化学类论文提纲

论文题目：肥胖与甲状腺乳头状癌临床关系探讨和脂联素化学类似物作用机制研究

摘要：研究目的:1.明确肥胖与甲状腺乳头状癌侵袭性病理特征之间的关系;2.应用肥胖因子抗体芯片,筛选参与肥胖与甲状腺乳头状癌进展中的潜在因子;3.利用脂肪干细胞,体外实验验证重组脂联素对甲状腺乳头状癌的治疗作用;4.探索脂联素类似物AdipoRon在甲状腺癌细胞中的治疗作用及分子机制。研究方法:1.回顾性分析单中心13,995例甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer,PTC）病人的临床资料,根据世界卫生组织体重指数标准（WHO-BMI）和中国人体重指数分类（CN-BMI）,对不同模型中肥胖与超声特征和侵袭性临床病理特征之间的关系进行数据分层。用二元Logistic回归模型计算恶性超声特征与侵袭性临床病理征象的优势比（OR）。2.我们在前文回顾性研究中发现,女性肥胖影响甲状腺结节TIRADS分级,进而干扰超声评估,这可能推迟甲状腺结节诊治时间,被动促进甲状腺癌进展,为此我们进一步进行前瞻性研究,采集1,830例PTC病人体脂参数,包括全身体脂参数（身高、体重、BMI、BSA、体脂率）和局部体脂参数（颈围、颈长、颈围/颈长比、腰围、臀围、大腿围、腰身比、腰臀比、皮褶厚度（肱二头肌、肱三头肌、肩胛部、髂腰部））。应用二元逻辑回归分析不同体脂参数对甲癌侵袭性病理特征的预测意义,并明确肥胖是否干扰甲状腺结节超声评估。3.通过临床回顾性和前瞻性研究明确肥胖与PTC进展的临床关联。因此,我们应用肥胖因子抗体芯片,收集体重正常和肥胖PTC病人血清和颈部脂肪组织80例,从目前已知的300余种肥胖因子中挑选出可能参与PTC进展过程中的40个肥胖因子,使用肥胖因子抗体芯片筛选潜在目标因子,即脂联素（adiponectin,AdipoQ）。4.应用ELISA检测PTC病人血清AdipoQ水平,验证肥胖因子抗体芯片结果。提取颈部脂肪组织脂肪干细胞,构建脂肪干细胞重组AdipoQ稳定细胞系,使用人源重组AdipoQ处理甲状腺癌细胞,体外实验验证人源重组AdipoQ在甲状腺癌细胞中的治疗作用,包括细胞增殖和迁移能力。5.前述研究证实AdipoQ是抑制甲状腺癌进展的重要肥胖因子,但由于受AdipoQ分子结构影响,临床转化技术难度大、经济成本高,因此我们找到一种新型AdipoQ类似物--AdipoRon,作为本课题的研究对象。首先应用q-PCR和免疫荧光法确定甲状腺癌细胞表面存在脂联素受体,进一步进行细胞功能学验证,包括增殖能力（CCK-8、平板克隆形成和Ed U实验）、迁移能力（划痕和Transwell实验）、能量代谢水平（糖代谢和氨基酸代谢关键分子）、细胞分化水平和凋亡（线粒体膜电位检测、凋亡蛋白caspase 3/7和AnnexinV荧光探针）。6.应用RNA转录组测序,筛选出AdipoRon处理后甲状腺癌细胞差异基因,通过生信分析筛选出可能参与抑制肿瘤生长的信号通路（即自噬）。首先,应用Western-blot和免疫荧光检测AdipoRon处理后甲状腺癌细胞K-1和KTC-1内LC3B的变化。mcherry-GFP-LC3B双标荧光报告基因检测自噬溶酶体变化。为进一步明确AdipoRon是否诱导甲状腺癌细胞自噬,分别使用自噬抑制剂羟氯喹和3-MA联合AdipoRon处理K-1和KTC-1,采用Western-blot检测LC3B蛋白水平的变化。7.为了进一步明确AdipoRon诱导甲状腺癌细胞自噬的具体分子机制,采用Western-blot检测自噬相关蛋白,包括mTOR、p-mTOR Ser2448、p70S6K、p-p70S6K Thr389、ULK1、p-ULK1 Ser555、BECN1、ATG3、ATG5、ATG7、ATG12以及ATG16L1。8.转染小干扰RNA-ULK1敲低ULK1,再次应用AdipoRon处理甲状腺癌细胞,Western-blot和mcherry-GFP-LC3B双标荧光报告基因检测自噬关键蛋白LC3B的表达水平和自噬溶酶体的改变。8.为了明确AdipoRon是否通过激活脂联素受体发挥作用,应用小干扰RNA siRNA-AdipoR1和siRNA-AdipoR2敲低脂联素受体1和脂联素受体2,DMSO和AdipoRon处理两组细胞,利用Western-blot和mcherry-GFP-LC3B双标荧光报告基因检测自噬关键蛋白LC3B的表达水平和自噬溶酶体的改变。研究结果:1.回顾性研究--体重指数对13,995例甲状腺乳头状癌临床病理及超声特征的影响（1）男性的BMI、肥胖比例、超声恶性特征和侵袭性病理特征显著高于女性。（2）肥胖与超声恶性特征和侵袭性病理特征之间存在性别差异。（3）肥胖增加了肿瘤大小(OR男性=1.539,OR女性=1.521)和多灶性(OR男性=1.659,OR女性=1.449)的风险。