储本底图像2～3帧,全部声学造影图像存于CD盘,以备脱机分析。微泡破坏前存储图像的平均声强度(Video Intensity,VI)可代表靶向微泡在组织中的总浓度,包括黏附和循环微泡。微泡破坏后存储图像上的平均VI反应的是在血池中循环微泡的浓度。前者减去后者得到的是黏附微泡在组织中的浓度。取图结束后,应用CEU图像分析软件(美国Virginia大学)对图像进行分析,测量小鼠肾造影VI值,单位为灰阶强度(U);并用彩色编码技术制作肾显影的彩色编码图像,红色、橙色和白色依次代表肾显影的强度由弱到强。

1.6 肾病理学检查

CEU图像采集后取出小鼠肾,以4%甲醛固定。常规脱水,石蜡包埋制片。切片作苏木精-伊红(HE)染色和免疫免疫组织化学EnVision法染色。

1.7 统计学分析

使用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析,组间比较采用二阶段交叉设计方差分析,组内比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声微泡体外评价

库尔特计数仪测得MBIL-2Rα浓度为(0.68±0.32)%×109个/ml,微泡平均粒径为2.70±0.24μm;MB浓度为(0.71±0.39)%×109个/ml,微泡平均粒径为2.87±0.24μm。与荧光二抗结合后的MBIL-2Rα在荧光显微镜下可见外壳显明显绿色荧光(图1A);MBIL-2Rα在普通光学显微镜可见微泡大小均一、中心透亮、外壳光滑完整(图1B)。

2.2 肾CEU彩色编码

第1帧CEU图像显示MBIL-2Rα组在左侧肾可见显著的超声显影增强(图2A)。而MB组左侧肾仅见轻度的超声显影增强,其显影强度较前者明显减弱(图2C);第1帧CEU图像显示MBIL-2Rα及MB在右侧肾均无明显的超声显影(图2B、D)。

2.3 肾对比超声VI分析

VI值在MBIL-2Rα组和MB组右侧肾均未见明显增大,分别为3.8±1.5U和3.7±1.7U,两者之间差异无统计学意义(P>0.05);而在左侧肾MBIL-2Rα组为21.6±4.8U较MB组9.7±2.9U明显增大,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05)。MBIL-2Rα组左侧肾VI值为右侧肾的6.8±3.4倍,P<0.05,而MB组左侧肾VI值仅为右侧肾的3.1±1.9倍,P<0.05(图3)。

2.4 病理及免疫组织化学结果

HE切片显示右侧非缺血肾组织中肾小管排列整齐,形态正常,间质无充血、水肿(图4);左侧缺血再灌注肾组织中可见肾小管上皮细胞肿胀、变性,内可见管型和坏死脱落细胞,伴肾间质水肿及淋巴细胞增多(图5)。免疫组织化学检查显示右侧非缺血肾组织未见明显淋巴细胞浸润,未见明显IL-2Rα表达(图6);左侧缺血再灌注肾组织淋巴细胞增多,淋巴细胞表面可见IL-2Rα表达(棕黄色阳性反应物,箭头示,图7)。

3 讨论

肾缺血再灌注损伤(IRI)是肾移植过程中不可避免的损伤过程,也是引起急性肾功能衰竭的重要因素之一。近年,在靶向超声造影领域,肾IRI的相关炎性反应也成为研究热点,但通常只是作为一种普通的炎性反应来进行研究,且多数是以血管内皮细胞上的靶分子为靶点进行血管内成像[1]。但事实上有学者发现,免疫因素在肾IRI过程中可能发挥重要作用。一般来说,T淋巴细胞经典的活化途径是抗原依赖性活化,但是在肾IRI中没有“外来”抗原的刺激,肾IRI后仍有T淋巴细胞的激活、相应炎性分子及分子受体等的上调[2,3]。根据这一理论,本实验直接构建肾IRI模型,模拟肾移植过程中的免疫炎性反应,不仅减少了小动物肾移植模型构建的繁琐过程,同时也降低了抗体等的用量。同时,因为IL-2在移植排斥反应中发挥着重要作用[5],而以其受体作为靶点,能够从侧面反应IL-2表达量的多少,从而对移植排斥反应做出评价。因此,不同以往,南方医院超声科尝试利用T淋巴细胞表面的IL-2Rα为靶点,对肾IRI的炎性反应进行评价。