但肥胖并不会增加男性外侵或高T分期的风险。（4）校正排除混杂因素后,肥胖女性对超声恶性评估起“干扰作用”,而在男性中不起作用;2.前瞻性研究--颈围/颈长比作为甲状腺乳头状癌外侵风险预测的新型体脂参数（1）颈围/颈长比值是甲状腺乳头状癌外侵的独立风险因素;（2）颈围/颈长比值在BMI正常组中,仍能有效提示外侵风险;（3）颈围以及颈围/颈长比值不干扰甲状腺结节超声评估;（4）颈围/颈长比是预测全身性肥胖（BMI）、中心性肥胖（腰身比）、颈部局部肥胖（颈围）的良好体脂参数。3.甲状腺乳头状癌病人颈部脂肪组织和血清肥胖因子抗体芯片筛选（1）血清肥胖因子抗体芯片结果存在性别差异。与体重正常组相比,男性PTC肥胖病人血清中仅存在胰岛素样生长因子结合蛋-1（IGFBP-1）下调;女性中AdipoQ、降脂蛋白和视黄醇结合蛋-4、IGFBP-1、胰岛素样生长因子结合蛋-2（IGFBP2）、白细胞介素-12p70、白细胞介素-12p40、白细胞介素-1rα下调。（2）在颈部脂肪组织抗体芯片结果中,男性中骨保护素、IGFBP-2、巨噬细胞刺激蛋白、刺鼠相关蛋白、干扰素γ、胃蛋白酶原II、T细胞特异性蛋白和血小板反应蛋白发生下调;但在女性中纤溶酶原激活物抑制剂、抵抗素、血管内皮生长因子、脂质运载蛋白和血清淀粉样蛋白A-1蛋白发生上调,仅IL-10出现下调。4.脂肪干细胞重组AdipoQ对甲状腺癌细胞的治疗作用（1）ELISA实验验证肥胖PTC病人血清AdipoQ水平低于体重正常组;（2）血清AdipoQ水平与PTC肿瘤最大径＞1cm、外侵以及淋巴结转移风险呈负相关;（3）体外实验证实脂肪干细胞重组AdipoQ抑制甲状腺癌细胞增殖和迁移能力。5.脂联素类似物AdipoRon在甲状腺癌细胞中的治疗作用及分子机制（1）以分化型甲状腺癌细胞系为研究对象,q PCR显示分化型甲状腺癌细胞系存在AdipoR1和AdipoR2,免疫荧光实验表明两个受体是位于甲状腺癌细胞表面的膜受体。（2）以甲状腺癌细胞系K-1和KTC-1为研究对象,CCK-8、平板克隆形成实验和Ed U实验显示AdipoRon抑制甲状腺癌细胞增殖能力,并呈浓度依赖性。划痕实验和Tranwell实验显示AdipoRon抑制甲状腺癌细胞迁移能力。（3）q-PCR和Western-blot检测AdipoRon处理后氨基酸代谢关键分子（GLS、SLC1A5和SLC7A5）和糖代谢关键分子（GLUT-1、PKM2和LDHA）下调。WST-8法检测细胞内6-磷酸葡萄糖和NADH明显下降。通过q PCR检测发现AdipoRon处理后,K-1和KTC-1内甲状腺球蛋白（Tg）和过氧化物酶（TPO）RNA水平上调。AdipoRon处理后细胞线粒体膜电位下降、凋亡相关蛋白Caspase-3/7和AnnexinV上调。（4）转录组测序发现AdipoRon处理后,甲状腺癌细胞自噬相关基因差异表达,Western-blot检测AdipoRon处理后自噬通路关键蛋白--LC3B II/I比值明显升高,并呈时间和浓度依赖性。免疫荧光检测和mcherry-GFP-LC3B双标荧光报告基因显示AdipoRon处理后LC3B II/I上调、自噬溶酶体增多。（5）Western-blot检测自噬通路关键蛋白及其磷酸化位点,结果显示,AdipoRon抑制p-mTOR Ser2448和p-p70S6K Thr389,同时激活ULK1及p-ULK1 Ser555。（6）当敲低ULK1后,其上游p-p70S6K Thr389并未受影响,但LC3BII/I比值不再升高,自噬溶酶体也不再增多。（6）将两个脂联素受体进行敲低,并行q-PCR和Western-blot验证。结果显示,当将AdipoR2敲低后,AdipoRon处理后的甲状腺癌细胞ULK1和LC3B不再升高,自噬溶酶体也不再增多。（7）此外,我们发现当ULK1敲低后,线粒体膜电位也不再改变,凋亡相关蛋白caspase3/7也不再升高。进一步将AdipoR2受体敲低后,线粒体膜电位和凋亡相关蛋白caspase3/7不再升高。这说明AdipoRon可能通过诱导甲状腺癌细胞自噬促进细胞凋亡。研究结论:1.肥胖是甲状腺乳头状癌（PTC）高侵袭性病理特征的独立风险因素。2.颈围/颈长比可作为PTC外侵风险预测的新型体脂参数。颈部粗短（颈围/颈长比值升高）不会影响甲状腺结节超声评估。3.利用肥胖因子抗体芯片筛选出血清AdipoQ在女性肥胖PTC中明显下降。4.血清AdipoQ水平与肿瘤最大径＞1cm、外侵和淋巴结转移负相关。体外实验证实,脂肪干细胞重组AdipoQ抑制甲状腺癌细胞增殖和迁移能力。5.作为AdipoQ化学类似物,AdipoRon能够抑制甲状腺癌细胞增殖和迁移能力,抑制肿瘤细胞能量代谢水平,诱导细胞自噬和凋亡。6.AdipoRon通过激活AdipoR2/ULK1诱导甲状腺癌细胞自噬。