肾IRI的对比超声造影结果显示:MBIL-2Rα组左肾产生显著的“主动性靶向超声分子显影”[6],且显影强度同右肾及MB组相比显著增强。研究还显示,MB组左肾VI值也有一定程度升高,提示在此区域也有一定程度的微泡滞留。其可能机制是在IRI过程中,脂质微泡可通过血清补体介导的调节作用与激活的白细胞结合并黏附于组织的小静脉内皮细胞上;而且激活的单核-巨噬细胞和中性粒细胞可通过表面的巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1)或补体受体的介导对脂质微泡产生“非免疫球蛋白依赖的吞噬作用”,从而在行对比超声显影检查时可产生一定程度的“被动性靶向对比超声显影”[7]。

应该提出的是,由于本实验所选择的靶点与以往不同,位于淋巴细胞表面,MBIL-2Rα在靶向黏附的过程中所伴随的是淋巴细胞不断地滚动甚至向间质组织的移行、迁出,因此,我们所应用的MBIL-2Rα的剂量同以往相比有所增高,试图提高MBIL-2Rα的靶向黏附概率。尽管我们对MBIL-2Rα组被动显影和主动显影没有做进一步的区分,但同MB组相比,MBIL-2Rα组的显影强度明显增强,病理改变明显,也提示检测敏感度更强。

总之,本实验结果主要提供了一种可能性,即是以淋巴细胞表面分子为靶点进行超声显影同样能够实现,同时也为进一步对肾移植排斥免疫反应进行评价提供了理论基础。

摘要：目的 探讨携带抗白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)单抗靶向超声微泡和对比超声结合评价肾缺血再灌注损伤(IRI)的可行性。材料与方法 采用“亲和素-生物素”桥接法构建携抗IL-2Rα靶向超声微泡(MBIL-2Rα)和携同型抗体对照微泡(MB)。10只左肾缺血50min的小鼠,再灌注24h后,随机先后注入MBIL-2Rα和MB(间隔30min),分别于注入5min后行对比超声检查,并测量肾的声强度(VI)。结果 对比超声图像显示MBIL-2Rα组左肾造影显著增强,VI值高达21.6±4.8U,而在MB组左肾仅见轻度造影增强,VI值为9.7±2.9U,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。但无论是MBIL-2Rα组还是MB组左肾VI值均明显高于右侧肾脏VI值(3.8±1.5U,3.7±1.7U,P<0.05)。两组右侧肾脏之间VI值未见明显差异。结论 MBIL-2Rα和对比超声相结合能够有效评价肾IRI,从而对肾移植后的排斥反应提供有价值的信息。

关键词：超声造影,靶向超声微泡,再灌注损伤,白细胞介素2受体α亚单位

参考文献

[1]陈少敏,杨莉,宾建平,等.携带抗P-选择素单抗靶向微泡行对比超声评价肾缺血再灌注损伤的实验研究.中国医学影像技术,2008,24(7):985-987.

[2]salahudeen AK,Haider N,May W.Cold ischemia and the reduced long term survival of cadaveric renal allografts. Kidney Int,2004,65(2):713-718.

[3]Melissa J,Burne-Taney,Naoko Yokata,et al.Persistent renal and extrarenal immune changes after severe ischemic injury. Kidney Int,2005,67(3):1002-1009.

[4]郑道文,杨莉,宾建平,等.亲和素桥连构建携抗P-选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定.中国医学影像技术,2008,24(8):1182-1185.

[5]杨振林,秦玉峰.IL-2受体α单克隆抗体的研究进展. 国外医学·移植与血液净化分册,2004,2(3):11-13.

[6]纪丽景,杨莉,吴爵非,等.P-选择素靶向超声微泡与普 通超声微泡黏附途径和效能的对比研究.临床超声医学杂志,2009,11(5):289-292.