关键词：肥胖;甲状腺乳头状癌;脂联素;脂联素化学类似物;自噬;肥胖因子抗体芯片;颈围/颈长比

学科专业：外科学

中文摘要

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缩略语/符号说明

第一章 绪论

1.1 概述

1.1.1 研究背景及意义

1.1.2 研究思路

1.2 研究设计及技术路线

1.2.1 研究设计

1.2.2 技术路线

1.3 综述:肥胖与甲状腺癌:证据、机制和未来方向

1.3.1 前言

1.3.2 肥胖与甲状腺癌的发生

1.3.3 肥胖与甲状腺癌的发展

1.3.4 肥胖与甲状腺癌的预后

1.3.5 肥胖与甲状腺癌的潜在作用机制

1.3.6 未来方向

综述参考文献

第二章 肥胖与甲状腺乳头状癌临床关系探讨

2.1 体重指数对13,995 例甲状腺乳头状癌临床病理特征及超声特征的影响

2.1.1 介绍

2.1.2 材料与方法

2.1.3 结果

2.1.4 讨论

2.1.5 小结

2.2 颈围/颈长比作为甲状腺乳头状癌外侵风险预测的新型体脂参数

2.2.1 介绍

2.2.2 材料与方法

2.2.3 结果

2.2.4 讨论

2.2.5 小结

第三章 肥胖因子筛选及功能验证

3.1 甲状腺乳头状癌颈部脂肪组织和血清中肥胖因子筛选

3.1.1 介绍

3.1.2 材料与方法

3.1.3 结果

3.1.4 讨论

3.1.5 小结

3.2 脂肪干细胞重组脂联素对甲状腺癌细胞的治疗作用

3.2.1 介绍

3.2.2 材料与方法

3.2.3 结果

3.2.4 讨论

3.2.5 小结

第四章 脂联素类似物AdipoRon在甲状腺癌细胞中的治疗作用及分子机制

4.1 介绍

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验试剂

4.2.3 实验方法

4.3 结果

4.3.1 甲状腺癌细胞表面存在脂联素受体1和受体2

4.3.2 AdipoRon抑制甲状腺癌细胞增殖能力

4.3.3 AdipoRon抑制甲状腺癌细胞迁移能力

4.3.4 AdipoRon抑制甲状腺癌细胞能量代谢水平

4.3.5 AdipoRon促进甲状腺癌细胞向正常细胞分化

4.3.6 AdipoRon促进甲状腺癌细胞凋亡

4.3.7 AdipoRon处理甲状腺癌细胞转录组测序

4.3.8 AdipoRon诱导甲状腺癌细胞自噬

4.3.9 自噬抑制剂HCQ和3-MA验证AdipoRon诱导甲状腺癌细胞自噬

4.3.10 AdipoRon激活ULK1 诱导甲状腺癌细胞自噬

4.3.11 敲低ULK1 抑制AdipoRon诱导甲状腺癌细胞自噬

4.3.12 敲低脂联素受体2(Adipo R2)抑制AdipoRon激活ULK1

4.3.13 自噬与凋亡之间可能存在内部联系

4.4 讨论

4.5 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

致谢